Name: Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Apprenez à mettre en scène les périodes nymphales et à mesurer la pigmentation des ailes chez Drosophila guttifera. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes développementaux des traits adultes et les adaptations évolutives.

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Nous remercions Sean B. Carroll et Thomas Werner pour fournir des stocks de mouche, Naoyuki fusible pour l’équipement, Byung Seok Jin pour son aide dans le tournage, Kiyokazu Agata de mentorat et Elizabeth Nakajima pour l’édition anglaise. Ce travail a été soutenu par KAKENHI 17K 19427 et Takeda (FNS).

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Nous décrivons ici les protocoles pour la définition des étapes pupes, enlevant le puparium pour l’observation détaillée, mesure des durées des stades nymphales et mesure de l’intensité des taches noires sur une aile dans d. guttifera. Ces protocoles peuvent être appliquées pour les nombreux Drosophila et des espèces, en particulier les espèces avec la pigmentation de l’aile.
Observation approfondie et une description plus détaillées des événements du développement permettrai...

Certains des traits morphologiques de la drosophile sont diversifié en fonction des espèces1,2,3,4,5. Nous pouvons aborder la question de la diversité morphologique comment se pose en comparant les mécanismes de génération de ces morphologies. Trichomes larvaires, peignes de sexe adulte, appareil génital externe, pigmentation cutanée abdominale et aile pigmentation6,7,8,9, sont des exemples de ces morphologies 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. afin d’étudier les différences morphologiques entre les adultes, observation et analyse des stades nymphales sont importantes, car le sort des traits adultes est déterminé dans les derniers stades larvaires et morphogenèse ultérieure procède au cours de la période nymphale.
Dans des études de biologie du développement de Drosophila melanogaster, « heures CSA » (heures après la formation de la pupe) est la méthode couramment utilisée pour indiquer une chrysalide16. Ce système emploie temps absolu après formation de la pupe et est très pratique pour des expériences courantes. Cependant, vitesse du développement peut-être différer chez les nymphes et peut être affectée par légères différences génétiques, épigénétiques ou micro-environnementales, et par conséquent avoir le même temps absolu après formation de la pupe ne garantit pas que les nymphes sont dans le même stade de développement. Dans de nombreux cas, les étapes définies par les caractéristiques morphologiques sont préférables pour comparer plusieurs personnes. En particulier, une comparaison entre les espèces nécessite mise en scène précise et comparaison entre les étapes (homologues) correspondantes.
Bainbridge et Bownes17 reconnu 20 stades nymphales (P1 à P15(ii)) basé sur des caractéristiques morphologiques des pupes de Drosophila melanogaster . Cette mise en scène est le plus largement utilisé de la mise en scène du développement morphologique18. Dans une étude précédente, nous avons effectué pupal mise en scène de Drosophila guttifera pour établir une base pour aile pigmentation études19. D. guttifera a pois noir sur ses ailes et est l’un de l’espèce modèle pour aile pigmentation formation20. Bien que nous avons évoqué les critères morphologiques décrits dans le Bainbridge et 'Bownes recherche17, nous avons mesuré directement durées étape par observations série19, au lieu d’utiliser Bainbridge et Bownes' estimation de la durée de l’étape de la fréquence observée. Nous décrivons ici la méthode de mise en scène pupe et de mesure des durées des stades nymphales de Drosophila utilisé dans Fukutomi et al.,19.
Pour étudier le mécanisme du développement de la pigmentation de l’aile, nous avons besoin de savoir quand les stades nymphales ou adultes la pigmentation se produit. Fukutomi et al. 19 quantifiée des densités optiques (ODs) de pigmentation stades nymphal et adulte par analyse d’image des images de l’aile. La pigmentation des ailes de la drosophile est pensée pour être causée par une accumulation de mélanine noire21. Pour la quantification de ces substances, échelle de gris des images et ImageJ logiciel (https://imagej.nih.gov/ij/)22 ont été utilisés. Pour reconnaître et quantifier la pigmentation spot spécifique (ΔOD), nous soustrayons l’OD en dehors d’une place de la Division d’opposition à l’intérieur d’un spot. Pour rendre cette méthode objective et reproductible, les lieux de mesure OD doivent être déterminées en utilisant des veines de l’aile comme points de repère. Dans cet article, nous décrivons en détail cette méthode de dosage de la pigmentation de la voilure dans drosophile guttifera.

