Visualisation dynamique de Lignification chez les plantes à la chimie de clic : double étiquetage est le bonheur !

L’objectif global de cette méthodologie de double marquage est d’observer les zones de lignification active des tissus végétaux. Dans ce flux de travail, la stratégie de rapporteur chimique est appliquée à l’aide de deux rapporteurs chimiques distincts dans une combinaison séquentielle de réactions de chimie clic bio-orthogonale. Cette méthode peut aider à déchiffrer des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que la détermination des facteurs qui régulent la formation spatiale ou temporelle de la lignine dans les plantes et les parois.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle cible exclusivement la lignine produite lors de l’incorporation métabolique. Il la différencie de toute lignine préexistante dans l’échantillon. Bien que nous ayons développé à l’origine cette méthode pour étudier les drapeaux de lignification, elle pourrait être utilisée avec d’autres espèces telles que l’arabidopsis, le peuplier ou même toute autre plante produisant de la lignine.

Pour présenter cette technique, nous avons Clémence Simon qui est doctorante et qui travaille à l’interface entre la chimie et la biologie et qui utilise cette technique pour étudier la dynamique de la lignification. Tout d’abord, préparez une solution de rapporteur chimique de 300 microlitres contenant dix micromuller de G rapporteur marqué à l’alkine. Et dix micromüller de H reporter marqué à l’azide et de milieu 1/2 MS stérile liquide.

Vortex la solution et transférez-la dans un puits d’une plaque de 48 puits à l’aide d’une pipette de transfert. Préparez une solution de contrôle négatif de 300 microlitres contenant dix micromuller de G et dix micromuller de H et un milieu liquide stérile 1/2 MS. Vortex la solution et transférez-la dans un deuxième puits de la même plaque de 48 puits.

À l’aide d’une lame de rasoir propre, coupez la tige d’un plant de lin de deux mois à dix centimètres au-dessus du niveau du sol. Préparez diligemment 50 sections transversales transversales à main levée de la tige à l’aide de la lame de rasoir et placez-les immédiatement dans un milieu 1/2 MS. Ensuite, sélectionnez des coupes transversales entières intactes et répartissez-en dix au hasard dans le puits rempli de solution de rapporteur chimique, en prenant soin de ne pas endommager les tissus.

Les sections transversales doivent être coupées fermement et proprement et la section transversale doit être droite. Vous avez besoin d’une main ferme et d’une lame de rasoir tranchante afin de garder les tissus intacts. Il est conseillé de s’entraîner au préalable.

Après avoir distribué dix sections efficaces intactes dans la solution de contrôle négatif, incuber la plaque à la lumière continue dans une chambre de croissance à 20 degrés Celsius pendant 20 heures. Le lendemain, prélever la solution monollignale dans chaque puits à l’aide d’une micropipette. Ajoutez 500 microlitres de 1/2 MS de milieu dans chaque puits et remuez doucement pendant dix minutes.

Ensuite, retirez la solution de rinçage à l’aide d’une micropipette. Préparez un millilitre d’une solution de cycloaddition azide-alkine promue par souche. Contenant cinq micromuller de colorant fluorescent marqué au cyclooctène et un milieu 1/2 MS stérile liquide.

Ensuite, vortex la solution. Après les dernières étapes de lavage du protocole d’incorporation métabolique, retirez le milieu 1/2 MS et ajoutez 300 microlitres de la solution SPAAC dans chaque puits à l’aide d’une micropipette. Protégez la plaque de 48 puits de la lumière en la plaçant dans une boîte.

Ensuite, remuez doucement la plaque sur un agitateur mécanique pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante. Ensuite, lavez chaque puits quatre fois avec 1/2 MS de médium comme décrit précédemment, tout en gardant l’assiette dans l’obscurité. Préparez un millilitre de solution de cycloaddition d’alkine catalysée par le cuivre contenant de l’ascorbate de sodium, du sulfate de cuivre et un colorant fluorescent marqué à l’azide, ainsi qu’un milieu 1/2 MS stérile.

Ensuite, vortex la solution. Après avoir retiré le milieu 1/2 MS, placez la plaque dans une boîte et ajoutez 300 microlitres de la solution CuAAC dans chaque puits à l’aide d’une micropipette. Remuez doucement la plaque sur un agitateur mécanique pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante.

