Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera

L’objectif général de cette expérience est de stadifier les périodes nymphales et de mesurer la pigmentation des ailes de Drosophila guttifera. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie évolutive du développement, telles que la façon dont les modèles de pigmentation sont développés chez la drosophile. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir des informations détaillées sur le développement morphologique et le processus de pigmentation.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement morphologique et du processus de pigmentation de Drosophila guttifera, elle peut être appliquée à d’autres espèces de drosophiles. Pour commencer l’élimination du puparium, fixez un morceau de ruban adhésif double face sur un morceau d’essuie-tout. Placez une chrysalide sur le ruban adhésif double face, côté ventral vers le haut.

Localisez l’espace entre la face antérieure du puparium et la nymphe interne. Saisissez et retirez le puparium autour de cet espace à l’aide d’une pince. Et exposez la face antérieure de la tête de la nymphe.

Insérez la pointe d’une pince en la déplaçant parallèlement à l’axe antéro-postérieur. Soulevez la pointe de la pince pour briser localement le puparium. Répétez cette action jusqu’à ce que la rupture atteigne la partie postérieure du puparium.

Assurez-vous qu’un espace est formé entre le puparium et les pattes nymphales. Et casser la face ventrale du puparium tout en minimisant les dommages à la nymphe interne. Après avoir cassé le puparium autant que possible, retirez la chrysalide à l’aide d’un pinceau fin.

Placez la chrysalide sur un morceau de papier de soie qui a été humidifié avec du ddH2O et placé dans une boîte de Pétri en plastique. Prenez immédiatement des photos, car la chrysalide exposée est vulnérable et sèche facilement. Procédez à la préparation de l’image et retirez la partie antérieure du puparium à l’aide d’une pince.

Sortez la chrysalide et placez-la dans une solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, dans une boîte de Pétri en plastique. Ensuite, coupez l’articulation basale d’une aile. Au fur et à mesure que l’aile est pliée, placez-la dans une boîte de Pétri en plastique remplie de ddH2O pour l’étendre par pression osmotique.

Récupérez les adultes nouvellement enfermés une fois toutes les 10 minutes à partir d’un fichier de stock. Anesthésie une mouche à l’aide d’un tampon anesthésiant au CO2. Confirmer l’anesthésie par immobilité et couper l’articulation basale d’une aile.

Déposez 10 microlitres de PBS sur une lame de verre. Placez l’aile dans la goutte. Et couvrez la goutte avec un lamelle.

Ensuite, allumez la lumière du stéréomicroscope et réglez-la au maximum. Réglez l’objectif sur 11,5x et réglez le diaphragme sur l’état le plus ouvert. Ensuite, allumez l’appareil photo et réglez-le.

Faites la mise au point sur l’échantillon en déplaçant le bouton de mise au point du microscope. Appuyez sur le déclencheur de la télécommande pour prendre une image. Prenez une image de l’aile, centrée sur un sensillum campaniforme, en positionnant la partie distale de l’aile sur le côté gauche et la partie intérieure de l’aile sur la face supérieure.

Ouvrez une image avec une tache sensillum campaniforme au centre. Cliquez sur Image, Tapez 1, 8 bits, pour convertir l’image en image 8 bits. Cliquez sur le rectangle dans les outils de sélection de zone et dessinez un rectangle.

Placez le côté droit du rectangle de manière à ce qu’il soit situé à droite de la tache sensillum campaniforme. Cliquez sur Modifier, Sélectionner, Ajouter au gestionnaire, puis cochez la colonne Afficher tout. Ensuite, cliquez sur l’outil d’angle dans les outils de sélection de ligne.

Tracez la première ligne sur la ligne postérieure de la troisième veine longitudinale. Placez les extrémités gauches de la ligne sur le sommet du rectangle précédemment dessiné. Tracez la deuxième ligne sur le côté supérieur du rectangle.

Appuyez sur la touche M pour mesurer l’angle entre les deux lignes tracées dans cette étape. Cliquez sur la fenêtre de l’image sur l’écran de l’ordinateur. Cliquez sur Modifier, Sélectionner, Ajouter au gestionnaire.

Cliquez sur le rectangle dans les outils de sélection de zone et dessinez un rectangle d’environ 1/9e de la taille de la fenêtre de l’image. Cliquez sur Modifier, Sélectionner, Pivoter. Écrivez les degrés négatifs de l’angle précédemment mesuré dans la colonne Angle et cliquez sur OK pour faire pivoter le rectangle dessiné dans cette étape.

Déplacez le rectangle dessiné à l’aide des touches fléchées et définissez l’extrémité de la ligne postérieure de la deuxième veine longitudinale sur le côté gauche du rectangle. Et le côté inférieur du rectangle, attachez-vous à la ligne postérieure de la troisième veine longitudinale. Confirmer qu’une ligne perpendiculaire entre l’extrémité de la deuxième veine longitudinale et la ligne postérieure de la troisième veine longitudinale a été tracée.

Définissez le pied de la droite perpendiculaire comme le point A.Enregistrez la coordonnée X et la coordonnée Y du point A, indiquées sous Outils de sélection de zone lorsque vous placez le curseur sur le point A.Ouvrez l’image avec le point A au centre. Cliquez sur Image, Type, 8 bits, pour convertir l’image en image 8 bits. Cliquez sur le rectangle dans les outils de sélection de zone et dessinez un rectangle d’environ 1/9e de la taille de la fenêtre de l’image.

Cliquez sur Modifier, Sélectionner, Spécifier. Vérifiez Colonne ovale et centrée. Écrivez 100 pixels dans les colonnes largeur et hauteur.

Écrivez les coordonnées X du point A dans la colonne des coordonnées X et les coordonnées Y du point A dans la colonne des coordonnées Y, puis cliquez sur OK. Ensuite, cliquez sur Analyser et mesurer. Si l’étalonnage est déjà terminé, les DO sont indiqués dans la colonne Moyenne. La comparaison des données de plusieurs stades a révélé que le stade P12 est le moment du début de la pigmentation et que la pigmentation est terminée 12 heures après l’éclosion.

Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie évolutive du développement pour explorer les différences dans le développement des nymphes et le processus de pigmentation entre les espèces de drosophiles.