Name: Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Découvrez l'isolement et la caractérisation des microparticules dérivées de neutrophiles humains et murins par ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblot. Ces protocoles rapides permettent d'analyser la composition phénotypique et le rôle de ces vésicules dans la communication cellulaire.

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Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique du Dr Suchitra Swaminathan qui dirige le noyau Northwestern Feinberg School de médecine Flow Cytometry. Financé par la DK101675 (NIH).

Tous les travaux d’animaux a été approuvé par l’IACUC Nord-Ouest. Toutes les expériences ont été achevées en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels. Pour faire un don de sang des sujets humains, un consentement éclairé a été présenté et signé ; en outre, tous les sujets humains dans cette étude ont été traités conformément aux directives institutionnelles et fédérales pour le bien-être de l’humanité.
Remarque : Les étapes du protocole sont répertoriés dans les sous-sections suivantes : (i) l’isolement de cellules de la moelle osseuse de souris ; (ii) isolement de PMN de la moelle osseuse Murine ; (iii) PMN isolement du sang humain ; (iv) MP indépendamment des surnageants PMN (par Ultracentrifugation) ; (v) la caractérisation des députés par Western Blotting ; (vi) la caractérisation des députés par cytométrie de flux ; (viii) l’application des députés isolées d’étude la cicatrisation
1. isolement de cellules de moelle osseuse souris
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
Dissection du fémur et du tibia depuis les pattes de la souris
	<ol>
<li>Préparer une boîte de l’euthanasie (par exemple, une boîte de pointe vide 1 mL) pour l’inhalation de l’anesthésie. Ajouter quelques gouttes d’isoflurane 100 % sur un chiffon stérile collé à l’intérieur d’un couvercle de boîte en plastique. Selon les nouvelles directives IACUC, animaux ne devrait pas entrer en contact direct avec l’isoflurane, donc placer un embout porte entre la souris et la gaze contenant l’isoflurane. Remarque : L’Isoflurane est un puissant anesthésique par inhalation et doit être manipulé avec une extrême prudence à l’intérieur d’une hotte aspirante.</li>
		<li>Euthanasier souris conformément à la recommandation IACUC. Placez une souris à l’intérieur de la boîte de l’euthanasie, décrite à l’étape 1.1.1 pour 1 à 5 min, jusqu'à ce qu’elle a cessé de respirer. S’assurer de la mort de l’animal en effectuant une dislocation cervicale.</li>
		<li>Soulever la peau abdominale à l’aide d’acier inoxydable, 12 cm, courbé, pincettes 0,17 X 0,1 mm et couper la peau à mi-chemin entre les extrémités supérieures et inférieures. Peler la peau d’ici à la section plus distale du corps de souris, y compris les membres inférieurs. Avec 10 cm de long, tout droit ciseaux de dissection, retirez les muscles postérieurs et disloquer l’articulation de la hanche laissant la tête de fémur intact.</li>
		<li>Utiliser des ciseaux à disséquer les muscles du fémur et du tibia et séparer le fémur du tibia. Assurez-vous que les extrémités des os restent intactes, car ils contiennent des quantités importantes de la moelle osseuse.</li>
		<li>Supprimer toute chair restant en faisant rouler l’os à l’intérieur d’une serviette en papier. Placer les os propres dans une boîte de Pétri contenant un milieu sans sérum (GDF, c'est-à-diremoyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) sans sérum ou antibiotiques).</li>
		<li>Rincer les os dans l’éthanol à 70 %, puis dans la GFD.</li>
		<li>Préparer 50 mL de l’AFD dans un tube conique de 50 mL. Charger les 10 mL de la GDF dans une seringue de 10 mL et l’attacher à une aiguille de calibre 25 et 5/8 po.</li>
		<li>Coupez l’extrémité des os avec des ciseaux jusqu'à ce qu’une ouverture vers la moelle osseuse (couleur rouge) est visible.</li>
		<li>Rincer les cellules de la moelle osseuse dans un nouveau tube de 50 mL. Utiliser une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 26 et 5/8 po avec environ 3 mL/OS de la GFD. Lorsque vous avez terminé les bouffées de chaleur, remettre en suspension les cellules dans le tube de pipetage (usage jetable 1 mL des pointes en plastique) pour briser les agrégats cellulaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PMN isolement de murins de la moelle osseuse
<ol><li>
Lyse des globules rouges
	<ol>
