Name: Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Découvrez la culture d'entéroïdes à partir d'intestin de souris néonatale pour étudier les effets du lait maternel sur la prolifération intestinale. Cette méthode ex vivo permet d'analyser les maladies gastro-intestinales comme l'entérocolite nécrosante chez les prématurés.

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MG est pris en charge par des subventions K08DK101608 et R03DK111473 de l’hôpital le National Institutes of Health, mars des Dimes Foundation Grant No 5-FY17-79, l’HME Discovery Institute de Washington University et Saint-Louis pour l’enfance et le service des Pédiatrie à la Washington University School of Medicine, Saint-Louis. CJL est pris en charge par R01DK104946 (PI : Silverman), hôpital Discovery Institute de Washington University des enfants et Saint-Louis pour l’enfance.

Toutes les procédures animaux dans cette étude ont été approuvées par soit l’Université de Washington à animalier institutionnels St.Louis et Comité de l’urbanisme (protocole 20160187) ou animalier institutionnel d’Université de Pittsburgh et Comité de l’urbanisme (protocole 14103918). Humain intestin fœtal à moins de 24 semaines de grossesse a été obtenue conformément aux directives marchés publics tissus anatomiques Université de Pittsburgh après approbation Institutional Review Board (protocole PRO14100537) de l’Université de Pittsburgh santé Sciences Banque de tissus grâce à un système intermédiaire honnête. Le lait maternel humain dépersonnalisées ou du lait maternel pasteurisé donneur a été obtenu avec une dispense de consentement de l’Université de Pittsburgh Institutional Review Board.
1. crypte isolement et mise en place d’Enteroids de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré
<ol><li>Préparation des médias NOTE : Media doit être préparés dans la hotte la veille de l’isolement de la crypte.<ol>
<li>Préparer des milieux de Culture L 1,11. Commencer avec 1 L support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et de la L-glutamine et ajouter 110 mL sérum fœtal (SVF) (concentration finale 10 %), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL insuline stérile (final concentration de 0,1 %).</li>
		<li>Préparer 500 mL d’un mélange PBS-antibiotique. Commencer avec 500 mL 1 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) avec 10 % FBS et ajouter 5 mL de gentamicine (concentration finale 1 %), 1 mL amphotéricine B (concentration finale 0,2 %) et 5 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %).</li>
		<li>Préparer des milieux de désorganisation cellulaire 30 mL #1. Tout d’abord préparer 30 mL de milieu de Culture. Ajouter 600 µL 0,5 M d’acide tétraacétique (EDTA) (concentration finale 10 mM), 300 µL gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %).</li>
		<li>Préparer des milieux de désorganisation cellulaire 30 mL #2. Tout d’abord préparer 30 mL de milieu de Culture. Ajouter 300 µL 0,5 M EDTA (concentration finale 5 mM), 300 µL gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %).</li>
		<li>Préparer 50 mL de milieu de Culture crypte sans facteurs de croissance. Mesurer 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 et ajouter 10 mL FBS (concentration finale 20 %).<ol>
<li>Ajouter 500 µL pénicilline-streptomycine (concentration finale 1 %), 500 µL L-glutamine (concentration finale 1 %), 500 µL gentamicine (concentration finale 1 %), 100 µL amphotéricine B (concentration finale 0,2 %), 2,5 µL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane acide sulfonique (HEPES) (concentration finale de 0,05 mM), 500 µL 100 mM N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 500 µL 100 x N-2 Supplément, 1 mL 50 x sans sérum supplément (par exemple, B-27) moins de vitamine A et 500 µL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer 1 mL de milieu de Culture crypte présentant des facteurs de croissance. Tout d’abord préparer 1 mL de crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance. Ajouter 2,5 µL 40 µg/mL Wnt3a (concentration finale 100 ng/mL), 1 µL 100 µg/mL caboche (concentration finale 100 ng/mL), 2 µL 250 µg/mL R-Spondin (concentration finale 500 ng/mL) et 0,5 µL 100 µg/mL EGF (concentration finale 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolement de la crypte
	<ol>
<li>Place solubilisée extrait de la membrane basale (voir Table des matières) sur la glace pour décongeler avant de commencer. NOTE : Membrane basale donjon sur glace ou il va polymériser.</li>
		<li>Respectant un protocole institutionnel animalier et Comité d’urbanisme pour souris supérieures à 14 jours d’âge, euthanasier souris avec deux méthodes d’euthanasie avec le second constituant une mesure physique pour s’assurer de la mort. Remarque : Pour les souris sous 14 jours d’âge, la décapitation est la procédure standard à l’aide de ciseaux.</li>
