Visualisation des leucocytes de roulement et l’adhérence à l’angiotensine II infusé souris : Techniques et pièges

L’objectif global de ce protocole de vidéomicroscopie intravitale à épifluorescence, ou IVM, des vaisseaux sanguins est de visualiser et de quantifier le roulement et l’adhésion des leucocytes dans les artères corrodées dans l’hypertension induite par l’angiotensine II chez la souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la pathologie de la dysfonction vasculaire et de l’hypertension artérielle telles que le mécanisme d’interaction entre les leucocytes et en particulier les lysosomes et les cellules positives, et le fonctionnement des vaisseaux. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons voir les interactions in vivo entre les cellules sanguines circulantes et la compréhension vasculaire.

Préparez une souris mâle pour la chirurgie après sept jours de traitement à l’angiotensine deux avec une pompe osmatique selon le texte protol. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les protéger pendant la procédure. Placez l’animal anesthésié en décubitus dorsal sur une plaque chirurgicale à 39 degrés Celsius et insérez une sonde rectale pour maintenir la température.

Utilisez un coton-tige pour étaler et frotter la crème dépilatoire sur le cou jusqu’à ce que les poils commencent à tomber. Ensuite, après 2 minutes supplémentaires, utilisez une spatule pour enlever les poils et la crème. Ensuite, désinfectez la peau à l’aide d’un antiseptique cutané alcoolique.

Ensuite, au stéréomicroscope, faites une incision longitudinale de 1 à 1,5 cm dans la peau du cou, à 1 cm de la trachée. Ensuite, faites 2 incisions perpendiculaires à chaque extrémité de la première incision. Retirez soigneusement le tissu juste sous la peau et retirez le morceau de peau recouvrant la veine jugulaire gauche et la trachée.

Ensuite, à l’aide de deux pinces incurvées, isolez soigneusement les glandes sublinguales et sous-maxillaires corrodées de la zone d’intérêt. Tout en prenant soin de ne pas couper ou endommager les glandes, positionnez-les de manière à permettre le meilleur accès à la veine jugulaire et aux cornures. Ensuite, pour isoler la veine jugulaire, insérez une pince mince entre le vaisseau et les tissus environnants, puis ouvrez et fermez lentement l’instrument pour libérer doucement la veine du tissu.

Une fois que la veine jugulaire est complètement propre, placez la pince sous le vaisseau et placez deux sutures 7-0 de 10 cm de long en dessous. Faites deux nœuds pour fermer la suture à proximité de la tête et avec la deuxième suture, préparez un nœud, mais ne le fermez pas. Maintenant, avec une pince dans une main, tenez le cathéter rempli de solution saline stérile à 37 degrés Celsius, puis de l’autre main, utilisez des ciseaux ou une aiguille incurvée de calibre 26 pour faire une petite incision dans le vaisseau.

Insérez le cathéter dans la veine jugulaire et fermez le nœud deux fois. Ensuite, fermez la suture proximale à la tête au-dessus du cathéter pour assurer une immobilisation complète. Pour isoler et préparer les artères corrodées, utilisez une pince mince et incurvée pour disséquer la zone recouvrant la trachée.

Ensuite, une fois que les corrodés sont libres des tissus environnants, retirez le nerf vegas du vaisseau sans le couper, en fermant et en ouvrant lentement la fine pince, si nécessaire, pour mobiliser doucement le nerf. Une fois que les deux artères sont complètement propres, placez la pince sous la première artère corrodée et, tout en prenant soin de ne pas trop étirer le vaisseau, placez un petit support de vaisseau en plastique noir de 3 mm sur 2,5 cm sous le vaisseau. Une fois le porte-vaisseau en place, assurez-vous que le flux sanguin est présent.

Pour éviter d’étirer le vaisseau, la main de l’opérateur doit bouger le moins possible avec un seul mouvement de la première pince pour isoler l’artère corrodée et à l’aide de la deuxième pince pour faire un trou sous le vaisseau. Lorsque le support de vaisseau est correctement positionné, placez la deuxième artère sur l’appareil. Si la souris n’est pas placée directement sous le microscope, replacez les glandes sur la trachée et appliquez une solution saline stérile à 37 degrés Celsius pour éviter l’assèchement de la zone.