<li>Granulés de la moelle osseuse recueillie par centrifugation à 350 x g pendant 8 min à 4 ° C.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 20 mL de 0,2 % NaCl pour environ 20-30 s à lyser la fraction des érythrocytes. Ne dépassez pas 30 s car cela se traduira par la lyse PMN. Ajouter 20 mL de 1,6 % NaCl pour restaurer l’osmolalité. Remarque : Cette étape peut conduire à l’activation des PMN très peu.</li>
		<li>Laver les cellules avec 2 mL de PBS et centrifuger comme au point 2.1.1 ci-dessus. Retirez le surnageant.</li>
		<li>Procéder à l’isolement APF par centrifugation en gradient de densité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement des neutrophiles par centrifugation en gradient de densité
	<ol>
<li>Chaude polysucrose sodium diatrizoate solutions et, avec des densités de 1,119 g/mL et 1,077 g/mL (voir Table des matières), à température ambiante (RT) avant utilisation.</li>
		<li>Préparer polysucrose et sodium diatrizoate dégradés frais, immédiatement avant la demande de cellules de moelle osseuse en superposant lentement 3 mL de la solution de densité de 1,077 g/mL plus de 3 mL de la solution de densité 1,119 g/mL dans les tubes coniques 15 mL. Remarque : Préparation de la solution dégradée trop longtemps à l’avance donne au mélange des couches et des pauvre pureté neutrophile et récupération.</li>
		<li>Resuspendre le culot de cellules de moelle osseuse dans 1 mL de PBS glacée et la suspension de cellules qui en résultent sur le dessus de la diatrizoate polysucrose et de sodium de superposition dégradé (lentement, pour éviter le mélange des couches).</li>
		<li>Centrifuger pendant 30 min à 850 g à 25 ° C à la droite, sans frein. Conserver les réactifs à RT pour la séparation efficace des neutrophiles des autres cellules présentes dans la moelle osseuse. Définissez la centrifugeuse à décélération lente pour permettre le gradient d’être efficacement formé et maintenu après l’étape de centrifugation.</li>
		<li>Localiser visuellement une couche de cellules mononucléées à l’interface de PBS et 1,077 g/mL de solution de densité (couche supérieure). Enlever cette couche et le reste de la solution de densité sans déranger la bande PMN.</li>
		<li>Recueillir une couche entière de PMN et certains polysucrose sous-jacent et sodium diatrizoate 1,119 g/mL, solution dans des tubes de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert. Remarque : La pureté de l’APF isolé dépendra un enlèvement complet de la couche supérieure.</li>
		<li>Garnir les tubes filtrée PBS (filtré par un filtre de taille de pore de 0,1 µm) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, à 4 ° C.</li>
		<li>Laver le PMN granulés avec 2 mL de PBS à l’aide des conditions de centrifugation comme au point 2.2.7.</li>
		<li>Remettre en suspension dans 1 mL de PBS filtrée et compter l’APF isolé par hémocytomètre. Remarque : Pour cette méthode d’isolement, la pureté PMN qui en résulte s’élève à ~ 85-90 %, a été évaluée par cytométrie en flux. Les autres fractions de contaminer se composent principalement des lymphocytes mononucléaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulation de PMN pour induire la libération MP NOTE : PN peut être stimulée pour libérer les députés à l’aide de diverses conditions d’activation, telles que N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) ou interféron gamma (IFNγ). Ce qui est important, avant la simulation, APF convient sur la glace en permanence.<ol>
<li>Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtrée Balanced Salt solution de solution (HBSS) de Hank, contenant l’agent stimulant de choix. Pour une stimulation optimale, utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL. Remarque : Les concentrations suivantes d’activateurs ont été utilisées avec succès dans nos travaux précédents : fMLF (0,5 à 1 µM pour homme et 2 à 5 µM pour les souris APF), PMA (200 nM) et IFNγ (100 ng/mL). Si vous souhaitez la libération des députés préalablement étiquetées, incuber APF non stimulées (1-5 x 106) avec 2′ maléimide-FITC (voir Table des matières) (1 µM dans 100 µL HBSS, 15 min, 37 ° C). Procéder à des mesures 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>Tournez en bas à 850 x g pendant 5 min à 4 ° C, pour enlever les PMN et transfert de surnageants acellulaires dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
		<li>Pour l’isolation de MP de surnageants acellulaires, passez à l’étape 4.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PMN isolement du sang humain
<ol><li>
Recruter des volontaires sains pour l’extraction de sang selon les directives de la CISR institutionnels.
	<ol>
