Name: Haute résolution Volume Imaging de neurones par l’eXclusion de l’utilisation de la Fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez une méthode d'exclusion fluorescente pour l'imagerie volumique de neurones avec une résolution axiale submicrométrique. Cette technique permet d'analyser les dynamiques des neurites et des cônes de croissance in vitro.

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Les auteurs veulent remercier ChiLab, matériaux et laboratoire de microsystèmes - Politecnico di Torino - DISAT, en la personne du professeur C F Pirri, Dr M Cocuzza et Dr S L Marasso, pour leur aide précieuse dans le processus de développement et la fabrication de dispositifs. Nous remercions Victor Racine de Quantacell de discussion et de soutien dans le traitement de l’image. Nous sommes reconnaissants à Isabelle Grandjean et Manon Chartier de la facilité de l’Animal de l’Institut Curie pour leur soutien à la souris et Pablo Vargas et de Ana-Maria Lennon (Institut Curie) pour nous avoir fourni les souris GFP LifeAct. Nous sommes reconnaissants à Olivier Thouvenin Institut Langevin et Clotilde Cadart, Larisa Venkova et Matthieu Piel de l’Institut Curie - UMR 144, pour leur aide dans la compréhension de l’eXclusion de Fluorescence méthode. Enfin, nous remercions la plate-forme technologique de l’Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) pour leur soutien dans la microfabrication. Ce travail a été soutenu en partie par l’européen recherche Conseil Advanced Grant no 321107 « Violoncelle », PSL Université (projet SwithNeuroTrails), avenir de l’Investissement de l’ANR et les IPGG Labex Equipex.

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

L’imagerie des neurones de volume constitue un défi pour la technique de FXm en raison les extensions longues et minces de ces cellules. Ce protocole décrit des variantes du même type de dispositif microfluidique dédié à l’imagerie de neurone.
Outre les aspects de la conception de la microfluidique, le choix de l’objectif est fondamental pour l’imagerie de fluorescence exclusion et implique un compromis entre la résolution latérale et la clarté de l’image. Il a été démontré en 13 qu’un NA élevée conduisant à une profondeur de champ plus petit que la hauteur de la chambre n’était pas préjudiciable pour la précision de mesure du volume si l’imagerie s’est déroulée au foyer et si n’est pas une marge suffisante entre le contour de l’objet d’i intérêts et les limites de la surface de l’intégration. Cependant, l’utilisation d’une chambre beaucoup plus élevée que la profondeur de champ porte atteinte à la clarté de l’image en raison de la diffusion de photon, qui adoucit les bords des objets d’intérêt. La fabrication d’une chambre haute de 3 µm réduit ce flou latéral et fourni des images exclusion fluorescent exceptionnellement bien définies, même en utilisant NA haute (0,8) 40 X objectifs pour visualiser les branches neuronales avec haute résolution latérale.
Montage de puce est une étape essentielle, en particulier dans le cas des chambres haut de 3 µm, mais attention manipulation comme décrit au point 4.1.2, permet d’éviter l’effondrement du toit. La surface élevée au rapport de volume lié à ces chambres minces a également soulevé la question de la stabilité de la concentration de Dextran au fil du temps. Nous avons vérifié que l’absorption de surface du Dextran après une nuit d’incubation était négligeable : après avoir remplacé Dextran par PBS, la différence d’intensité entre le pilier et l’arrière-plan était environ 1 pour 1000 du contraste entre intensité initiale ces deux régions en présence de Dextran. Notez que les neurones peuvent adhérer sur la lamelle inférieure et sur le toit PDMS. Cet effet disparaît lorsqu’à l’aide de motifs lamelles couvre-objet (c'est-à-dire lorsque nous incuber pas adhésifs molécules au sein de la chambre PDMS), le revêtement est donc strictement localisée sur le fond de la chambre.
En dehors de leur morphologie difficile, les neurones sont plutôt adaptés à FXm due au fait que l’un de la limitation majeure de la méthode, c'est-à-dire l’endocytose dextran, est très limité dans ces cellules. Nous choisissons un 10 kDa formulation pour supprimer à long range (heures) tout phénomène d’endocytose visible.
