Haute résolution Volume Imaging de neurones par l’eXclusion de l’utilisation de la Fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques

L’objectif global de cette procédure est de permettre la mesure en plein champ du volume neuronal in vitro avec une résolution axiale submicrométrique requise pour l’analyse des neurites dans les structures dynamiques impliquées dans la croissance neuronale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences cellulaires concernant la dynamique des changements de volume à l’échelle filiale lors de la non-croissance ou de la dégénérescence axonale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une résolution axiale submicrométrique combinée à une observation complète de l’ajustement et à une échelle de temps de l’ordre de l’heure ou du jour.

Pour commencer la procédure, démoulez le bloc PDMS sous une hotte chimique en versant de l’isopropanol dessus. Ensuite, placez-le sur le banc en acier inoxydable de la hotte. Découpez autour de la plaquette de silicone et démoulez la réplique PDMS.

Ensuite, coupez autour de la puce et laissez une marge de deux millimètres à l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir. Perforez l’entrée en appuyant fermement sur le perforateur de 1,5 millimètre de diamètre et actionnez-le afin de couper et de sculpter le trou de l’entrée. Faites de même au niveau des quatre zones dédiées de la puce où le liquide sera injecté.

Ensuite, nettoyez la puce en collant et en décollant le ruban adhésif sur le côté microstructuré. Saupoudrer d’isopropanol des deux côtés. Ensuite, séchez la copeau avec de l’azote sous pression à l’aide d’une soufflette à air.

Dans cette procédure, placez chaque lamelle sur une machine à revêtir située dans un environnement de salle blanche. Appliquez une goutte de résine photosensible positive pour couvrir environ 75 % de la lamelle et essorez la couche à 4000 tr/min pendant 30 secondes pour atteindre une épaisseur finale de 0,45 micromètre. Placez les lamelles sur une plaque chauffante avec une température de surface de 115 degrés Celsius pendant une minute.

À l’aide d’un aligneur de masque, exposez chaque lamelle à une longueur d’onde de 435 nanomètres à travers le masque dédié selon les paramètres du fabricant. Ensuite, préparez deux plats de cristallisation en verre, l’un contenant le révélateur sans dilution, l’autre contenant de l’eau déminéralisée. Trempez les lamelles une à une dans le révélateur pendant une minute tout en remuant continuellement et doucement le plat de cristallisation.

Ensuite, plongez la plaquette dans de l’eau déminéralisée pendant environ cinq secondes. Transférez la plaquette sur un papier absorbant et séchez-la avec de l’azote sous pression à l’aide d’une soufflette à air. Placez à la fois la puce PDMS et la parabole en verre sur laquelle elle sera collée dans la chambre à plasma pour l’activation de surface.

Ensuite, déposez une goutte d’eau sur une lame de verre de microscope rectangulaire épaisse et collez la lamelle sur la lame de verre par capillarité. Au microscope, marquez l’emplacement des bandes de résine photosensible à l’arrière de la lame de verre. Placez la lamelle en verre à motifs sur le porte-masque de l’aligneur de masque.

Fiez-vous à la marque faite pour centrer les objets de référence photorésine. Pour augmenter le contraste optique, placez une plaquette de silicium sous la puce PDMS. La plaquette de silicium doit rester fermement fixée sur le mandrin pendant le processus d’alignement.

Ensuite, placez la puce PDMS sur le support de substrat mobile de l’aligneur de masque. Par la suite, soulevez suffisamment le mandrin pour visualiser à la fois la puce et l’ensemble de bandes photosensibles situées sur la lamelle de recouvrement tout en restant derrière le contact mécanique. Effectuez l’alignement et réalisez un contact mécanique entre la puce et la lamelle en soulevant le mandrin jusqu’à ce que la surface des piliers PDMS touche la lamelle en verre.

Après cela, abaissez le mandrin. Retirez la lamelle collée à la puce du porte-masque. Ensuite, placez l’appareil dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et transférez le tout dans le four pendant cinq à dix minutes pour augmenter la force de liaison.

Trente minutes après le collage, placez une pointe de pipette de dix microlitres remplie de solution PLO à l’entrée. Ensuite, chargez le liquide jusqu’à ce qu’il forme une goutte sur le dessus. Répétez la même opération à la sortie et aux réservoirs.

Par la suite, ajoutez du PBS dans la boîte de Pétri tout autour de la puce. Scellez la boîte de Pétri avec un film de paraffine et incubez à température ambiante avec un minimum de cinq heures. Ensuite, enfoncez légèrement un cône d’embout de dix microlitres dans chaque trou d’injection et aspirez l’excès de liquide.

Ensuite, remplacez PLO ainsi que le PBS entourant la puce par le milieu de culture. Ensuite, placez la puce dans l’incubateur régulé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les neurones s’ensemencent avec un minimum de cinq heures de temps d’incubation. Dans cette procédure, prélevez le milieu de culture à partir de la puce.

Récupérez deux à trois microlitres de la solution cellulaire fraîchement remise en suspension et injectez-la à l’entrée. Répétez immédiatement la même opération à la sortie. Injecter à peu près le même volume de milieu de culture dans chaque réservoir.

Observez rapidement la puce au microscope pour vérifier la densité des cellules. L’ordre de grandeur de la densité cellulaire optimale correspond à environ cinq à dix cellules à l’intérieur de la surface carrée délimitée par quatre piliers. Répétez la procédure d’injection de 0,5 à 1 microlitre de suspension cellulaire pour atteindre la densité cellulaire ciblée.

Pour l’imagerie, remplacez le milieu de culture par le milieu d’imagerie. Ensuite, placez la puce sous un microscope à épifluorescence. Acquérir des images de cellules à partir d’une ou de plusieurs images successives dans le cas d’expériences en accéléré.

Voici les observations représentatives d’une bande de photorésine d’étalonnage et de neurones. Des images à fort grossissement et des coupes transversales de ces objets sont affichées sur la droite. Les neurites représentatives et une chambre centrale de trois micromètres de haut sont montrées ici.

Le volume de la tranche de neurite peut être calculé en fonction de la largeur du neurite. Et voici les cônes de croissance représentatifs et une chambre centrale de trois micromètres de haut. Leurs sous-structures émergent clairement d’un bruit de fond optique d’environ 20 nanomètres.

Des observations en accéléré de neurones d’actes de vie sont ensemences dans une chambre de 12 micromètres de haut pour suivre le cycle de rétrécissement et de réactivation du cône de croissance sur une échelle de temps de quelques dizaines de minutes. Lors de cette procédure, il est important d’avoir accès à un équipement de gravure ionique profonde pour fabriquer la boue de silicium. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’aligner une lamelle en verre structuré avec une puce PDMS.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée de manière reproductible à la quantification de la neurologie en 3D. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la pharmacologie pour explorer l’effet de divers médicaments de calibre réel, tous en forme de cône fermé. N’oubliez pas que travailler avec les neurones primaires nécessite beaucoup de soin pour éviter la contamination et les éclatements.

Soyez toujours doux et rapide lorsque vous changez de support afin de limiter le temps qu’ils passent à l’extérieur de l’incubateur.