		<li>À l’aide de ciseaux et pinces, pratiquer une incision verticale vers le bas de la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, pour toute la longueur de l’abdomen. L’accise de l’intestin grêle de l’estomac pour le caecum avec des ciseaux et enlever le mésentère avec une pince. Remarque : Deux semaines mâles et femelles C57BL/6J souriceaux, chacun pesant 5,5-7 g, ont été utilisés pour l’isolement de la crypte. N’importe quel âge ou taille de la souris peut être utilisée pour l’isolement de la crypte.</li>
		<li>Pour préparer l’intestin grêle fraîchement récolté pour l’isolement de la crypte, intestin position droite et couper l’intestin longitudinalement sur toute sa longueur à l’aide de ciseaux. Remarque : La souris et l’intestin humain peuvent être préparés de la même façon.</li>
		<li>Propres selles dans l’intestin en le secouant doucement l’intestin en arrière dans un récipient Petri de PBS-antibiotique mélange avec une pincette.</li>
		<li>Ajouter 30 mL de perturbation des cellules Media #1 pour un tube conique de 50 mL. Couper l’intestin en morceaux de longueur 0,5 cm directement dans le tube. Mettre le tube dans un seau à glace et agiter délicatement sur l’agitateur à la vitesse la plus basse pendant 15 min.</li>
		<li>Alors que les tissus sont sur le shaker, procurer des plaques de 24 ou 48 puits pour cultiver des cryptes si les enteroids sont à utiliser pour les ARN, ADN ou isolement de protéine. Utilisation 8 puits chambre diapositives à cultiver des cryptes si les enteroids doivent être utilisés pour tout Mont imagerie confocale.</li>
		<li>Dans la hotte, ajouter 15 µL de membrane basale au fond de chaque puits de la plaque de 24 ou 48 puits. Si vous utilisez des diapositives de la chambre, ajouter 9 µL de membrane basale dans le fond de chaque chambre. Remarque : Régler le volume de la membrane basale selon la taille de la plaque si nécessaire.</li>
		<li>La membrane basale avec l’embout de la pipette se propager rapidement afin que la membrane basale forme une couche mince sur le fond du puits. Placer la plaque à 37 ° C dans l’incubateur pendant 30 min permettre à la membrane basale à polymériser. Remarque : Les cryptes ne s’attachera pas si la membrane basale n’est pas une mince couche ou si la membrane basale contient des bulles d’air.</li>
		<li>Après 15 min sur un agitateur, filtrer le tissu à travers un tamis de 100 µm. Jeter le débit à travers.</li>
		<li>Ajouter 30 mL de cellule perturbation Media #2 dans un nouveau tube conique de 50 mL. Retirer les tissus de crépine et ajouter dans le tube.</li>
		<li>Mettre le tube dans un seau à glace et agiter délicatement sur l’agitateur à la vitesse la plus basse pendant 15 min.</li>
		<li>Après 15 min sur le shaker, filtrer des tissus à travers un tamis de 100 µm. Maintenir les flux grâce à cette étape, au cas où les rendements sont faibles dans les étapes ultérieures. NOTE : Tous les flux à travers des tubes doit être conservé sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 15 mL DMEM avec 4,5 g/L de glucose et de la L-glutamine dans un nouveau tube conique de 50 mL. Retirer les tissus de crépine et ajouter dans le tube. Vigoureusement agiter le tube à la main pendant 10 s. filtre à travers un tamis de 100 µm et de recueillir les traversent. Répétez jusqu'à ce que traversent ne contient aucuns particules.</li>
		<li>Dans la hotte, filtrer le flux par le biais de l’étape précédente dans un nouveau tube conique de 50 mL à l’aide de 70 µm crépines pour tissus de souris ou 100 µm crépines pour les tissus humains. NOTE : Ont des filtres supplémentaires en attente et versez lentement comme crépines seront obturé par des débris.</li>
		<li>Centrifuger le tube à 200 x g pendant 8 min à 4 ° C et déposez directement dans un seau à glace dans la hotte. Retirez le surnageant par pipette sans déranger le culot. Resuspendre le culot avec le montant souhaité de la crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance. Remarque : Les cryptes enrichis sont la couche « sable » de la pastille. Chacun requiert bien 250 µL de crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.</li>
	</ol></li>
	<li>Mise en place d’enteroids
	<ol>
<li>Plaque de mélange médias crypte directement sur la membrane basale.</li>
		<li>Vérifier les cryptes avec un microscope pour s’assurer que le processus d’isolement a été un succès. Remarque : Les cellules et les boules de cellules sont souhaitées. Environ 100 des cryptes sont plaqués par puits.</li>
