Name: In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Découvrez le suivi de molécules uniques in vivo au terminal nerveux moteur présynaptique de Drosophila melanogaster. Cette méthode PALM permet d'imager et de localiser des protéines synaptiques individuelles avec une haute résolution.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Jean Baptiste Sibarita et Daniel Choquet (IINS, CNRS/Université de Bordeaux) pour leur soutien à l’analyse de molécules simples. Nous remercions particulièrement Nick Valmas et Jessica Mcgaw (QBI, University of Queensland) pour leur aide avec la vidéo d’enregistrement, voix-off ainsi que conception graphique de la figure. Ce travail a été soutenu par le projet de découverte du Conseil de recherche australien (AR) (DP170100125 à f.a.M.), l’Australian Research Council (LIEF Grant LE0882864 de f.a.M.), bourse de l’avenir (FT100100725 à B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 de f.a.M.) et projet NHMRC (APP1103923 à B.V.S.). F.a.M. est un chercheur NHMRC (ONT1060075).

1. conception de transgéniques Drosophila exprimant des protéines mEos2
<ol><li>Sélectionnez la protéine à être marquées par la protéine mEos2. Pour augmenter le taux de réussite d’imagerie, sélectionnez protéines possédant un domaine transmembranaire dans la membrane plasmique neuronale14 (p. ex., syntaxine-1 a), les protéines sur les vésicules synaptiques ou autophagosomes26,27 (p. ex., Synaptobrevin-2), ou des protéines cytosoliques avec une interaction étroite avec les protéines de la membrane plasmique neuronale (par exemple, Munc18-1).</li>
	<li>Construire des transgènes codant la protéine mEos2-tag (Figure 1). Concevoir les amorces et inverses pour les protéines et les mEos2. Remarque : La séquence codante de mEos2 peut être amplifiée du plasmide pmEos2-N1, qui vise à fusionner à l’extrémité C-terminale de la protéine d’intérêt. Clonage par exemple peut être effectué que par une recombinaison in vivo chez Saccharomyces cerevisiae , à l’aide de la pFL44S-attB-MCS-w + vector14,28, tour à tour les autres méthodes de clonage pourraient servir comme Gibson l’Assemblée protocole29.<ol>
<li>Linéariser le vecteur avec BamHI et XbaI et transformer conjointement ura3 - cellules de levure ainsi que les fragments PCR codant la protéine d’intérêt et le mEos2. Injecter des embryons de drosophile avec la construction pour générer une lignée transgénique de mouche30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arrière les cultures transgéniques mouches sur milieu standard de levure et de molasses ou quelque autre substitut approprié figurant dans des flacons en plastique. Afin d’assurer la saine et assez gros boutons synaptiques31, éviter la surpopulation des mouches dans les flacons et flip mouches à nouveaux flacons après chaque jour de la ponte ; Ceci assure le troisième stade larvaire est bien nourris et atteindre la taille appropriée au moment où qu'ils entameront errant sur le support. Soulever la mouche transgénique à température ambiante (25 ° C). Remarque : Plus gros boutons synaptiques ont tendance à donner la plus grande quantité de protéines visualisée en imagerie.</li>
</ol>2. dissection du troisième larve de stade
<ol><li>Faire un ≤20 base cylindrique ou semicylindrical forme polydiméthylsiloxane (PDMS) mm de diamètre et 20 mm de hauteur à l’aide d’un kit d’élastomère de silicone approprié (Figure 2 a). Mélange élastomère de silicone avec un silicone hardening agent à un ratio de 10:1.<ol>
<li>Agiter le mélange soigneusement pendant 5 min. verser le mélange dans un moule avec les dimsensions énuméré ci-dessus. Laisser durcir dans un four à 100 ° C pendant 45 min. La base PDMS servira de la base sur laquelle effectuer la dissection. S’assurer que la base PDMS s’insère dans la cupule d’une boîte de culture à fond de verre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez une larve de stade troisième errant dans la paroi du flacon. Utiliser un stéréo-microscope optique à grossissement 4,5 pour visualiser la larve placée sur le socle cylindrique de PDMS avec la face dorsale vers le haut.</li>
	<li>Utilisation courbé et pince à épiler pour coller minutien épingles sur la tête les œillets de la bouche, entre les deux s’étendant des stigmates antérieures et la queue dans l’anus, entre les deux stigmates postérieures d’angle. Ajouter 40 µL de milieu insecte de Schneider à la température ambiante sur la larve immobilisée. Remarque : Hemolyph-comme solutions (HL3 ou HL6) peuvent également être utilisées à la place solution32,33 de Schneider.</li>
	<li>Fournir l’accès par le biais de la face dorsale de la paroi abdominale du corps de la larve par utilisation d’une goupille minutien à inciser dans la ligne médiane de la paroi.</li>
	<li>Utilisation printemps ciseaux pour découper la paroi du corps ouvre à partir du point d’incision. Découper le long de la ligne médiane dans le sens antéro-postérieur34.</li>