<li>Prélever le sang de l’avant-bras d’un volontaire sain dans des tubes contenant du citrate de sodium de commercialement disponible 5 mL (voir Table des matières).</li>
		<li>Pipette 5 mL de solution de diatrizoate de sodium et de dextran (densité de 1,113 g/mL, voir Table des matières) dans des tubes de stérile de 15 mL et, lentement, couche 5 mL de fraîchement isolé sang périphérique humain au-dessus de celui-ci.</li>
		<li>Centrifuger les tubes pendant 50 min à 400 x g à ta (25 ° C) avec une accélération faible et sans frein.</li>
		<li>À la fin de la centrifugation, retirer le plasma et les cellules mononucléées (couche supérieure) à l’aide d’une pipette d’aspiration en plastique stérile.</li>
		<li>Transférer la couche inférieure (PMN) dans un nouveau tube conique stérile de 50 mL.</li>
		<li>Ajouter un volume égal de 0,45 % NaCl à APF (mix bien et doucement en tournant le tube).</li>
		<li>Centrifugation pendant 10 min à 400 g à 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lyse des globules rouges
	<ol>
<li>Ajouter 10 mL d’eau glacée et stérile aux cellules granulés pour 45 s puis 10 mL de glacee stérile 1,8 % NaCl pour restaurer l’osmolalité. Remarque : Toutes les étapes suivantes pour l’isolement de PMN doivent être effectuées sur la glace pour éviter l’activation PMN et libération prématurée de MP. L’étape de lyse elle-même entraîne l’activation de PMN mineure mais non significative, cependant, il est essentiel d’isoler une population PMN pure pour les tests fonctionnels.</li>
		<li>Centrifuger les cellules pendant 10 min à 250 x g à 4 ° C, avec une décélération douce.</li>
		<li>Répétez les étapes 3.2.1 et 3.2.2.</li>
		<li>Resuspendre PMNs dans 5 mL de HBSS glacee sans calcium ou de magnésium. Compter les cellules vivantes totales (utiliser un hémocytomètre et la viabilité à la dilution 1 / 2, voir la Table des matières) avant la stimulation. Remarque : APF isolé devrait servir de stimulation ou d’autres expériences après 2 h d’isolement afin d’éviter des changements fonctionnels et cellulaires et la mort cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP isolement de surnageants PMN activés
Remarque : Un protocole similaire est utilisé pour l’isolement de parlementaires de l’APF murins et humains.
<ol><li>Pellet APF (300 x g, 5 min, 4 ° C) et remettre à 0,1 µm filtré la solution HBSS, contenant l’agent stimulant de choix (pour exemple 1 µM fMLF, voir Note : 2.3.1). Pour une stimulation optimale utilisez 100 µL de solution de stimulation par PN 10 millions pendant 20-30 min à 37 ° C dans des tubes de 15 mL.</li>
	<li>Après la stimulation, tournez en bas activé APF à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C et transfert de surnageants acellulaires dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant PMN affranchis à 13 000 x g, 10 min, 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires et transférer le surnageant déboisée dans un nouveau tube ultracentrifugeuse.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 h à 100 000 x g, à 4 ° C. Supprimer les surnageants avant stockage MP. Au besoin, magasin granulées MPs en paraffine scellé tubes ultracentrifugeuse à-80 ° C jusqu'à l’utilisation dans des expériences.</li>
</ol>5. examen des PMN-MPs Western Blot
<ol><li>Ajouter 1 % SDS tampon (50-200 µL avec 100 mM de Tris pH : 7,4) aux députés pellet (de l’étape 4.4), transfert dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et faire bouillir les députés lysées pendant 5 min. Remarque : Le nombre des députés et le volume de tampon de lyse doit être ajusté et optimisé pour chaque protéine d’intérêt.</li>
	<li>
Charger une quantité égale de PMN-MPs par couloir en chargement tampon contenant du β-mercapto-éthanol à 10 %. Remarque : Avec notre méthode, nous chargeons les députés qui ont été isolées chez le même nombre de PN stimulée.<ol>
<li>Séparer les lysats par SDS-PAGE sur gel de polyacrylamide 10 % (utiliser 50-100 V pour 1 à 1,5 h) et le transfert des protéines totales sur des membranes de nitrocellulose comme décrit9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloquer les membranes pendant 1 h avec lait écrémé 5 % à 0,05 % Tween-20 tampon Tris salin et incuber il avec un primaire approprié (une nuit à 4 ° C), suivie par l’anticorps conjugué HRP secondaires.</li>
	<li>Visualiser les bandes en ajoutant chemoluminescence solution à la membrane et l’exposition à une radiographie à l’intérieur d’une cassette opaque (1-24h).</li>
</ol>6. examen des PMN-MPs par cytométrie en flux
<ol><li>
