Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

L’objectif global de ce protocole est d’isoler et de caractériser des microparticules dérivées de neutrophiles pour des études fonctionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle des vésicules exocellulaires, ou microparticules, dans la communication cellule-cellule dans différents processus physiologiques, notamment le cancer, l’inflammation et la cicatrisation des plaies. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement rapide, rentable et qu’elle permet de valoriser la composition p’hénotypique des microparticules, ou micro-vésicules, en actifs fonctionnels.

Ariel Finkielsztein, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, et Joseph Lee, étudiant de premier cycle dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour la séparation par gradient de densité des cellules polymorphonucléaires de moelle osseuse murine, ou PMN, superposez d’abord lentement trois millilitres de solution fraîchement préparée, à température ambiante, 1,077 gramme par millilitre sur trois millilitres de solution fraîchement préparée, à température ambiante, 1,119 gramme par millilitre dans un tube conique de 15 millilitres par échantillon de cellules de moelle osseuse. Ensuite, superposez un millilitre de cellules de moelle osseuse fraîchement isolées dans du PBS glacé sur la couche supérieure de gradient de densité de chaque tube, et séparez les cellules par centrifugation par gradient de densité.

À la fin de la séparation, retirez soigneusement les couches de cellules mononucléaires aux interfaces entre le PBS et les couches de gradient de densité supérieur dans chaque tube sans perturber les bandes PMN. À l’aide d’une pipette de transfert, collectez les couches de PMN dans un nouveau tube de 15 millilitres par échantillon, et portez le volume final de chaque tube jusqu’à 15 millilitres avec du PBS filtré de 0,1 micron. Granulez les PMN par centrifugation, suivie d’une seconde centrifugation dans deux millilitres de PBS fraîchement filtré par tube.

Ensuite, mettez les granulés en suspension dans un millilitre de PBS fraîchement filtré pour le comptage. Après le comptage, centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de HBSS filtré de 0,1 micron, complété par le stimulant d’intérêt pour 10 millions de cellules. Incuber pendant 20 à 30 minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de la stimulation, collectez les cellules par centrifugation et transférez les surnageants acellulaires dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millimètre par échantillon. Centrifugez les surnageants pour éliminer tous les débris cellulaires, et transférez les surnageants éliminés dans de nouveaux tubes d’ultra-centrifugeuse, puis ultra-centrifugez les surnageants, et stockez les microparticules granulées dans des tubes d’ultra-centrifugeuse scellés à la paraffine à 80 degrés Celsius jusqu’à une analyse expérimentale plus approfondie. Pour administrer les microparticules dans le côlon de la souris, placez d’abord une souris entièrement anesthésiée en position couchée et utilisez une pince à biopsie et un endoscope équipé d’une caméra haute résolution pour générer trois à cinq plaies superficielles le long de la face dorsale du côlon.

Remettez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. 24 heures plus tard, utilisez l’endoscope pour acquérir des images des blessures infligées sous anesthésie. Ensuite, utilisez un système de micro-injection basé sur la coloscopie pour administrer un volume expérimental de microparticules PMN remises en suspension dans 100 microlitres de HBSS directement dans chaque site de plaie.

L’hétérogénéité de taille des microparticules PMN peut être évaluée en comparant les microparticules à des billes de cytométrie en flux de taille connue. Comme démontré, l’expression des protéines d’intérêt par les microparticules peut également être examinée par cytométrie en flux. Dans cette expérience, l’expression de molécules inflammatoires et anti-inflammatoires clés par des microparticules dérivées de PMN stimulées par l’activateur a été évaluée par immunoblot.

Les effets des microparticules PMN sur la cicatrisation des cellules épithéliales peuvent être surveillés par l’acquisition d’images de monocouches épithéliales blessées par égratignures à des moments prédéterminés in vitro, ainsi qu’après une blessure à la pince de biopsie in vivio. Une fois maîtrisées, les microparticules dérivées du PMN peuvent être isolées en quatre heures, si la technique est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’avant la stimulation, le PMN doit être maintenu sur de la glace pour éviter une activation prématurée et la perte de microparticules.

À la suite de cette procédure, des techniques de cytométrie en flux, d’immunotransfert et de réaction de prolifération en temps réel peuvent être utilisées pour définir la teneur en microparticules, dans diverses conditions de stimulation ou à partir de différentes cellules d’origine. Cette technique est utile pour examiner le rôle de la contribution des microparticules dans la régulation des réponses immunitaires, la fonction barrière, les lésions et la réparation des tissus, ainsi que dans la progression du cancer. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’étiqueter les microparticules murines et d’utiliser les microparticules dans un actif fonctionnel de cicatrisation des plaies in vivo.

N’oubliez pas que travailler avec des animaux vivants peut être dangereux et que les précautions suggérées de mettre l’équipement de protection individuelle et de suivre les formations de sécurité appropriées doivent toujours être entreprises avant d’effectuer cette procédure.