<table><tbody><tr><td>Drosophila guttifera</td><td>The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego</td><td>15130-1971.10</td><td>Drosophila guttifera, une espèce de mouche des fruits utilisée dans cet article</td></tr><tr><td>Flacon en plastique</td><td>Hightech</td><td>MKC-30</td><td>Flacon en plastique, pour l’entretien du stock</td></tr><tr><td>de mouches Bouchons Buzz flacons et bouchons pour flacons en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-271</td><td>Bouchon en cellulose, pour l’entretien du stock de mouches</td></tr><tr><td>Sucre mou blanc</td><td>Sucre Mitsui</td><td>J-500g</td><td>Sucre mou blanc, pour semoule de maïs/sucre/levure/gélose standard</td></tr><tr><td>Farine de maïs</td><td>Nippon Flour Mills</td><td>F</td><td>Farine de maïs, pour semoule de maïs/sucre/levure/gélose</td></tr><tr><td>standard Gruau de maïs - C</td><td>Nippon Flour Mills</td><td>GC</td><td>Gruau de maïs - C, pour semoule de maïs/sucre/levure/gélose alimentaire standard</td></tr><tr><td>Poudre</td> <td>de géloseMatsuki Kanten Sangyo</td><td>No.602</td><td>Poudre d’agar, pour semoule de maïs/sucre/levure/agar alimentaire</td></tr><tr><td>standard Levure de bière sèche</td><td>Asahi Food & Soins de santé</td><td>Y2A</td><td>Levure de bière sèche, pour semoule de maïs/sucre/levure/gélose standard</td></tr><tr><td>P-hydroxybenzoate de butyle</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06327-02</td><td>P-hydroxybenzoate de butyle, pour semoule de maïs/sucre/levure/gélose</td></tr><tr><td>standard Éthanol</td><td>Wako</td><td>057-00456</td><td>Éthanol, pour semoule de maïs/sucre/levure/gélose</td></tr><tr><td>standard Microtube à fond plat</td><td>Ina Optica</td><td>CF-0150</td><td>Microtube de 1,5 mL, pour collecte de pupes</td></tr><tr><td>CAPSULEFUGE</td><td>Tomy</td><td>PMC-060</td><td>Mini microcentrifugeuse, pour la collecte de pupes</td></tr><tr><td>Stérilisé Schale NB</td><td>Sansei Medical</td><td>01-013</td><td>Boîte de Pétri en plastique (diamètre 90 mm x hauteur 15 mm)</td></tr><tr><td>Porte-tube de sérum</td><td>Iwaki</td><td>9796-050</td><td>Utilisé comme chambre humide, pour l’observation de la nymphe</td></tr><tr><td>Corning Falcon Plat de culture tissulaire Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Boîte de Pétri en plastique (diamètre 35 mm x hauteur 10 mm)</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire standard Falcon</td><td>Corning</td><td>353002</td><td>Boîte de Pétri en plastique (diamètre 60 mm x hauteur 15 mm)</td></tr><tr><td>Punaise</td><td>Kokuyo</td><td>51233709</td><td>Punaise, pour faire des trous d’épingle sur le couvercle du microtube</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Stéréomicroscope, pour l’observation morphologique</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Olympus</td><td>DSE-330-A</td><td>Appareil photo numérique, pour l’imagerie</td></tr><tr><td>NICETACK Ruban adhésif double face</td><td>Nichiban</td><td>NW-15SF</td><td>Ruban adhésif double face, pour enlever le puparium</td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-20</td><td>Pince, pour enlever le puparium</td></tr><tr><td>Van Gogh VISUAL Pinceau</td><td>Talens Japan</td><td>GWVR-#5/0</td><td>Pinceau, pour enlever le puparium</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Plaque de culture cellulaire 12 puits</td><td>Merck</td><td>665-180</td><td>Plaque de culture cellulaire à 12 puits, pour mesurer les durées des périodes nymphales</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>NaCl, pour PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Nacalai Tesque</td><td>285-14</td><td>KCl, pour PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot ; 12H2O</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td>Na2HPO4&middot ; 12H2O, pour PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td>KH2PO4, pour PBS</td></tr><tr><td>Filtre à densité neutre (ND) étagé 0.04 - 3.0</td><td>Edmund Optics</td><td>64-384</td><td>Filtre à densité étagée, pour l’étalonnage de la mesure de la pigmentation</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8.0-101</td><td>Logiciel ImageJ, pour la mesure de l’intensité des taches noires sur une aile (https://imagej.nih.gov)</td></tr><tr><td>FINE FROST lame de verre</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>FF-001</td><td>Lame de verre, pour la mesure de l’intensité des points noirs sur une aile</td></tr><tr><td>Verre de couverture de microscope carré 18 x 18</td><td>Matsunami Glass Ind</td><td>C018181</td><td>Fiche de protection, pour la mesure de l’intensité des taches noires sur une aile</td></tr></tbody></table>

méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de pigmentation de l’aile de drosophila guttifera

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversifié d’espèces de drosophile (mouche) offrent des possibilités d’étudier les mécanismes du développement et des modifications génétiques responsables des changements évolutifs. En particulier, le stade adulte est une source riche des traits morphologiques pour comparaison interspécifique, y compris la comparaison de pigmentation aile. Afin d’étudier les différences de développement entre les espèces, observation détaillée et mise en scène appropriée sont nécessaires pour comparaison précise. Nous décrivons ici les protocoles de mise en scène des périodes nymphales et quantification de la pigmentation chez un pois drosophile, Drosophila guttiferaaile. Tout d’abord, nous décrivons la méthode d’observation morphologique détaillée et définition des stades nymphales issu des morphologies. Cette méthode comprend une technique pour enlever le puparium, qui est le cas de chitineux externe de la chrysalide, pour permettre l’observation détaillée des morphologies pupes. En second lieu, nous décrivons la méthode pour mesurer la durée des stades nymphales définis. Enfin, nous décrivons la méthode pour la quantification de la pigmentation Escadre basée sur l’analyse d’images à l’aide d’images numériques et logiciels ImageJ. Avec ces méthodes, nous pouvons établir une base solide pour la comparaison des processus de développement des traits adultes stades nymphales.

La période de pupe de d. guttifera est divisée en 17 étapes (P1 - P15(ii) ; images représentant trois stades (P1, P5 - 6, P10) sont indiquées Figure 3et 17 toutes les étapes sont illustrées à la Figure 4). Que Bainbridge et Bownes17 reconnu 20 étapes chez d. melanogaster, certaines de ces étapes ne pourraient pas s’appliquer aux d. guttifera. L’ordre des deux événements développe...

Protocoles pour la stadification des périodes nymphales et mesure de la pigmentation de la voilure de Drosophila guttifera sont décrits. Mise en scène et la quantification de la pigmentation fournissent une base solide pour l’étude des mécanismes de développement des traits adultes et permettent la comparaison interspécifique de développement de caractère.

Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

L’objectif général de cette expérience est de stadifier les périodes nymphales et de mesurer la pigmentation des ailes de Drosophila guttifera. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie évolutive du développement, telles que la façon dont les modèles de pigmentation sont développés chez la drosophile. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir des informations détaillées sur le développement morphologique et le processus de pigmentation.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du développement morphologique et du processus de pigmentation de Drosophila guttifera, elle peut être appliquée à d’autres espèces de drosophiles. Pour commencer l’élimination du puparium, fixez un morceau de ruban adhésif double face sur un morceau d’essuie-tout. Placez une chrysalide sur le ruban adhésif double face, côté ventral vers le haut.Localisez l’espace entre la face antérieure du puparium et la nymphe interne. Saisissez et retirez le puparium autour de cet espace à l’aide d’une pince. Et exposez la face antérieure de la tête de la nymphe.Insérez la pointe d’une pince en la déplaçant parallèlement à l’axe antéro-postérie

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Variation phénotypique des traits peut résulter de mutations dans le cis-régulation élément (CRE) des séquences que les modèles de contrôle l'expression des gènes. Méthodes pour une utilisation dérivée de Drosophila melanogaster peuvent comparer quantitativement les niveaux de la répartition spatiale et temporelle de l'expression génique médiée par des variantes de la CRE modifiés ou naturelle.

Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Une méthode pour visualiser les organes et immunocoloration chordotonaux chez les larves et des pupes...

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Cet article décrit une technique permettant d’enlever le puparium d’un insecte tout en gardant la nymphe intérieure intacte et donc apte à une investigation plus approfondie. L’exemple de protocole montre la procédure avec Drosophila guttifera ; cependant, cette technique est applicable à d’autres espèces de drosophiles.

L’élimination des pupariums d’insectes : une méthode d’investigation des nymphes

Ce document illustre l'utilisation d'un balayage rapide microscope confocal à un comportement cellulaire de l'image directement à travers la pupe. En laissant la coque de nymphose intacte, cette méthode permet l'observation et la mesure des processus dynamiques de cellule à un stade de développement de la drosophile qui est difficile à étudier directement.

Imagerie à travers le cas de la nymphe<em&gt; Drosophila melanogaster</em

La capacité de détecter avec précision les relevés de notes ou de protéines dans les tissus de la drosophile est critique pour étudier leur abondance et leur localisation liées au processus de développement. Voici la description d’une procédure simple pour disséquer les ailes pupes. Ces ailes peuvent être utilisées comme échantillons dans plusieurs techniques (immunohistochimie, PCR assay, etc.).

Une méthode rapide et efficace de disséquer les ailes Pupal de Drosophila adapté aux Immunodetections ou des analyses par PCR

L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Nous présentons ici une méthode facile à utiliser et polyvalente pour exécuter direct imaging des processus de développement en général et muscle-tendon morphogenèse en particulier la vie pupes de drosophile .

In Vivo Imagerie de la morphogénèse du Muscle-tendon en pupes de drosophile

Ce protocole est conçu pour évaluer la viabilité de la drosophile à chaque stade de développement, de l'embryon à l'adulte. La méthode peut être utilisée pour déterminer et comparer la viabilité de différents génotypes ou conditions de croissance.

Une méthode directe et simple pour évaluer la viabilité du mélanogaster de Drosophilade l'embryon à l'adulte

Ce protocole est conçu pour l’imagerie et l’analyse de la dynamique de l’orientation cellulaire et de la croissance des tissus dans l’épithélie abdominale Drosophila que la mouche des fruits subit une métamorphose. La méthodologie décrite ici peut être appliquée à l’étude de différents stades de développement, tissus et structures subcellulaires dans Drosophila ou d’autres organismes modèles.

Imagerie et analyse de l’orientation tissulaire et de la dynamique de croissance dans l’épithélie de drosophile en développement pendant les stades pupal

Ici, un protocole est présenté pour l’imagerie en direct à long terme de la patte de la drosophile pendant le stade nymphal, impliquant l’ablation complète du puparium. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres tissus.

Imagerie en direct à long terme du développement de la patte de la drosophile après l’ablation du puparium

La drosophile est un modèle puissant pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la myogenèse. Ce protocole de dissection et de préparation des hémisections du thorax permet l’analyse microscopique des muscles en vol indirect à partir des stades nymphal et adulte. Ce protocole permet l’imagerie confocale de la morphologie cellulaire, de la localisation des protéines, de la structure musculaire et de multiples autres aspects de la myogenèse.

Dissection des muscles de vol indirect de Drosophila melanogaster pour les approches microscopiques

Apprenez à mettre en scène les périodes nymphales et à mesurer la pigmentation des ailes chez Drosophila guttifera. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes développementaux des traits adultes et les adaptations évolutives.

Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera

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