		<li>Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 h permettre des cryptes d’adhérer à la membrane basale. Remarque : Cette incubation est avec crypte les milieux de Culture sans facteurs de croissance.</li>
		<li>Retirez lentement les médias et les cryptes excès, impossible d’attacher à l’aide d’une pipette de P-200. Remarque : Ne pas déranger la membrane basale comme les cryptes ci-joint peuvent se déplacer.</li>
		<li>Ajouter lentement 250 µL de crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance à chaque puits. Remarque : Pour 24, 48 plats ou chambre glisse, 250 µL de crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance est suffisante.</li>
		<li>Remplacer les médias tous les 2 jours avec frais crypte les milieux de Culture avec des facteurs de croissance pendant 5 jours avant les traitements permettant la croissance et une fixation optimale.</li>
	</ol></li>
</ol>2. souris Breast Milk Collection
<ol><li>Séparer un barrage qui allaitent C57BL/6J au post-partum 7-12 jours de ses chiots durant 6 h avant la traite.</li>
	<li>Anesthésier le barrage de lactation avec isoflurane via un cône de nez et d’administrer une injection sous-cutanée d’ocytocine à 0,15 UI/kg de poids corporel. Attendre 3 minutes avant d’effectuer la procédure de traite.</li>
	<li>Nettoyer les trayons avec éthanol à 70 % avant la procédure de traite et laissez sécher.</li>
	<li>Extraire le lait de tétines un à la fois en utilisant une pompe électrique maternel avec tube silicone dimensionnée en fonction des tétines de souris dans un tube de prélèvement de 5 mL. Remarque : Tire-lait optimale possèdent deux paramètres, un pour la vitesse et un pour l’aspiration. Il est préférable de commencer avec les plus petits paramètres de chacun et les deux augmente lentement jusqu'à ce que le lait est extrait. Idéalement, le rendement total sera ~ 500 µL - 1 mL de lait maternel de la souris par barrage de lactation.</li>
	<li>Le lait maternel immédiatement aliquote et conserver à-80 ° C. Remarque : Évitez de gel/dégel cycles.</li>
	<li>Traiter les enteroids le jour 5 avec 50 µL/mL de lait maternel souris / mL de milieu de Culture de crypte présentant des facteurs de croissance pendant 24 h à 37 ° C.</li>
</ol>3. ensemble de monter la coloration des Enteroids
<ol><li>
Préparation des réactifs
	<ol>
<li>Préparer les PBS 1 x 16 mL par 8 puits.</li>
		<li>Préparer 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) en solution de 1 PBS x par 8 puits.</li>
		<li>Préparer 2 mL 0,1 % Triton X-100 dans du PBS 1 x par 8 puits.</li>
		<li>Préparation de 24 mL PBS Tween (PBST est 0,1 % Tween 20 à 1 x PBS) par 8 puits.</li>
		<li>Préparer 2 mL 10 % âne normal de sérum (NDS) dans 0,1 % PBST (10 % NDS/PBST) par 8 puits.</li>
		<li>Préparer 4 mL 1 % NDS dans 0,1 % PBST (1 % NDS/PBST) par 8 puits.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jour 1 de la coloration
	<ol>
<li>Aspirer au large de traitements et enteroids avec du PBS de lavage. Ajouter 250 µL 4 % PFA / puits. Placer sur rotateur pendant 1-2 h à 4 ° C. Enlever les 4 % PFA avec pipette.</li>
		<li>Laver 4 fois avec 250 µL/puits 1 x PBS. Placer sur rotateur pendant 10 min à température ambiante (RT). Remarque : Il est possible de stocker la plaque pendant 1 à 2 jours à 4 ° C si nécessaire.</li>
		<li>Ajouter 250 µL/puits 0,1 % X-100 Triton. Incuber pendant 1 heure à RT. Remove 0,1 % Triton X-100 avec la pipette.</li>
		<li>Laver 4 fois avec 250 µL/puits 1 x PBS. Placer sur rotateur pendant 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Ajouter 250 µL/puits 10 % NDS/PBST. Incuber pendant 45 min à RT. Remove 10 % NDS/PBST avec pipette.</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps primaire µL/puits 250, 1/250 dilué à 1 % NDS/PBST et incuber une nuit à 4 ° C. Remarque : La dilution optimale anticorps varie selon le fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jour 2 la coloration
	<ol>
<li>Laver au moins 5 fois pendant 4-5 h avec 250 µL/puits PBST. Placer sur rotateur à 4 ° C entre chaque lavage.</li>
		<li>Ajouter 250 µL/puits secondaires anticorps, dilué 1/1 000 à 1 % NDS/PBST. Enrouler la plaque au fleuret et incuber une nuit à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Jour 3 de coloration
	<ol>
<li>Ajouter 250 µL/puits nucléaires tache 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 15 min. Remarque : Maintenir la plaque dans l’obscurité.</li>
		<li>Laver 6 fois avec 250 µL/puits PBST. Placer sur rotateur pendant 10 min à 4 ° C entre chaque lavage.</li>
		<li>Lamelle de Mont sur Chambre glisser avec support de montage.</li>
		<li>Prendre des photos avec un 40 X objectif microscope confocal et également restituer dans un raster éditeur graphique (voir Table des matières).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêt.