Dans une seringue de 1 ml, préparer une dilution de 1 à 4 dans une solution saline stérile, d’une solution mère décongelée de 2 mg par mL d’orange âcridine. Protégez la seringue de la lumière. Pour effectuer des mesures, placez la souris sous un microscope à fluorescence à grande vitesse et à grand champ à l’aide d’un condenseur longue distance et d’un objectif à immersion dans l’eau 10x avec un monochromate, un séparateur de faisceau et une caméra CCD.

Acquérez des images en temps réel en focalisant l’objectif au milieu de l’artère corrodée à la surface endothéliale. Injectez lentement 50 ml d’orange acridine. Ensuite, réglez le logiciel pour qu’il enregistre 100 images, avec un temps d’exposition de 120 millisecondes par image.

Enregistrez quatre vidéos par artère corrodée à différents endroits de l’artère pour chaque vidéo. Si le signal fluorescent diminue, injectez 50 ml d’orange acridine supplémentaire. Pour tester différentes conditions, injectez l’orange acridine directement dans la veine latérale de la queue si un cathéter jugulaire n’a pas été inséré, et effectuez la même acquisition d’image.

Comme contrôle, enregistrez les mesures de florescence de souris lys-Mcre positives et IRG positives non injectées. Quantifiez les cellules de roulement et d’adhérence dans une vue rectangulaire de 200 microns par 250 microns placée au milieu de la cuve pour chaque vidéo, affichée à une vitesse de 10 images par seconde. Comptez les cellules de roulement et d’adhérence.

Les cellules d’adhérence sont définies comme des cellules qui ne bougent pas ou ne se détachent pas de l’endothélium dans la vidéo de 10 secondes. Pour simplifier la quantification, retirez le canal avec la fluorescence rouge et utilisez uniquement la fluorescence verte pour compter les cellules roulantes et adhérentes. Dans cette étude, les corrodescences de souris lys-mCre positives et IRG positives perfusées avec de l’angiotensine 2 ont été observées à l’aide de l’IVM.

Comme on l’a vu ici au départ, la présence d’un cathéter jugulaire a entraîné l’adhésion de cellules fluorescentes lys-M-positives. Après l’injection d’orange d’acridine, les cellules endothéliales étaient également fluorescentes. Ensuite, la réduction du bruit de fond pour limiter la fluorescence liée à l’endothélium a révélé que toutes les cellules adhérentes nucléées étaient positives pour le lys-M.

Dans cette expérience, après une semaine de perfusion d’angiotensine 2, les interactions de l’endothélium leucocytaire dans les artères corrodées de souris lys-M Cre-positives IRG positives, ont été imagées et visualisées par IVM, avec ou sans injection d’orange d’acridine, via un cathéter jugulaire ou à travers la veine de la queue. Sans cathéter ni injection, le roulement des cellules lys-M positives a augmenté de manière significative après la perfusion d’angiotensine 2, par rapport aux souris non traitées. Et l’adhérence a également été augmentée.

L’injection d’orange acridine avec un cathéter jugulaire a augmenté l’adhérence et le roulement chez les souris traitées à l’angiotensine 2, dans une plus grande mesure que chez les souris sans cathéter. Enfin, comme on le voit dans ces panneaux, l’injection d’orange d’acridine dans la veine de la queue conduit à une adhérence et à un roulement similaires par rapport aux souris qui n’ont pas reçu d’injection d’orange d’acridine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une trentaine de minutes si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas endommager les tissus entourant les vaisseaux. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans les domaines cardiovasculaire et hémostatique pour explorer les leucocytes et l’adhésion plaquettaire à la paroi vasculaire in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de limiter l’impact de l’injection de colorant et de la chirurgie dans la MIV.

N’oubliez pas que travailler avec des colorants fluorescents intercalaires peut être extrêmement dangereux et que le contact de la peau avec le colorant doit être évité avec le matériau approprié, comme des gants.