Retirez la plaque de l’agitateur mécanique et retirez la solution CuAAC de chaque puits à l’aide d’une micropipette. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu 1/2 MS et remuez la plaque sur l’agitateur mécanique pendant dix minutes dans l’obscurité. Après avoir lavé deux fois de plus avec un milieu 1/2 MS, ajoutez 500 microlitres d’une solution de méthanol 7:3 et d’eau dans chaque puits.

Remuez la plaque sur le shaker mécanique pendant une heure dans l’obscurité. Ensuite, retirez la solution des puits. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de milieu 1/2 MS dans chaque puits et remuez dans l’obscurité pendant dix minutes.

Après avoir répété ce lavage quatre fois, conservez les sections transversales dans un support 1/2 MS, à l’abri de la lumière. Placez cinq gouttes de support de montage sur une lame de microscope en verre. Ensuite, déposez soigneusement chaque section transversale marquée d’un rapporteur chimique sur la lame.

Appliquez le vernis à ongles sur deux côtés opposés de la lame. Couvrez la diapositive avec une lamelle, en prenant soin d’éviter les bulles d’air. Ensuite, retirez l’excès de support de montage à l’aide d’une serviette en papier.

Ensuite, scellez l’échantillon avec du vernis à ongles sur les quatre côtés. Une fois le vernis à ongles sec, conservez les lames à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’observation au microscope confocal. Les sections de plantes ont tendance à devenir croustillantes lorsqu’elles sèchent.

Assurez-vous de toujours les garder en solution et de sceller les lamelles avec du vernis à ongles sur tous les côtés. Il augmente la durée de conservation des diapositives montées. Placez la lame d’échantillon sur la platine du microscope sous l’objectif de l’objectif.

Observez et faites tourner l’échantillon pour identifier la région souhaitée du tissu végétal. Ensuite, sélectionnez le plan le plus fluorescent sur l’axe Z. Ajustez le gain, le décalage et la puissance laser pour obtenir une distribution optimale du signal sur toute la plage de niveaux de gris pour chaque canal.

Enfin, obtenez des images confocales de haute qualité. BLISS fournit trois cartes de localisation en couleur de la lignine dans les parois cellulaires végétales, cible exclusivement la lignine produite en novo lors de l’incorporation métabolique et la différencie de la lignine préexistante dans l’échantillon. Il met en évidence les sites de lignification actifs dans différents tissus d’un organe, dans différents types de cellules d’un tissu, ou dans différentes couches de paroi ou sous-structures d’une cellule.

Les profils d’incorporation du rapporteur G marqué à l’alkine et au H marqué à l’azide du cambium à la moelle dans le xylème secondaire du lin indiquent que la lignification maximale est rapidement atteinte dans les trachéides à fibres au cours du développement, tandis que les cellules raciales continuent d’incorporer la lignine à des stades beaucoup plus tardifs de leur vie. La variation du rapport rapporteur chimique démontre que la composition de la lignine dans les tissus secondaires du xylème dépend directement de la disponibilité monolignale dans les parois cellulaires. Plutôt que sur la spécificité de la peroxydase ou de la laccase lors de la polymérisation de la lignine.

L’incorporation de rapporteurs chimiques est limitée aux coins cellulaires et à la paroi cellulaire primaire de certaines fibres libériennes, mais pas toutes. Dans les racines de lin, les rapporteurs chimiques sont incorporés dans les parois des cellules endodermiques où la bande casparienne est absente. Pour une meilleure visualisation de l’architecture tissulaire, des reconstructions d’empilement 3D Z peuvent également être générées.

Suite à ce visuel, un traitement complet des données peut également être effectué. Toutes précautions prises, il est possible d’obtenir des résultats constants par comparaison relative, en lisant un échantillon entre différents échantillons. Cela peut être fait en plus de la localisation de la direction active de différentes zones.

Cette méthode est un outil merveilleux pour les biologistes des plantes comme moi qui étudient la paroi cellulaire. Une fois maîtrisé, cela peut être fait en quelques heures. Il est très sensible et peut être appliqué à toute une gamme de différents systèmes de modèles expérimentaux in vivo in vitro.

L’application de la stratégie du rapporteur chimique à la lignine permet au biologiste chimiste d’explorer la dynamique de la lignification et de découvrir ce qui contrôle ce processus de polymérisation, qui constitue encore à bien des égards un territoire inexploré.