L’épithélium intestinal est constitué de nombreux sous-types cellulaires qui sont chargé de la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, maintenir l’intégrité de barrière intestinale et peuvent être rompues dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Alors que les modèles animaux peuvent récapituler quelques facettes de la maladie, le modèle ex vivo d’enteroids dérivé de l’intestin des souris et des hommes constitue une plate-forme pour tester les effets de divers traitements. L’importance du modèle enteroi...

L’entérocolite nécrosante (NEC) est la principale cause de décès par maladie gastro-intestinale chez les nouveau-nés prématurés, affectant près de 1 sur 10 enfants nés avant 29 semaines de gestation1,2,3. La moitié des nourrissons avec les progrès de NEC à la forme la plus sévère, où la survie est seulement 10-30 %4,5. Aux États-Unis, environ 2 milliards USD/année sont passées à traiter les enfants avec NEC6,7, mais le taux de survie ni d’une thérapie a changé au cours des 30 dernières années. La pathogenèse de l’entérocolite nécrosante est caractérisée par des lésions intestinales et atteinte muqueuse guérison8,9,10,11, cependant, les voies de signalisation conduisant à un exacerbée la réponse inflammatoire et mécanismes d’inverser l’inflammation restent incomplètement compris.
L’administration de lait maternel s’est avérée pour être la stratégie de protection seulement contre NEC pour les bébés prématurés. Nous avons déjà montré que le lait maternel protège contre NEC développement par le biais de l’inhibition du récepteur toll-like récepteurs immunitaires innées 4 (TLR4) dans l’épithélium intestinal par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR)11de la voie de signalisation. La supplémentation du lait maternel à une formule expérimentale de NEC a atténué la réponse inflammatoire chez NEC, tel que démontré par l’inhibition de l’apoptose de l’entérocyte et restauration des entérocytes prolifération d’une manière qui dépendait de croissance épidermique Factor (EGF) et EGFR11. Dans une autre étude, il a été démontré que des nitrates, une autre composante du lait maternel, contribue à son caractère protecteur en modulant la perfusion intestinale, comparativement aux préparations pour nourrissons, qui manque de nitrate et peuvent contribuer à l’augmentation de la fréquence de l’entérocolite nécrosante dans formule nourris les bébés12,13. Autres composés présents dans le lait maternel qui sont sont révélées être impliquées dans la protection contre le NEC incluent des oligosaccharides de lait humain, L-arginine, glutamine et lactoferrine14,15,16, 17,18,19. Ces éléments bénéfiques du lait maternel révèlent la nécessité de son utilisation dans la prévention de l’entérocolite nécrosante, mais soulignent également l’importance d’étudier les mécanismes de signalisation des voies et les effets cellulaires impliqués dans la façon dont le lait maternel est médiation la protection contre le NEC .
Dans l’ordre afin d’étudier les propriétés protectrices du lait maternel dans un modèle murin de NEC, nous avons développé une technique innovatrice et facile à utiliser, par où la souris le lait maternel peut être extraite d’un barrage anesthésié à l’aide d’un maternel électrique pompe11,12 . Cette stratégie d’acquisition de lait maternel de la souris est avantageuse, non seulement parce que humain tire-laits sont facilement accessibles et efficaces dans l’achat de lait maternel, mais aussi parce que cette méthode permet des analyses de lait maternel propres à chaque espèce. En conséquence, nous permet de comparer les effets du lait maternel de la souris avec celles du lait maternel humain comme donneur humain le lait pasteurisé provenant une banque de lait dans les modèles spécifiques à l’espèce. Cette technique permet l’étude des composants du lait maternel en ce qui concerne leur contribution à la prévention de la NEC. Autres chercheurs ont mis au point des méthodes d’extraction lait maternel, mais ces techniques sont manuelles et nécessitent plus d’un laboratoire membre20,21,22. Une technique simple qui peut être utilisée en modifiant un tire-lait électrique humain pour collecter le lait d’une souris est présentée ici. Cette technique peut également être appliquée à d’autres espèces.
Afin de bien interroger les voies de signalisation impliquées avec NEC, modéliser les systèmes sont nécessaires pour évaluer tous les types de cellules différents connus pour être affectés dans le processus de la maladie. Ici, nous discutons un tel système de modèle - enteroids - et leur mise en place de la souris et de l’intestin humain. Enteroids intestinaux humains (Eih) en particulier fournir des promesses importantes, parce qu’ils offrent un modèle humain novateur, génétiquement diverse le ex vivo pour faciliter l’étude des processus physiopathologiques qui se déroulent dans le tractus gastro-intestinal 23. Enteroids ont été trouvés à être cultivées à long terme et peuvent être congelés pour plus tard utilisation23, et contrairement à l’humain organoïdes intestinale (HIOs), dont les cultures sont développées à partir des cellules souches pluripotentes inductible, enteroids sont générés à partir des cellules souches dans les cryptes intestinales isolées24. Enteroids exigent moins d’entretien, peut être infecté rapidement25et peut être facilement établie puisque des cryptes intestinales sont plus différenciés que HIOs23. Donc, HIEs offrent de nombreux avantages par rapport aux techniques existantes car ils peuvent être développés pour exposer des propriétés de compositions et les fonctions spécifiques à une région de l' épithélium gastro-intestinal humain23. L’utilisation d’enteroids est un choix très efficace lorsque le besoin d’un modèle humain de l’intestin, avec respect des limites propres à chaque région et facilité d’utilisation. Nous démontrons la technique d’isoler et de maintenir les principales cellules souches dérivées petit intestinale enteroids de souris et les humains prématurés.