En conclusion, la simplicité conceptuelle de FXm est équilibrée par un ensemble de questions expérimentales qui ont été résolus par le présent protocole, tels que la rugosité nanométrique de PDMS et micrométrique chambre au sol ou une correction de fond afin de corriger l’inégalité du le plafond de PDMS entre les piliers. Cependant, l’utilisation d’une chambre étroite microfluidique de confiner le milieu fluorescent donne quelques contraintes spécifiques comme le besoin de piliers de soutien, qui abaisse la surface efficace disponible pour l’adhésion cellulaire, ou la nécessité d’exclure le soma de la centrale chambre d’observer des extensions neuronales avec la clarté plus élevée, qui restreint les régions de la cellule accessible à l’observation de haute résolution. Une évolution possible de cette méthode serait de se débarrasser de ce confinement physique, pour être remplacée par une autre optique. Le nouveau développement de la microscopie de nappe de lumière peut-être être combiné avantageusement avec FXm dans l’avenir.

La connaissance précise du volume cellulaire a attiré une attention accrue dans les dernières années, conduit par la question de l’homéostasie cellulaire taille archaios 1 et plus généralement dans les cellules mitotiques 2. Cependant, la question du volume des cellules est pertinente aussi pour les cellules post-mitotiques, pour lequel les neurones constituent un exemple paradigmatique.
Volume est en effet une signature importante des événements physiologiques et pathologiques à différentes échelles et points dans le temps vie neuronale, des déformation axonale transitoire, liée à l’activité électrique (échelle de la milliseconde) 3 pour l’irréversible neuronale gonflement survenant durant la phase asymptomatique de neurodegenerative maladies (au cours des années chez l’homme) 4. Toutefois, le changement de volume plus important se produit sur une échelle de temps intermédiaires de jours ou de semaines (en fonction de l’organisme considéré) au cours de la croissance neuronale. La morphologie étendue et complexe des neurones soulève des questions multiples, parmi lesquels la réglementation de la taille des cellules. Diamètre et longueur axonal sont en effet étroitement réglementé en vivo, avec des valeurs spécifiques à chaque type neuronal 5,6.
Ces questions, complexes à aborder en vivo, peuvent également être adressées d’une manière simplifiée in vitro. Dans ce but, une méthode dédiée à la mesure de volume rapide assez pour suivre la dynamique de croissance (c'est-à-dire sur une échelle de temps de minutes) et compatible avec l’observation durant des heures ou des jours est requise. Plusieurs méthodes ont été développées au fil des ans pour donner un accès direct ou indirect à volume cellulaire in vitro. Reconstruction de la cellule d’imagerie confocale est l’un d'entre eux, mais cette méthode implique une exposition étiquetage et répétée à la lumière tout en montrant une résolution limitée axiale d’environ 500 nm 7. Notez que ces deux derniers inconvénients sont partiellement surmontés par une méthode plus sophistiquée et plus récente, nommée treillis microscopie de lumière-feuille 8. Microscopie à Force atomique a été utilisé 9 , mais cette méthode de balayage est par essence lent et fastidieux. En outre, le contact physique, qu'elle exige avec la cellule risquent d’interférer avec la mesure compte tenu de l’extrême douceur de neurones 10. Méthode indirecte à l’aide de la résonance ou impédance ont été employés pour différentes cellules types 11, mais insuffisante pour nous adressons des cellules adhésives, comme les neurones.
Une des méthodes plus prometteuses est basée sur la mesure du volume exclu des cellules dans une chambre étroite remplie avec un colorant fluorescent. La méthode par Fluorescence de l’eXclusion (FXm) est simple dans son principe, car il ne nécessite aucun étiquetage et convient pour l’imagerie optique rapide, à long terme des populations de cellules avec une résolution axiale potentiellement l’optique. Plus précisément, la résolution en z dépend de l’intensité de fluorescence maximum dans la chambre de culture (c'est-à-dire dans une région dépourvue de cellules) divisée par la dynamique de la caméra, bien que plusieurs sources de bruit limitent cette résolution ultime. Cette méthode a été très puissante pour suivre le volume de la migration de cellules adhérentes 12 ou pour étudier le changement de volume au cours de la mitose de cellules de mammifères, minutieusement décrit dans 13. Toutefois, les neurones constituent un défi méthodologique pour FXm compte tenu de leur grande ramification dans les processus de Sub micrométriques.
Nous présentons ici une méthode conduisant à la fabrication des lisses FXm chambres d’accéder avec grande précision le volume et la hauteur des branches neuronales et dynamique des structures impliquées dans la croissance neuronale comme les cônes de croissance.