Pour la coloration d’anticorps, diluer anticorps convenablement dans le tampon de FACS (PBS avec EDTA, 0,1 % d’azide de sodium à 0,1 mM). Remettre granulées PMN-MPs (dérivé de 1-3 x 106 PN/condition) dans 100 µL de solution d’anticorps.
	<ol>
<li>Si la coloration pour l’annexine V, resuspendre granulées PMN-MPs dans un tampon d’annexine V contenant 5 µL de conjugué FITC annexine V. Si la coloration conjointement avec des anticorps, ajoutez l’anticorps désirés (pour un exemple, voir Table des matières) directement à la solution de l’annexine V. Ajouter le colorant fluorescent lipide, 2′ maléimide (voir Table des matières), à la concentration de 1 µM dans 100 µL de tampon de FACS d’étiqueter et d’identifier les MPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber les députés de la coloration de la solution pendant au moins 20 min à 4 ° C.</li>
	<li>Laver les députés par ultracentrifugation (1 h à 100 000 x g, à 4 ° C) ; jeter le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension dans un tampon FACS et exécuter les exemples sur un cytomètre désigné équipé d’une unité électronique améliorée pour une sensibilité accrue (voir Table des matières).</li>
</ol>7. les demandes d’isolé PMN-MPs à étudier la fonction PMN dans la cicatrisation des plaies
<ol><li>
In vivo administration PMN-MPs aux plaies du côlon
	<ol>
<li>Anesthésier souris par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg). Confirmer l’anesthésie par pédale réflexe (pincement de l’orteil ferme) et ajuster au besoin.</li>
		<li>Placez la souris sur son ventre et à l’aide de pinces à biopsie de 28 cm et un endoscope équipé d’une caméra à haute résolution (par exemple un endoscope vétérinaire pour petits animaux utilisés, voir la Table des matières), générer des plaies superficielles de 3-5 le long de la face dorsale de la deux points. Au terme de blessant, retour de souris à une cage placée sur un tapis de contrôle de la température (37 ° C) jusqu'à guérison.</li>
		<li>Anesthésier la souris (comme au point 7.1.1). Utiliser un endoscope pour acquérir des images de blessures infligées après blessant 24 h (jour 1). Laisse les souris à récupérer comme au point 7.1.2.</li>
		<li>En même temps (24h après blessure), administrer murines PMN-MPs dérivés de 2 x 106 PMNs dans 100 µL de HBSS + directement dans chaque site de la plaie à l’aide d’une microinjection axée sur la coloscopie système (utilisez une aiguille de 29 G)9. Trois jours plus tard (jour 4 après blessure) offrir une souris (comme au point 7.1.1) et utilise un endoscope pour réacquérir les images de la guérison des plaies. Laisse les souris à récupérer comme au point 7.1.2.</li>
		<li>À l’aide de logiciels d’analyse image préférée régions en mode plan visible plaie (voir Table des matières), dans les images acquises, mesure de la zone de la même blessure aux jours 1 et 4 post-blessant et calculer le pourcentage de fermeture de la plaie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Les cellules épithéliales humaines in vitro la cicatrisation des plaies
	<ol>
<li>BBe Caco-2 comte ou T84, les cellules épithéliales intestinales humaines par hémocytomètre et semences 5 x 105 cellules/puits dans les plaques 24 puits culture. Incuber les cellules dans une chambre standard d’incubation à 37 ° C et 5 % de CO2. Caco-2 BBe ou T84 atteignent confluence dans 48 h9. Pour la culture de cellules épithéliales, utilisez DMEM et DMEM-F12 (50/50) avec des suppléments comme précédemment décrit9.</li>
		<li>Générer des plaies de grattage mécaniques dans la monocouche à l’aide d’un embout de la pipette et succion faible comme décrit précédemment,4,9. Acquérir des images des zones de la plaie immédiatement après grattage à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée interférentiel différentiel (objectifs d’utilisation 5 X ou 10 X), pour être utilisé comme un temps = point de référence 0.</li>
		<li>MPs (dérivés du 2-4 X 106 PMNs) s’ajoute les monocouches de cellules épithéliales rayé-blessé et incuber pendant 24 h supplémentaires (48 h après blessure, à 37 ° C, avec 5 % de CO2). En ce moment ré-acquisition d’images de zéro-plaies.</li>
		<li>Utilisez le logiciel d’analyse image préférée (voir Table des matières) pour mesurer des plaies à t = 0 et t = 48 h. calculer le pourcentage de fermeture de la plaie en déterminant la différence dans la région de la plaie aux points de temps choisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+immunity%3A+the+host-pathogen+encounter+in+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts quelconques liés à cette communication