	<li>Utilisez des pinces fines et ciseaux à éventrer la larve de printemps : enlever les organes internes, y compris les glandes salivaires, la trachée et l’intestin. Laver la larve deux fois avec les insecte milieu de Schneider.</li>
	<li>Avec une pince fine, maintenez les deux rabats de la paroi du corps, doucement étirer les et coller deux broches minutien sur chaque côté. Ceci devrait produire une préparation en forme d’hexagone (Figure 2 a).</li>
	<li>Détacher le cerveau du cordon nerveux ventral à l’aide de ciseaux de printemps pour diminuer la possibilité de mouvements musculaires au cours de l’imagerie ; Cela sert aussi à organiser la préparation plat contre le plat d’imagerie. Utilisez la pince courbée pour pousser tous les six broches minutien dans la base PDMS. Remarque : Seule une petite partie des broches devrait être incorporée au sein de la paroi abdominale.</li>
	<li>Pour confirmer que la larve a survécu à la procédure de dissection, pousser un peu le cordon nerveux ventral, cela devrait déclencher une contraction péristaltique de la paroi abdominale de la larve.</li>
</ol>3. éclairage légèrement Oblique suivi de la particule microscopie
<ol><li>Il faut inverser la base PDMS larve disséqué sur un plateau de culture à fond de verre. Remplissez le plat d’imagerie avec 2 mL de milieu d’insectes (Figure 2 b) de la température ambiante Schneider.</li>
	<li>Localiser des neurones moteurs dans les deuxième et troisième segments avec synapses sur les muscles abdominaux 6 et 735 utilise le x 63 / 1.2 objectif d’immersion dans l’eau NA sur un microscope à fluorescence (FRBR) fluorescent réflexion interne totale.</li>
	<li>Les oculaires du microscope permet de localiser la larve disséquée ; identifier le muscle 6 par l’utilisation de l’éclairement lumineux zone.</li>
	<li>Utilisez le logiciel d’acquisition de microscope (voir Table des matières), dans la configuration de la FRBR ; Faites glisser l’angle de caméra collimateur 1° pour augmenter la profondeur de pénétration, sinon quitter l’angle critique FRBR pour obtenir un éclairage oblique.</li>
	<li>Allumer le laser à 488 nm pour visualiser mEos2 en vert. Utiliser un laser de faible puissance (moins de 5 % de 22,8 mW) pour éviter la décoloration de la fluorescence verte. Recherchez les jonctions neuromusculaires (qui ressemblent à des perles sur une chaîne) et acquérir une image de la FRBR basse résolution.</li>
	<li>En même temps allumer le laser à 405 nm (photoconverts mEos2 du vert au rouges espèces) et du 561 nm laser (image du mEos2 de photoconverted rouge) localiser stochastique des protéines fluorescentes mEos2 unique. Remarque : Utilisation de faible puissance de laser 405 nm est recommandée (0,005 à 0,9 % de 4,78 mW) car cela permet à un taux relativement constant photoconversion lors de l’acquisition de film. Utilisation entre 50 et 75 % du laser 561 nm (20,1 mW), comme cela est suffisant pour acquérir la fluorescence de l’espèce mEos2 rouge sans porter atteinte à la morphologie du tissu musculaire qui entoure la jonction neuromusculaire.</li>
	<li>Pour chaque chaîne de la jonction neuromusculaire, acquérir un temps série composée de 15 000 cadres ou plus à 33 Hz. enregistrer as.czi format afin de préserver les métadonnées qui l’accompagne pour référence possible.</li>
	<li>ImageJ permet de convertir des vidéos « .czi » à « .tiff » fichiers.</li>
	<li>Analyser les films acquis avec la molécule unique approprié suivi logiciel analytique11,14,36 comme TrackMate sur Fidji/ImageJ37 (voir Table des matières). Localise le « x » et « y » coordonnées de chaque localisation par la fit gaussienne de la pointe d’intensité fonction (PSF) d’étalement. Remarque : Dépannage: si la fluorescence verte n’est pas respectée ou est trop faible à la jonction neuromusculaire par exposition au laser 488 nm, passer brièvement sur l’imagerie des lasers et de la photoconverting (405 nm et 561 nm), car cela contribue à produire plus de rouge espèce de mEos2. Puis rebasculer vers le laser à 488 nm et prendre une image de la FRBR.</li>
</ol>4. molécules simples localisation chez les larves fixes
<ol><li>Pour mesurer la taille de nanocluster des protéines par l’intermédiaire de PALM, remplacer les insecte milieu du Schneider après dissection avec un fixateur - paraformaldéhyde 4 % dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Incuber la larve pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Enlever la dissection épingles et placer la larve fixe dans un 1,7 mL clair tube microcentrifuge snap-lock.</li>
	<li>Disséquer et fixer comme beaucoup d’autres larves selon les besoins, puis lavent trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Remplacer le PBS avec tampon de bloc (une solution de sérum de chèvre normal de PBS, 0,1 % X-100 Triton et 3 %).</li>
	<li>Laver les larves avec du PBS trois fois, puis incuber avec l’anticorps primaire nécessaire (dilué dans la solution tampon de bloc).</li>
	<li>Incuber une nuit à 4 oC.</li>
	<li>Laver les larves trois fois avec du PBS puis incuber avec l’anticorps secondaire nécessaire (dilué dans la solution tampon de bloc).</li>