Chambers doit avoir des hauteurs similaires que l’objet à mesurer afin d’optimiser la résolution axiale. Par conséquent, nous avons conçu différents dispositifs FXm caractérisés par des chambres de mesure centrale des trois hauteurs différentes. La plus mince (3 µm de hauteur) est dédié à la mesure des neurites : cette faible hauteur exclut soma, qui restent dans la chambre intermédiaire élevé près de 15 µm. Chambres centrales plus épais (10 à 12 µm) sont suffisamment élevées pour suivre la croissance de cellules entières. Le dispositif comprend également deux réservoirs situés de chaque côté de la chambre centrale. Quatre trous d’injection (IH) sont ainsi mis en œuvre et sont désignées comme suit : l’entrée et la sortie servent à introduire les suspensions cellulaires dans la puce, alors que les deux autres alimentent les réservoirs.
Nous avons la première lamelles fabriqué d’étalonnage pour les mesures de hauteur à l’aide de structures de résine photosensible de géométrie connue. Nous avons ensuite imagés gratuits neurones croissantes, mais aussi morphologiquement contraints neurones dans micromotifs de l’adhérence.

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Pour effectuer DRIE</td></tr><tr><td>MJB4 Aligneur de masque</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 photolithographie</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Aligneur de masque</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Photolithographie associée à DRIE</td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture cellulaire</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 37 &deg ; C 5 % CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe Incubateur</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Microscope à épifluorescence</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Four entre 65 et 80 &deg ; C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilomètre mécanique</td><td>Veeco Dektak</td><td>6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Profilomètre optique</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Diamètre 200 mm</td></tr><tr><td>Sonicateur à bain à ultrasons</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Volume du bain : 0,8 litre</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>Masks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Données supplémentaires</td></tr><tr><td>Su8 Masque 1</td><td></td><td></td><td>Données supplémentaires</td></tr><tr><td>Su8 Masque 2</td><td></td><td></td><td>Données supplémentaires</td></tr><tr><td>Su8 Masque 3</td><td></td><td></td><td>Données supplémentaires</td></tr><tr><td>Étalonnage S1805 stripes</td><td></td><td></td><td>Données complémentaires</td></tr><tr><td>Petit équipement de laboratoire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perforateur de 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (référence américaine)</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel ou lame</td><td></td><td></td><td></td>de rasoir</tr><tr><td>9" Spatule plate en acier inoxydable avec cuillère</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>Pour démouler PDMS</td></tr><tr><td>Top Lip Wafer Handling</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>incurvée FST</td><td>Dumont #7 Pince - Standard / Dumoxel</td><td>Pour manipuler les lamelles en verre</td></tr><tr><td>Substrates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm lamelles en verre</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td><Fortes>Photorésines et développeurs</Forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 photorésine positive</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Avant le processus DRIE, épaisseurs 1,8 & micro ; m</td></tr><tr><td>AZ 351B développeur</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Pour développer une résine photosensible positive AZ 1518</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Développeur PGMA</td><td>Technique</td><td></td><td>Pour développer une résine photosensible négative SU-8</td></tr><tr><td>Microposit S1805 resist</td><td>Chimie Technologie Services</td><td></td><td>Photorésine positive utilisée pour obtenir 0,5&micro ; m hautes structures</td></tr><tr><td>MF 26A développeur</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Pour développer des consommables de laboratoire positifs S1805 photoresist</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette jetable en plastique 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 Boîtes de Pétri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 20 mL</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Scotch</td><td></td><td></td><td></td>transparent</tr><tr><td>Lingettes carrées</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Film de paraffine plastique</td></tr> <tr><td><fort>Chimique</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-Méthacryloxypropyl)trichlorosilane</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS et agent de durcissement Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poly-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99,8%</td></tr><tr><td>3-méthacryloxypropyl-triméthoxysilane</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>acide</td> <td>acétiqueSigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugué avec Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion à 488 nm</td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugué avec Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprtion à 647 nm</td></tr><tr><td><fort>Milieu de culture</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal sans rouge de phénol</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine dans Matlab pour la normalisation de l’arrière-plan</td><td>Quantacell</td><td>Contact Victor Racine : victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Pour sélectionner un retour sur investissement spécifique pour analyse d’images</td></tr><tr><td>Routine</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Données supplémentaires</td></tr><tr><td>Routine</td><td>Matlab</td><td></td><td>Données supplémentaires</td></tr></tbody></table>