<table><tbody><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose et de L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (insuline)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate Dulbecco’s ( DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M Acide n-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplément moins vitamine A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x inhibiteur de ROCK Y-27632, dichlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante Wnt3a Protéine</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Souris murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante R-Spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique murin recombinant (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance matrigel Matrice de membrane basale réduite</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Boîte de Pétri de culture cellulaire</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>Cellule 48 puits Plaque de culture</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8 puits Nunc Lab-Tek II Système de lames de chambre</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; M Passoire à cellules stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; M Passoire à cellules stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16 % de paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Âne normal Sérum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de microscope Verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G Aiguille de 1,5 pouce</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Ocytocine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Humain Double Tire-lait électrique</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tube à essai à fond rond</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons en caoutchouc</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>amorce humaine Mki67 F : 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R : 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

le lait maternel stimule la croissance des enteroids : un modèle ex vivo de la prolifération cellulaire

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Enteroids intestinales petits humains proviennent des cryptes et lorsqu’il est cultivé dans une niche de cellules souches contiennent tous les types de cellules épithéliales. La capacité d’établir des enteroid humaines ex vivo systèmes de culture sont importantes de physiopathologie intestinale de modèle et d’étudier les réponses cellulaires particuliers impliqués. Ces dernières années, enteroids de souris et les humains sont cultivées, repiquées et mis en banque loin pour une utilisation future dans plusieurs laboratoires à travers le monde. Cette plate-forme d’enteroid peut être utilisée pour tester les effets de divers traitements et des médicaments et quels sont les effets sont exercent sur les différents types de cellules dans l’intestin. Ici, un protocole pour l’établissement primaire enteroids intestinale petites cellules souches dérivées provenant de souris néonatales et intestin humain prématuré est fourni. En outre, ce système de culture enteroid a été utilisé pour tester les effets du lait maternel propres à chaque espèce. Lait maternel de la souris peut être obtenu efficacement à l’aide d’un tire-lait humains modifiés et lait exprimé souris peut ensuite être utilisé pour plus amples recherches expérimentales. Nous maintenant de démontrer les effets de souris exprimée, humaine, et lait maternel donneur sur la croissance et la prolifération des enteroids dérivés de souris néonatales ou intestin grêle humain prématuré.

Tout d’abord, nous avons voulu étudier si avec du lait maternel ou du lait maternel pasteurisé donneur a eu un effet sur petit enteroids intestinale. En effet, lait maternel et le lait maternel donneur augmentent la croissance des souris néonatale (Figure 1 a) et prématurée humaine dérivée enteroids (Figure 1 b).
Étant donné que le lait maternel humain a augmenté la cro...

Ce protocole décrit comment mettre en place un système de culture enteroid de souris néonatale ou intestin prématurée de l’homme, mais aussi une méthode efficace pour recueillir le lait de souris.

Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des intestins miniatures, appelés entéroïdes, en laboratoire. Les entéroïdes sont traités avec du lait maternel de souris extrait en laboratoire pour élucider les effets du lait maternel sur la prolifération in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à diverses maladies gastro-intestinales, telles que l’entérocolite nécrosante, qui affecte les nourrissons prématurés.Le principal avantage de cette technique est que les entéroïdes nécessitent peu d’entretien, peuvent être établis rapidement et présentent de nombreuses propriétés fonctionnelles de l’épithélium gastro-intestinal. Cette technique d’établissement des entéroïdes est un modèle très efficace de l’intestin grêle humain. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’intestin grêle, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes organiques dans d’autres régions du tractus gastro-intestinal.Pour commencer, décongelez l’extrait de membrane basale solubilisée sur de la glace. Ensuite, utilisez des ciseaux et des pinces pour faire une incision verticale sur toute la ligne médiane abdominale d’une souris euthanasiée. À l’aide d’une pince, excisez l’intestin grêle et retirez le mésentère.Pour préparer l’intestin grêle à l’isolement de la crypte et à la création d’entéroïdes, positionnez l’intestin droit et utilisez des ciseaux pour couper longitudinalement sur toute sa longueur. Retirez toutes les selles en secouant doucement l’intestin avec des pinces dans une boîte de Pétri remplie d’un mélange d’antibiotiques PBS. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de milieu de rupture cellulaire numéro un dans un tube conique de 50 millilitres.Placez des segments d’un demi-centimètre d’intestin dans le tube et placez le tube dans un seau à glace sur un shaker. Dans une hotte, ajoutez 9 microlitres de membrane basale au fond de chaque puits dans une lame de chambre à huit puits. Étalez rapidement la membrane à l’aide d’une pointe de pipette et laissez la membrane basale polymériser dans un incubateur.Il est important d’étaler rapidement la membrane basale afin qu’elle forme une fine couche au fond du puits. Les cryptes ne s’attacheront pas s’il y a des bulles d’air ou si la membrane basale est trop épaisse. Après avoir agité le tube conique, utilisez une crépine de 100 micromètres pour filtrer le tissu de la membrane et jeter le passage à travers.Ajoutez 30 millilitres de milieu de rupture cellulaire numéro deux dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, puis ajoutez le tissu intestinal dans le tube. Après avoir agité le tube pendant 15 minutes, filtrez le tissu à travers une passoire de 100 micromètres. Conservez le flux de cette étape.Ajoutez 15 millilitres de TMEM avec 4,5 grammes par litre de glucose et de L-glutamine dans un nouveau tube conique. Retirez le tissu de la passoire de 100 micromètres et ajoutez-le dans le nouveau tube conique. Ensuite, secouez manuellement le tube pendant 10 secondes et filtrez à travers une crépine de 100 micromètres.Dans la hotte, utilisez une passoire de 70 micromètres pour filtrer le tissu dans un nouveau tube conique. Après avoir centrifugé le tube pendant 8 minutes, placez-le dans un seau à glace dans la hotte. À l’aide d’une pipette, retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille formée.Remettre la pastille en suspension avec une quantité appropriée de milieu de culture cryptique sans facteurs de croissance. Après avoir incubé la lame de chambre pendant 30 minutes, plaquez le mélange de milieu de la crypte directement sur la membrane basale et incubez à 37 degrés Celsius pendant 3 heures pendant que les cryptes adhèrent. Après la période d’incubation, utilisez une pipette P200 pour retirer soigneusement tous les supports et cryptes non attachés.Une autre étape critique consiste à s’assurer de retirer lentement les supports et les cryptes en excès qui n’ont pas réussi à se fixer à l’aide d’une pipette P200. Ne dérangez pas la membrane basale, car les cryptes attachées peuvent se déloger. Ajouter lentement 250 microlitres de milieu de culture de crypte avec des facteurs de croissance