Protocoles d’isolement et caractérisation de dérivés de PMN MPs sont décrites dans la présente communication. Plusieurs points clés de la critique doit être tenus compte pour la réussite de la procédure. Tout d’abord, PMN doit être isolé frais et utilisé dans des expériences après 2 h d’isolement pour éviter la dégranulation et une activation spontanée. Toute manipulation des APF lors de l’isolation et jusqu’au moment de la stimulation doit être effectuée sur la glace pour prévenir l’activation et prématurée MP version<s...

Récemment, « microparticules/microvésicules » provenant du cytosol cellulaire ou de la membrane plasmique sont devenus de grand intérêt scientifique, comme de nouvelles données suggèrent que ces structures, allant de 50-1 000 nm de diamètre, peuvent transporter des données biologiques et servir de méthode de communication cellulaire non canonique. Immunitaire cellules dérivées MPs et particulièrement celles produites par les polynucléaires neutrophiles (PMN) sont d’un grand intérêt, étant donné l’importance de l’APF dans hôte défense1,2, réactions inflammatoires3et cicatrisation 4. Curieusement, jusqu’ici, de nombreux rapports ont montré des fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires du PMN-MPs5, suggérant un éventuel contexte - maladie-, espèce- et organe-spécifiques au rôle des députés.
Les protocoles décrits dans la présente communication fournissent une méthode rentable, innovante et adaptable pour étudier la fonction des députés dans la santé et la maladie. Elles s’appliquent à de nombreux organismes modèles, les organes et les conditions de stimulation. Elles permettent d’identifier plusieurs types de MPs et peuvent être utilisés à l’avenir pour traiter leurs fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Par exemple, décrit ici est de savoir comment étudier la fonction des PMN-MPs dans la plaie épithéliales guérison in vitro et in vivo. Le protocole présenté pour l’isolement de souris APF de moelle osseuse a été adapté avec quelques modifications d’une méthode décrite précédemment6.
En outre, les protocoles décrits dans cette étude permettent pour la détection et la caractérisation de marqueurs spécifiques que l'on retrouve sur PMN-MPs par deux méthodes complémentaires : Western blot et cytométrie en flux. Nous trouvons qu’immunoblotting de députés à l’aide de protocoles standard5 est simple et fiable, cependant, les progrès récents dans la sensibilité des instruments de cytométrie en flux et amélioration du rapport signal-bruit autorisent désormais une analyse plus approfondie des députés en utilisant cette méthode. Les protocoles décrits dans la présente étude incorporent les progrès récents et recommandations émanant des articles de recherche originaux, y compris les modifications apportées à la vitesse de centrifugation et de temps, l’ajout de l’échantillon des conditions de filtrage et surgélation/conservation7 , 8et comment réduire le « bruit de fond », améliorer la limite de détection de PMN-MPs et distinguer les différentes tailles de MPs.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin (inactivé par la chaleur)</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (10 000 unités de pénicilline / 10 000 mg/ml de streptocoque)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP2482</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Stérile et filtré à travers un 0,1 unité de filtration micronique</td></tr><tr><td>Filtre stérile Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Filtre stérile Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Densité 1,119 g/ml. Solution de polysaccharose et de diatrizoate de sodium. Porter à température ambiante</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium</td><td>Alcool</td> éthylique <td>Cellgro 210-40-CV</td><td></td></tr><tr><td>(200 proof)</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HBBS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp ; SIGMA</td><td>Dilué 1:2 pour le comptage de la viabilité cellulaire</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain CD11b-APC conjugué Biolegend</td><td></td><td>301350</td><td>Clone