haute résolution volume imaging de neurones par l’exclusion de l’utilisation de la fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Le volume est un paramètre important concernant les caractéristiques physiologiques et pathologiques des neurones à des échelles de temps différentes. Les neurones sont des cellules tout à fait uniques au sujet de leurs morphologies ramifiés étendus et par conséquent relever plusieurs défis méthodologiques pour la mesure de volume. Dans le cas particulier de in vitro la croissance neuronale, la méthodologie choisie devrait inclure Sub micrométrique résolution axiale combinée avec plein champ observation sur des échelles de temps de minutes d’heures ou de jours. Contrairement à d’autres méthodes comme la reconstruction de forme de cellule à l’aide de l’imagerie confocale, mesures électriquement ou microscopie à Force atomique, la méthode d’eXclusion à la Fluorescence récemment développée (FXm) a le potentiel de répondre à ces défis. Cependant, bien qu’elle soit simple dans son principe, mise en œuvre d’un FXm haute résolution pour les neurones nécessite plusieurs ajustements et une méthodologie dédiée. Nous présentons ici une méthode basée sur la combinaison de l’exclusion de la fluorescence, Dispositifs microfluidiques multi-compartiments bas-rugosité et enfin microstructuration à obtenir in vitro des mesures de volume neuronal local. La haute résolution fournie par l’appareil nous a permis de mesurer le volume local des processus neuronaux (neurites) et le volume de certaines structures spécifiques impliqués dans la croissance neuronale, tels que les cônes de croissance (GCs).

Le résultat du processus de fabrication décrite dans les sections 1 et 2 est illustré par les images de la Figure 1 a-1 b et la courbe de la Figure 1. Le tableau de la Figure 1 affiche les valeurs de rugosité de deux différentes zones représentatives de la puce PDMS, c'est-à-dire dans la centrale et la chambre intermédiaire suivante haut de 20 µm. Une diminution de la rugosité d’un facteur d’environ 7 a été obtenue à l’aide de gravé wafer Si au lieu de photorésine SU-8. Ensuite, FXm a été tout d’abord appliqué sur une bande de résine photosensible de géométrie connue (Figure 2 a) dans une chambre haute de 10 µm. Après traitement de l’image et l’intensité à la conversion de hauteur (voir le graphique de la Figure 2 b), profils de FXm effectuées sur des coupes transversales le long de cette bande (Figure 2) fournissent les profils de la hauteur désirée (Figure 2D). Figure 2D montre la comparaison entre les profils obtenus à l’aide de profilométrie mécanique et méthodes FXm. Ces profils, y compris la valeur de bord et du plateau, sont très semblables, validation de la méthode. Notez que la dispersion des données FXm n’est pas représentative de la résolution ultime de la méthode, tel qu’évaluée dans la Figure 3 et Figure 4, mais découle de la faible intensité employées pour éviter un éventuel effet de la très faible auto-fluorescence de la résine photosensible dans le chenal GFP.
Ensuite, nous avons observé des neurites à 3 µm et 10 chambres haute µm (Figure 3). L’écart du bruit de fond est à environ 18 nm après l’intensité à la conversion et fond la correction de hauteur. Cette valeur est légèrement supérieure à la rugosité physique des surfaces PDMS coulées sur des surfaces de silicium (12 nm, consultez le tableau de la Figure 1) mais beaucoup plus faible que la rugosité mesurée sur PDMS obtenus à partir des moules de SU-8. Ces résultats mettent en évidence la valeur ajoutée de forage de puits dans les plaquettes de silicium au lieu d’ouvrir des trous dans la résine photosensible SU-8 à monter des piliers. Une telle valeur faible permet un haut bruit rapport signal et des images très claires en volume, telles que celle qui est affichée dans la Figure 3 a. Par exemple des données qui peuvent être extraites de ces images, nous avons calculé le volume de 1,6 µm (c.-à-d. 10 pixels) large neurites tranche (voir le graphique de la Figure 3 b). En utilisant dans une première approximation à un ajustement linéaire de ces données donne une valeur de hauteur de neurites moyenne d’environ 400 nm, à comparer avec par exemple le diamètre axonal 500 nm trouvé en 10 jours les petits vieux dans le corps calleux 5. Nous avons également combiné FXm avec micropatterns d’adhérence consistant en série est attenant 2 µm et 6 µm de large bandes de 30 µm de longueur. Notre but était d’étudier l’influence de la largeur des neurites sur sa forme 3D. La figure 3 montre une représentation 3D en fausses couleurs d’une image de neurone tout obtenue dans une chambre haute de 10 µm. Neurites se répandent sur 2 µm et 6 µm larges rayures, tandis que le soma est situé à l’extrémité de la bande plus importante. Profils de hauteur ont été prélevés dans trois sections différentes de la Croix. En cohérence avec le graphique affiché dans la Figure 3 a, la surface intégrées sur l’augmentation de coupes avec la largeur de neurites (Figure 3D).