dans chaque puits.Anesthésier une mère allaitante avec de l’isoflurane administré par le cône nasal et administrer la dose appropriée d’ocytocine sous-cutanée. Nettoyez les trayons avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher avant de commencer la procédure de traite. À l’aide d’un tire-lait humain électrique équipé d’un tube en silicone dimensionné pour s’adapter aux souris et d’un tube de 5 millilitres, extrayez le lait des trayons un à la fois.Enfin, aliquote immédiatement le lait et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Traitez les entéroïdes le cinquième jour avec du lait maternel de souris stocké pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Le premier jour de la coloration, utilisez du PBS pour éliminer les traitements expérimentaux et laver les entéroïdes.Ajoutez 250 microlitres de 4 % de PFA dans chaque puits et placez la lame sur un rotateur pendant 1 à 2 heures à 4 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, retirez le PFA, puis lavez délicatement chaque puits quatre fois avec 250 microlitres de PBS. Placez la lame de chambre sur un rotateur pendant 10 minutes à température ambiante.Ajouter 250 microlitres de 0,1 % Triton X-100 dans chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Après l’incubation, retirez le Triton X-100 à l’aide d’une pipette et lavez-le quatre fois avec 250 microlitres de PBS dans chaque puits. Placez la lame sur un rotateur pendant 15 minutes à température ambiante.Ajoutez 250 microlitres de 10 % de NDS/PBST dans chaque puits et incubez pendant 45 minutes à température ambiante. Après l’incubation, prélever le NDS/PBST à l’aide d’une pipette. Enfin, ajoutez 250 microlitres d’anticorps primaires dilués dans chaque puits et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius.Le deuxième jour de coloration, lavez chaque puits au moins cinq fois avec 250 microlitres de PBST et placez la lame sur un rotateur à 4 degrés Celsius entre chaque lavage. Ajouter 250 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans 1 % NDS/PBST dans chaque puits. Enveloppez la lame dans du papier d’aluminium et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius.Le dernier jour de la coloration, ajoutez 250 microlitres de DAPI coloré au nucléaire dans chaque puits et laissez-le reposer pendant 15 minutes. Ensuite, lavez chaque puits six fois avec 250 microlitres de PBST. Placez la lame sur un rotateur pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius entre chaque lavage.Enfin, préparez la lame pour l’imagerie microscopique en collant une lamelle sur la lame de la chambre avec un support de montage et en la laissant sécher pendant 24 heures. Dans cette étude, des entéroïdes de l’intestin grêle dérivés de souris néonatales ont été traités avec du lait maternel prélevé sur des souris allaitantes. Comme le montre cette figure, le lait maternel de souris a augmenté la prolifération dans les entéroïdes de souris.Pour étudier les effets spécifiques de l’espèce du lait maternel, le lait maternel humain et le lait maternel pasteurisé de donneuse ont également été appliqués aux entéroïdes de souris. Comme le montre cette figure, le lait maternel humain et pasteurisé de donneuses a augmenté la prolifération des entéroïdes de souris. Lors de cette procédure, il est important de garder les cryptes sur la glace pendant les étapes d’isolement.Effectuez lentement et doucement toutes les méthodes après la mise en culture des entéroïdes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme des traitements avec des cellules immunitaires, du microbiote ou divers médicaments peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires pour mieux récapituler le microenvironnement de l’intestin. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver, de traiter et d’effectuer l’immunofluorescence sur les entéroïdes.De plus, vous devriez être en mesure d’extraire efficacement le lait maternel d’une souris allaitante. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains et des fluides corporels peut être extrêmement dangereux, et qu’un équipement de protection individuelle doit toujours être porté lors de ces procédures.