	<li>Laver les larves trois fois avec du PBS, attachez la larve sur la base de PDMS et l’image décrite précédemment pour le suivi de la molécule unique.</li>
</ol>

<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+neurotransmitter+release+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).</li>
<li>Papadopulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-driven+relaxation+of+the+cortical+actomyosin+II+network+synchronizes+Munc18-1-dependent+neurosecretory+vesicle+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking.</a> Nat Commun. 6, 6297(2015).</li>
<li>Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortical+acto-Myosin+network%3A+from+diffusion+barrier+to+functional+gateway+in+the+transport+of+neurosecretory+vesicles+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153(2013).</li>
<li>Tomatis, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+VI+small+insert+isoform+maintains+exocytosis+by+tethering+secretory+granules+to+the+cortical+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin.</a> J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).</li>
<li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol%284%2C5%29bisphosphate+coordinates+actin-mediated+mobilization+and+translocation+of+secretory+vesicles+to+the+plasma+membrane+of+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells.</a> Nature Communications. 2, (2011).</li>
<li>Malintan, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abrogating+Munc18-1-SNARE+complex+interaction+has+limited+impact+on+exocytosis+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells.</a> J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).</li>
<li>Choquet, D., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(13)00916-1">The dynamic synapse.</a> Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).</li>
<li>Triller, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+synaptic+biology+derived+from+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging.</a> Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).</li>
<li>Gandasi, N. R., Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-induced+clustering+of+syntaxin+and+munc18+docks+secretory+granules+at+the+exocytosis+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site.</a> Nat Commun. 5, 3914(2014).</li>
<li>Milovanovic, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+dynamics+of+SNARE+proteins+in+the+presynaptic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane.</a> Front Physiol. 6, 89(2015).</li>
<li>Kasula, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munc18-1+domain+3a+hinge-loop+controls+syntaxin-1A+nanodomain+assembly+and+engagement+with+the+SNARE+complex+during+secretory+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming.</a> J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).</li>
<li>Constals, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-induced+AMPA+receptor+desensitization+increases+their+mobility+and+modulates+short-term+plasticity+through+unbinding+from+Stargazin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin.</a> Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).</li>
<li>Ribrault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin1A+lateral+diffusion+reveals+transient+and+local+SNARE+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions.</a> Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).</li>
<li>Bademosi, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-molecule+imaging+of+syntaxin1A+reveals+polyphosphoinositide-+and+activity-dependent+trapping+in+presynaptic+nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters.</a> Nat Commun. 8, 13660(2017).</li>
<li>Bar-On, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+reveals+the+internal+architecture+of+nano-sized+syntaxin+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters.</a> J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Zhang, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+true+monomeric+and+bright+photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Schneider, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+calcium+channels+in+the+presynaptic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane.</a> Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).</li>
<li>Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551-551 (2012).</li>
<li>Willig, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+of+filamentous+actin+in+cortical+dendrites+of+a+living+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse.</a> Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).</li>
<li>Zhan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-molecule+imaging+identifies+altered+dynamics+of+calcium+channels+in+dystrophin-mutant+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans.</a> Nat Commun. 5, 4974(2014).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Vanhauwaert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SAC1+domain+in+synaptojanin+is+required+for+autophagosome+maturation+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals.</a> EMBO J. , (2017).</li>