ICRD44 (Concentration finale : 1 &micro ; g/mL)</td></tr><tr><td>BODIPY FL</td><td>Invitrogen</td><td>B10250</td><td>N-(2-aminoéthyl) maléimide&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon de liaison Annexine V</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td></td></tr><tr><td>billes d’étalonnage pour cytométrie en flux</td><td>BioCytex</td><td>7803</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>Biolegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield PoC AS</td><td></td><td>Diatrizoate de sodium/Dextran 500, densité 1,113 g/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6 souris</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifugeuse tubes</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes à centrifuger</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes sérologiques</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes sérologiques</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipettes sérologiques</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td></td></tr><tr><td>pipettes Pasteur&nbsp ;</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>25 g x 5/8 po Aiguilles (aiguilles de précision glide)</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>100 & micro ; Filtres à cellules m</td><td>Celltreat</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer tubes</td><td>BD</td><td>367251</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td><td>BD(</td><td>SORP)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à godet oscillant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>(L8-80 M)</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp ; VV-17703-15 (Fresco 17)</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse à godet oscillant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp ; 75004503 (Megafuge 40R)</td><td></td></tr><tr><td>Pince à biopsie, 28 cm</td><td>Storz</td><td>27071zj</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td>Open source&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polynucléaires neutrophiles dérivés microparticules (PMN)-MPs) sont bicouche lipidique, microvésicules sphérique avec des tailles allant de 50 à 1 000 nm de diamètre. MPs sont un nouvellement en évolution, une partie importante de la cellule-cellule communication et signalisation machines. En raison de leur taille et la nature de leur libération, existence de MP a été négligé jusqu'à récemment. Cependant, avec une technologie améliorée et des méthodes d’analyse leur rôle dans la santé et la maladie se dessine maintenant. Les protocoles présentés ici visent à isoler et à caractériser les PMN-MPs par immunotransfert et cytométrie en flux. En outre, plusieurs exemples d’application sont donnés. Ces protocoles d’isolement de MP sont rapides, peu coûteux et ne nécessitent pas l’utilisation de kits coûteux. En outre, ils permettent l’étiquetage des députés après isolement, mais aussi de marquage préalable des cellules source avant la sortie de MP, à l’aide d’un colorant fluorescent membranaires spécifiques pour la visualisation et l’analyse par cytométrie en flux. Ces méthodes, cependant, ont plusieurs limitations, y compris la pureté de l’APF et de députés et de la nécessité d’instruments d’analyse sophistiqués. Un cytomètre en flux haut de gamme il faut analyser MPs et de minimiser les fausses lectures positives en raison de bruit ou auto-fluorescence de façon fiable. Les protocoles décrits peuvent servir à isoler et à définir la biogenèse des MP et caractérisent leurs marqueurs et la variation dans la composition sous différentes conditions stimulantes. Hétérogénéité de taille peut être exploitée pour étudier la question de savoir si le contenu de particules de membrane versus exosomes est différent, et si elles jouent des rôles différents dans l’homéostasie tissulaire. Enfin, isolement et caractérisation des députés, leur rôle dans les réponses cellulaires et divers modèles de maladies (y compris, PMN associée à des troubles inflammatoires, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou la lésion pulmonaire aiguë) suivantes peuvent être explorées.