Aussi, nous nous sommes concentrés sur les structures 3D de croissance cône (GC). Figure 4 A-B affiche deux profils GC différents obtenus dans une chambre forte à 3 µm, qui mettent en valeur leur sous-structure ramifié. En outre, nous avons effectué des expériences en Time-lapse pour suivre la dynamique du volume des catalogues globaux dans une chambre haute de 12 µm. La figure 4 affiche un cycle de rétrécissement et la réactivation d’un GC donnée dans un délai de quelques dizaines de minutes. Grâce à l’utilisation de souris GFP-lifeact, les cônes de croissance ont été localisées dans la longueur d’onde d’émission de GFP (510 nm) de leur concentration élevée d’actine. La surface identifiée à la longueur d’onde était utilisée pour intégrer sur la longueur d’onde d’émission de dextran à 647 nm pour calculer le volume de GC. La figure 4 montre enfin la distribution du volume du GC à des moments différents et l’emplacement sur trois différents neurones, centrés sur une valeur d’environ 6 µm3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> Figure 1 : chambres de FXm PDMS. (A) les plans des quatre principales étapes différentes de microfabrication menant au moule final. L’emplacement de l’entrée, de sortie et de réservoirs sont indiqués. Barreaux de l’échelle : 1 mm. (B) Image de la chambre de PDMS FXm obtenue à l’aide d’un profilomètre optique. Cette image montre la chambre centrale contenant 3 rangées de 10 µm haute piliers et les chambres intermédiaires de 20, 50 et 90 µm de hauteur. Echelle : 500 µm. (C) vue en coupe de la puce sur les deux lignes pointillées tracées au point B. Or/jaune : section transversale sur piliers, bleus : section transversale entre les piliers. (D) signifie que les valeurs de la rugosité PDMS mesurée sur 50 × 50 µm2 zones moulés sur silicium et sur la chambre intermédiaire de la grande SU-8 de 20 µm (voir flèches pour l’emplacement de ces zones). Valeurs moyennes ont été prélevés les mesures des trois domaines différents. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> Figure 2 : étalonnage de FXm méthode utilisant une bande de résine photosensible comme objet d’intérêt. (A) image de GFP-fluorescence prise dans une chambre haute de 10 µm remplie de 10 000 dextran MW absorbant à 488 nm à 1 mg/mL. (B: fond, P: pilier). Observation avec un objectif de NA X 0,8 40 sec. Barre d’échelle : 50 µm. (B) Loi d’étalonnage linéaire provenant de l’intensité moyenne des deux rectangles colorés montré dans le profil d’intensité de Fluorescence de (C) a. obtenu au niveau de la ligne bleue pointillée affiché (a), traversant la résine photosensible rayure (0,45 µm haute positive photosensible). (D) comparaison des profils obtenus de mécanique profilomètre (points noirs) et FXm après l’intensité à la conversion de la taille des données de (B) (points bleus). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> Figure 3 : imagerie volume neurites. (A) neurites s’étendant dans la chambre haute centrale de 3 µm de soma situé dans la chambre intermédiaire ensuite 15 µm. Imagerie effectuée à l’aide de 10 000 dextran MW absorbant à 488 nm et un 40 X, NA 0,8 sec objectif. L’encart obtenu après que l’utilisation de la routine de réduction fond met en évidence les deux neurites et choisi pour tracer le graphique du côté droit. Barreaux de l’échelle : 30 µm. (B) neurites tranche volume en fonction de la largeur des neurites calculé à partir du 22 profils (moyenne sur 10 pixels, c'est-à-dire sur une « tranche de neurites » de 1,6 µm) montrés en (A). La ligne continue représente un ajustement linéaire de pente 0,4 µm en passant par l’origine. (C) image fausses couleurs d’un neurone à motifs sur une bande adhésive fait de successives de 2 µm et souches large de 6 µm (représentées en blanc). Les mesures ont été effectuées dans une chambre haute de 10 µm, remplie de 10 000 dextran MW absorbant à 647 nm et à l’aide d’un NA 40 x 0,8 sec objectif. (D) profils de hauteur correspondant aux couleurs lignes pointillées illustrés (C), conservant le même code de couleur. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> Figure 4 : l’imagerie statique et dynamique de croissance cône. (A-B) Profils de hauteur du cône croissance obtenues dans une enceinte haute de 3 µm après l’intensité à la conversion de hauteur le long des lignes jaunes affiché dans les images associées. Observation, effectuée à l’aide d’un remplissage avec 10 000 dextran MW absorbant à 488 nm et un 40 X, NA 0,8 sec objectif. (C) imagerie de neurone ensemble dans une chambre haute de 12 µm remplie de 10 000 dextran MW absorbant à 647 nm. Observations ont été faites dans les deux canaux fluorescent : GFP de localisation de cône de croissance (pointillés jaunes) et CY5 pour calculer le volume de GC de l’exclusion de la fluorescence. La surface incluse par des pointillés jaunes a été utilisée pour calculer le volume de GC. Le graphique présente la variation du volume de la GC dans le temps et associé de morphologies fois GFP et CY5 canaux à deux moments différents représentatifs. Toutes les données ont été recueillies à l’aide d’un NA 40 x 0,8 sec objectif chaque barres d’échelle de 3 min. : 10 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Étape</td>
			<td>Masquer la couche de 1:8 µm</td>
			<td>Masque à 02:30 µm de couche</td>
			<td>Masque 03:40 µm de couche</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 tr/mn</td>
			<td>30 s à 3050 tr/min</td>
			<td>30 s à 3250 tr/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire au four doux</td>
			<td>3 min à 95 ° C</td>
			<td>2 min à 65 ° C + 6 min à 95 ° C</td>
			<td>3 min à 65 ° C + 7 min à 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition à l’énergie</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire au four après l’exposition</td>
			<td>4 min à 95 ° C</td>
			<td>1 min à 65 ° C + 6 min à 95 ° C</td>
			<td>2 min à 65 ° C + 7 min à 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Développement</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire dur (facultatif)</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : étapes de photolithographie effectuées pour construire un appareil contenant une chambre centrale de 12 μm en hauteur. Hauteurs des chambres intermédiaires : 20, 50 et 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Étape</td>
			<td>Masque à 01:10 µm de couche</td>
			<td>Masque à 02:30 µm de couche</td>
			<td>Masque 03:40 µm de couche</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de SU-8</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s à 1 500 tr/min</td>
			<td>30 s à 3050 tr/min</td>
			<td>30 s à 3250 tr/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire au four doux</td>
			<td>3 min à 95 ° C</td>
			<td>2 min à 65 ° C + 6 min à 95 ° C</td>
			<td>3 min à 65 ° C + 7 min à 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exposition à l’énergie</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire au four après l’exposition</td>
			<td>4 min à 95 ° C</td>
			<td>1 min à 65 ° C + 6 min à 95 ° C</td>
			<td>2 min à 65 ° C + 7 min à 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Développement</td>
			<td>2 min 30 s</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire dur (facultatif)</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : étapes de photolithographie effectuées pour construire un appareil contenant une chambre centrale de 10 μm en hauteur. Hauteurs des chambres intermédiaires : 20, 50 et 90 µm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Étape</td>
			<td>Masque à 01:12 µm de couche</td>
			<td>Masque à 02:32 µm de couche</td>
			<td>Masque 03:40 µm de couche</td>
		</tr>
<tr>
<td>Type de SU-8</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s à 3250 tr/min</td>
			<td>30 s à 2 500 tr/min</td>
			<td>30 s à 3250 tr/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire au four doux</td>
			<td>3 min à 95 ° C</td>
			<td>2 min à 65 ° C + 5 min à 95 ° C</td>
			<td>3 min à 65 ° C + 7 min à 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temps d’exposition</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire au four après l’exposition</td>
			<td>4 min à 95 ° C</td>
			<td>1 min à 65 ° C + 5 min à 95 ° C</td>
			<td>2 min à 65 ° C + 7 min à 95 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Développement</td>
			<td>3 min</td>
			<td>5 min</td>
			<td>6 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cuire dur (facultatif)</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
			<td>3-5 min à 200 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : étapes de photolithographie effectuées pour construire un appareil contenant une chambre centrale de 3 μm à hauteur de. Hauteurs des chambres intermédiaires : 18, 50 et 90 µm.