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Nous décrivons une méthode pour établir des entéroïdes humains à partir de cryptes intestinales grêles et des colonoïdes à partir de cryptes du côlon prélevés à partir de tissus chirurgicaux et de biopsies. Dans cet article méthodologique, nous présentons les modalités de culture qui sont essentielles à la croissance et au maintien réussis des entéroïdes et des colonoïdes humains.

Mise en place d&#39;épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.

Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Le protocole présenté utilise la cytométrie de flux pour quantifier le nombre de cellules proliférantes et mortes dans les entéroïdes de souris cultivés. Cette méthode est utile pour évaluer les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération et la survie des organoïdes.

Quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes

La glande mammaire est une structure bilayered, comprenant des cellules épithéliales myoépitheliales et internes intérieures. Présenté est un protocole pour préparer les organoïdes à l’aide de la trypsinisation différentielle. Cette méthode efficace permet aux chercheurs de manipuler séparément ces deux types de cellules pour explorer les questions concernant leurs rôles dans la forme et la fonction des glandes mammaires.

Génération d’organoïdes mammaires mosaïques par trypsinisation différentielle

Ce protocole fournit des outils expérimentaux in vitro pour évaluer la transformation des cellules mammaires humaines. Des étapes détaillées pour le taux de prolifération cellulaire de suivi, la capacité de croissance ancre-indépendante, et la distribution des lignées cellulaires dans les cultures 3D avec la matrice de membrane de sous-sol sont décrites.

Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.

Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Les entéroïdes sont en train de devenir un nouveau modèle pour l’étude de la physiologie et de la physiopathologie des tissus, le développement de médicaments et la médecine régénérative. Ici, nous décrivons un système de culture dérivé d’entéroïdes 2D de cellules primaires bovines qui permet la co-culture avec des types de cellules tissulaires pertinents. Ce modèle offre un avantage translationnel pour la modélisation de la recherche gastro-intestinale.

Génération d’un système de culture monocouche bidimensionnelle primaire dérivé d’entéroïdes bovins pour des applications dans la recherche biomédicale translationnelle

La présente étude fait état d’un protocole plus facile, rapide et économique permettant d’isoler et de cultiver efficacement des cellules épithéliales mammaires primaires (HMEC) humaines à partir de petites quantités de tissu mammaire. Ce protocole est adapté à la production rapide de HMEC primaires pour des applications de laboratoire et cliniques.

Isolement et culture de cellules épithéliales mammaires humaines primaires

Découvrez la culture d'entéroïdes à partir d'intestin de souris néonatale pour étudier les effets du lait maternel sur la prolifération intestinale. Cette méthode ex vivo permet d'analyser les maladies gastro-intestinales comme l'entérocolite nécrosante chez les prématurés.

Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire

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