Cytométrie représentant des députés qui ont été isolés des humains et de souris APF sont indiquées à la Figure 1. L’hétérogénéité de taille de PMN-MPs peut être n’évaluée par comparaison à des perles de tailles connues comme illustré à la Figure 1A, B pour humain MPs. Note, aucune différence significative dans l’hétérogénéité de taille ont été observés entre la souris et les humains MPs. De même, à l’aide de cyto...

Nouveaux protocoles sont décrits ici pour isoler et caractériser les microparticules dérivées de l’homme et les neutrophiles de souris. Ces protocoles utilisent l’ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblotting techniques pour analyser le contenu au moyen de microparticules, et ils peuvent être utilisés pour étudier le rôle de microparticules dérivés de divers types de cellules à fonction cellulaire.

Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

L’objectif global de ce protocole est d’isoler et de caractériser des microparticules dérivées de neutrophiles pour des études fonctionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle des vésicules exocellulaires, ou microparticules, dans la communication cellule-cellule dans différents processus physiologiques, notamment le cancer, l’inflammation et la cicatrisation des plaies. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement rapide, rentable et qu’elle permet de valoriser la composition p’hénotypique des microparticules, ou micro-vésicules, en actifs fonctionnels.Ariel Finkielsztein, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, et Joseph Lee, étudiant de premier cycle dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour la séparation par gradient de densité des cellules polymorphonucléaires de moelle osseuse murine, ou PMN, superposez d’abord lentement trois millilitres de solution fraîchement préparée, à température ambiante, 1,077 gramme par millilitre sur trois millilitres de solution fraîchement préparée, à température ambiante, 1,119 gramme par millilitre dans un tube conique de 15 millilitres par échantillon

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Les neutrophiles sont parmi les premières cellules à arriver sur le site de la réponse immunitaire inflammatoire, et de leurs fonctions et mécanismes ont été largement étudiés in vitro. Nous démontrons une méthode de gradient de densité standard de séparation pour isoler les neutrophiles humains du sang total en utilisant des milieux de séparation disponibles commercialement.

Isolement des neutrophiles Protocole

Cette vidéo montre l’isolement des protéines des neutrophiles, qui sont ensuite transformées et digérées en peptides plus petits. Ces peptides peuvent être utilisés pour des analyses futures.