Données supplémentaires 1 : masks_neuron_volume_chips.tiff. Vue schématique des masques utilisés pour fabriquer le dispositif PDMS (DRIE masque et masque 1-3). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Des données supplémentaires 2 : file « masks_neuron_volume_chips.dxf ». Fichiers électroniques permettant de fabriquer le masque DRIE et masques 1-3. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Des données supplémentaires 3 : « Mask_Photoresist-stripes.dxf ». Fichiers électroniques permettant de fabriquer le masque utilisé pour la photolithographie de bandes de résine photosensible. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Des données supplémentaires 4 : file conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Des données supplémentaires 5 : file importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le volume est un paramètre important concernant les caractéristiques physiologiques et pathologiques des cellules. Nous décrivons une méthode d’exclusion fluorescent permettant la mesure de plein champ en vitro neuronale volume avec Sub micrométrique résolution axiale requise pour l’analyse des neurites et des structures dynamiques, impliqués dans la croissance neuronale.

Haute résolution Volume Imaging de neurones par l’eXclusion de l’utilisation de la Fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

L’objectif global de cette procédure est de permettre la mesure en plein champ du volume neuronal in vitro avec une résolution axiale submicrométrique requise pour l’analyse des neurites dans les structures dynamiques impliquées dans la croissance neuronale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences cellulaires concernant la dynamique des changements de volume à l’échelle filiale lors de la non-croissance ou de la dégénérescence axonale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une résolution axiale submicrométrique combinée à une observation complète de l’ajustement et à une échelle de temps de l’ordre de l’heure ou du jour.Pour commencer la procédure, démoulez le bloc PDMS sous une hotte chimique en versant de l’isopropanol dessus. Ensuite, placez-le sur le banc en acier inoxydable de la hotte. Découpez autour de la plaquette de silicone et démoulez la réplique PDMS.Ensuite, coupez autour de la puce et laissez une marge de deux millimètres à l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir. Perforez l’entrée en appuyant fermement sur le perforateur de 1,5 millimètre de diamètre et actionnez-le afin de couper et de sculpter le trou de l’entrée. Faites de même au niveau des quatre zones dédiées de la puce où le liquide sera injecté.Ensuite, nettoyez la puce en collant et en décollant le ruban adhésif sur le côté microstructuré. Saupoudrer d’isopropanol des deux côtés. Ensuite, séchez la copeau avec de l’azote sous pression à l’aide d’une soufflette à air.Dans cette procédure, placez chaque lamelle sur une machine à revêtir située dans un environnement de salle blanche. Appliquez une goutte de résine photosensible positive pour couvrir environ 75 % de la lamelle et essorez la couche à 4000 tr/min pendant 30 secondes pour atteindre une épaisseur finale de 0,45 micromètre. Placez les lamelles sur une plaque chauffante avec une température de surface de 115 degrés Celsius pendant une minute.À l’aide d’un aligneur de masque, exposez chaque lamelle à une longueur d’onde de 435 nanomètres à travers le masque dédié selon les paramètres du fabricant. Ensuite, préparez deux plats de cristallisation en verre, l’un contenant le révélateur sans dilution, l’autre contenant de l’eau déminéralisée. Trempez les lamelles une à une dans le révélateur pendant une minute tout en remuant continuellement et doucement le plat de cristallisation.Ensuite, plongez la plaquette dans de l’eau déminéralisée pendant environ cinq secondes. Transférez la plaquette sur un papier absorbant et séchez-la avec de l’azote sous pression à l’aide d’une soufflette à air. Placez à la fois la puce PDMS et la parabole en verre sur laquelle elle sera collée dans la chambre à plasma pour l’activation de surface.Ensuite, déposez une goutte d’eau sur une lame de verre de microscope rectangulaire épaisse et collez la lamelle sur la lame de verre par capillarité. Au microscope, marquez l’emplacement des bandes de résine photosensible à l’arrière de la lame de verre. Placez la lamelle en verre à motifs sur le porte-masque de l’aligneur de masque.Fiez-vous à la marque faite pour centrer les objets de référence photorésine. Pour augmenter le contraste optique, placez une plaquette de silicium sous la puce PDMS. La plaquette de silicium doit rester fermement fixée sur le mandrin pendant le processus d’alignement.Ensuite, placez la puce PDMS sur le support