<li>Joensuu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffractional+tracking+of+internalized+molecules+reveals+heterogeneous+motion+states+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles.</a> J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).</li>
<li>Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mutational+analysis+of+the+intracellular+regions+of+yeast+Gap1+permease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease.</a> PLoS One. 6 (4), e18457(2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li>
<li>Stewart, B. A., McLean, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+density+regulates+Drosophila+synaptic+morphology+in+a+Fasciclin-II-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner.</a> J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).</li>
<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).</li>
<li>Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+proprioceptors+in+Drosophila+larvae+and+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae.</a> J Vis Exp. (64), e3846(2012).</li>
<li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).</li>
<li>Nair, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+reveals+that+AMPA+receptors+inside+synapses+are+dynamically+organized+in+nanodomains+regulated+by+PSD95%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95.</a> J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Ferguson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+dynamics+of+clathrin-mediated+endocytosis+in+a+living+organism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism.</a> J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).</li>
<li>Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Imaging+in+Living+Drosophila+Embryos+with+Reflected+Light-Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy.</a> Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).</li>
<li>Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+cell+surface+dynamics+in+Caenorhabditis+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).</li>
<li>Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Protein+Dynamics+in+the+Cell+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus.</a> Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).</li>
<li>Perillo, E. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/ncomms8874">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, 7874(2015).</li>
<li>Knodel, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+bouton+properties+are+tuned+to+best+fit+the+prevailing+firing+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Comput+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern.</a> Front Comput Neurosci. 8, 101(2014).</li>
<li>Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+3D+geometry+of+microtubules+using+multi-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Comput+Comput+Assist+Interv%22%5BJournal%5D)">Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).</li>
<li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit la molécule unique suivi de protéines marquées mEos2 à la jonction neuromusculaire de la larve de stade troisième de drosophile . Pour éviter la surexpression de protéines transgéniques, expression de la syntaxine-1 a-mEos2 a été conduite par endogène promoteur syntaxine-1 a. Études de mobilité de protéines synaptiques ont été principalement limités aux enquêtes de in vitro des cellules cultivées et les neurones corticaux9,11,12,13. Si ces protéines présentent des signatures de mobilité semblable à un animal vivant est en grande partie inconnue. Pour visualiser les single-protéine mobilité in vivo, limitations comme l’épaisseur optique de transparence, d’accessibilité et pénétration doivent être surmontés. En disséquant la préparation larvaire et en visualisant les jonctions neuromusculaires embarquées sur la surface du muscle, nous éviter la question de la transparence optique et d’accessibilité. Tentatives de mobilité molécule unique image en configuration normale de la FRBR se sont révélés infructueux. Utilisation d’éclairage légèrement oblique permet toutefois, laser d’excitation accrue pénétrant profondeur. En outre, les broches minutien utilisés pour immobiliser la larve a permis d’éviter toute incidence néfaste d’usage anesthésique sur la mobilité des protéines. Il est possible d’utiliser des objectifs de grossissement plus élevés, comme 100 x objectifs huile à immersion, de visualiser des molécules simples in vivo. Cependant, grossissement accru peut augmenter l’occurrence de dérives hors de discussion. En outre, nous avons utilisé une intensité plus faible (~ 30 %) 561 nm laser avec succès à image unique des molécules dans les terminaux des nerfs moteurs. Des tests supplémentaires peuvent être nécessaire d’utiliser moins de puissance laser.