Isolement et digestion des protéines neutrophiles

Nous décrivons un protocole pour l'isolement et la purification des neutrophiles de la moelle osseuse de souris par centrifugation de gradient de densité et de neutrophiles étiquetage utilisant des colorants CellTracker. Cela représente une méthode simple, rapide, reproductible et économique pour obtenir un grand nombre de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval ou des expériences de transfert et de suivi adoptifs.

Isolement, la purification et l&#39;étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Les neutrophiles jouent un rôle important non seulement dans la défense de l’hôte contre les micro-organismes envahisseurs, mais sont également impliqués dans la surveillance immunitaire des cellules tumorales. Ici, nous décrivons des techniques liées à l’isolement de neutrophiles ayant des propriétés antitumorales et des méthodes de surveillance de la fonction antitumorale des neutrophiles in vitro et in vivo.

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Les neutrophiles sont le type de globules blancs le plus abondant. L’isolement des neutrophiles du sang humain par la méthode de séparation par gradient de densité et la différenciation des cellules promyélocytaires humaines (HL60) le long de la voie granulocytaire sont décrits ici ; Tester leur rôle sur la sensibilité des cellules du lymphome aux agents anti-lymphomes.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Nous décrivons ici un procédé permettant l'obtention et l'identification d'une sous-population nouvellement caractérisé par des phagocytes géantes neutrophile dérivé. Ces cellules se développent dans la culture à partir de neutrophiles frais du sang humain, et sont caractérisées par la phagocytose, l'autophagie, immensément grande taille, et la durée de vie prolongée. Cette méthode est indispensable d'étudier plus avant cette sous-population de neutrophiles dérivé unique.

Développement et identification d'une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant In vitro

Dans cette recherche, nous démontrons une méthode de séparation neutrophiles exempte d’étiquette de sécrétions des voies respiratoires clinique utilisant opération de boucle fermée de spirale microfluidics inertiel. La méthode proposée élargirait les essais cliniques in vitro pour diverses maladies respiratoires.

Label-free Neutrophil enrichissement de sécrétion Patient provenant des voies respiratoires à l’aide de la boucle fermée Microfluidics inertiel

Ce protocole détaille une méthode pour isoler les neutrophiles du sang total, des manteaux bouffants ou des membranes de leucaphérèse, obtenant un bon rendement, une pureté élevée et une activation cellulaire minimale. Nous utilisons la purification par gradient, la sédimentation des globules rouges (RBC) et la lyse des globules rouges pour obtenir une préparation de neutrophiles de haute qualité / pureté.

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Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Ici, nous proposons une approche fiable pour isoler les neutrophiles de densité faible et normale du sang total en utilisant l’isolement magnétique (sélection négative) et le milieu à gradient de densité discontinu. Il garantit l’isolement intact des cellules de haute pureté (≥93 %), facilitant ainsi l’analyse précise en aval des sous-populations de neutrophiles, ce qui est crucial pour comprendre leurs rôles dans la santé et la maladie.

L’isolement et la caractérisation des neutrophiles de basse et de densité normale dans le sang total

Les neutrophiles de basse densité (LDN) augmentent considérablement dans plusieurs maladies. Les LDN sont généralement isolés par tri cellulaire. Nous présentons une méthode pratique pour obtenir de la NDT pure et viable. Après la centrifugation du sang périphérique par gradient de densité, les cellules sont incubées avec des microbilles magnétiques, puis la LDN est séparée par des colonnes magnétiques.

Méthode à microbilles magnétiques rapides pour la purification efficace de neutrophiles de faible densité

Découvrez l'isolement et la caractérisation des microparticules dérivées de neutrophiles humains et murins par ultracentrifugation, cytométrie en flux et immunoblot. Ces protocoles rapides permettent d'analyser la composition phénotypique et le rôle de ces vésicules dans la communication cellulaire.

Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

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