de substrat mobile de l’aligneur de masque. Par la suite, soulevez suffisamment le mandrin pour visualiser à la fois la puce et l’ensemble de bandes photosensibles situées sur la lamelle de recouvrement tout en restant derrière le contact mécanique. Effectuez l’alignement et réalisez un contact mécanique entre la puce et la lamelle en soulevant le mandrin jusqu’à ce que la surface des piliers PDMS touche la lamelle en verre.Après cela, abaissez le mandrin. Retirez la lamelle collée à la puce du porte-masque. Ensuite, placez l’appareil dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et transférez le tout dans le four pendant cinq à dix minutes pour augmenter la force de liaison.Trente minutes après le collage, placez une pointe de pipette de dix microlitres remplie de solution PLO à l’entrée. Ensuite, chargez le liquide jusqu’à ce qu’il forme une goutte sur le dessus. Répétez la même opération à la sortie et aux réservoirs.Par la suite, ajoutez du PBS dans la boîte de Pétri tout autour de la puce. Scellez la boîte de Pétri avec un film de paraffine et incubez à température ambiante avec un minimum de cinq heures. Ensuite, enfoncez légèrement un cône d’embout de dix microlitres dans chaque trou d’injection et aspirez l’excès de liquide.Ensuite, remplacez PLO ainsi que le PBS entourant la puce par le milieu de culture. Ensuite, placez la puce dans l’incubateur régulé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les neurones s’ensemencent avec un minimum de cinq heures de temps d’incubation. Dans cette procédure, prélevez le milieu de culture à partir de la puce.Récupérez deux à trois microlitres de la solution cellulaire fraîchement remise en suspension et injectez-la à l’entrée. Répétez immédiatement la même opération à la sortie. Injecter à peu près le même volume de milieu de culture dans chaque réservoir.Observez rapidement la puce au microscope pour vérifier la densité des cellules. L’ordre de grandeur de la densité cellulaire optimale correspond à environ cinq à dix cellules à l’intérieur de la surface carrée délimitée par quatre piliers. Répétez la procédure d’injection de 0,5 à 1 microlitre de suspension cellulaire pour atteindre la densité cellulaire ciblée.Pour l’imagerie, remplacez le milieu de culture par le milieu d’imagerie. Ensuite, placez la puce sous un microscope à épifluorescence. Acquérir des images de cellules à partir d’une ou de plusieurs images successives dans le cas d’expériences en accéléré.Voici les observations représentatives d’une bande de photorésine d’étalonnage et de neurones. Des images à fort grossissement et des coupes transversales de ces objets sont affichées sur la droite. Les neurites représentatives et une chambre centrale de trois micromètres de haut sont montrées ici.Le volume de la tranche de neurite peut être calculé en fonction de la largeur du neurite. Et voici les cônes de croissance représentatifs et une chambre centrale de trois micromètres de haut. Leurs sous-structures émergent clairement d’un bruit de fond optique d’environ 20 nanomètres.Des observations en accéléré de neurones d’actes de vie sont ensemences dans une chambre de 12 micromètres de haut pour suivre le cycle de rétrécissement et de réactivation du cône de croissance sur une échelle de temps de quelques dizaines de minutes. Lors de cette procédure, il est important d’avoir accès à un équipement de gravure ionique profonde pour fabriquer la boue de silicium. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’aligner une lamelle en verre structuré avec une puce PDMS.Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée de manière reproductible à la quantification de la neurologie en 3D. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la pharmacologie pour explorer l’effet de divers médicaments de calibre réel, tous en forme de cône fermé. N’oubliez pas que travailler avec les neurones primaires nécessite beaucoup de soin pour éviter la contamination et les éclatements.Soyez toujours doux et rapide lorsque vous changez de support afin de limiter le temps qu’ils passent à l’extérieur de l’incubateur.

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Découvrez une méthode d'exclusion fluorescente pour l'imagerie volumique de neurones avec une résolution axiale submicrométrique. Cette technique permet d'analyser les dynamiques des neurites et des cônes de croissance in vitro.

Haute résolution Volume Imaging de neurones par l’eXclusion de l’utilisation de la Fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques (Vidéo) | JoVE Journal

Haute résolution Volume Imaging de neurones par l’eXclusion de l’utilisation de la Fluorescence méthode et dédié des dispositifs microfluidiques

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