Ce protocole est conçu pour visualiser la mobilité des protéines synaptiques à proximité de la membrane plasmique neuronale. En utilisant cette approche, la mobilité des protéines SNARE - syntaxine-1 a et l’autophagosome lié protéine Atg18a - ont été avec succès imagés in vivo14,26. La mobilité des protéines sur les motoneurones axones peuvent également être étudié27. Toutefois, l’enquête de la mobilité des protéines sur le cerveau ou le cordon nerveux ventral peut s’avérer difficile à évaluer en raison du signal de fond élevé produit par les tissus sous-jacents ; en outre, visualisation de mobilité de protéine sur la structure même du cerveau, il faudra marquage fluorescent la structure du cerveau (pour garantir la reproductibilité), et utilisation de l’imagerie double caméra serait nécessaire.
Les méthodes actuelles disponibles pour la microscopie de Super-résolution chez la drosophile se limitent principalement aux embryons d’imagerie, plutôt que les plus développées de troisième stade larve38,39. Le principal problème avec ces protocoles est qu’ils donnent un faible nombre de trajectoires en matière d’image et donc empêchent une analyse approfondie de mobilité États22,40. Nos in vivo seule molécule protocole de suivi a la capacité de générer un grand nombre de trajectoires et pourrait donc être utilisé dans d’autres modèles animaux comme Caenorhabiditis elegans et le poisson-zèbre. En effet, chaque chaîne NMJ généré des trajectoires de ~ 2 400 ce qui convient pour analyser les différents États de mobiles et les transitions entre ces États14,27. En outre, beaucoup en vivo seule molécule d’imagerie de stratégies s’appuient sur l’utilisation d’anesthésiques pour immobiliser les animaux20,22, qui seraient susceptibles de modifier la fonction physiologique en vertu duquel l’imagerie se fait. Ici, nous avons optimisé un protocole « anesthésie-libre » pour immobiliser les larves à l’aide d’épingles à minutien.
Une utilisation potentielle du présent protocole peut être pour la visualisation de la mobilité des protéines en trois dimensions. Les progrès récents en microscopie de Super-résolution permettent mobilité de protéines être visualisées en vitro en « x », « y » et « z » dimensions41,,42. Notre méthode actuelle ne tient pas compte de la mobilité des protéines dans l’axe « z ». Pourtant, le nerf moteur de Drosophila terminal est une structure sphérique et une précieuse future approche consistera à quantifier la mobilité de la protéine dans un volume en trois dimensions43. L’imagerie dans la dimension z est réalisable à l’aide d’une lentille astigmatisme. Alternativement, dans la FRBR mode44,45, la résolution en z est également augmentée. Toutefois, dans nos expériences, nous avons utilisé éclairage légèrement oblique pour visualiser des molécules simples de syntaxin1A-mEos2 sans la lentille astigmatisme.
En conclusion, disponibilité des deux un transgéniques drosophile mouche stock exprimant des protéines marquées par une protéine de l’et, une base PDMS à disséquer la larve transgénique, mais aussi un microscope TIRF avec la possibilité de changer la angle d’éclairage sont les outils les plus importants nécessaires pour visualiser les protéines simples tel que décrit dans le présent protocole.

La communication neuronale s’appuie sur la libération des neurotransmetteurs, qui se produit par la fusion réglementée de neurotransmetteur contenant des vésicules synaptiques avec la membrane plasmique1. Ce processus appelé exocytose2,3,4,5,6 est très dynamique et peut être vers le haut ou vers le bas-réglementés selon les fluctuations du taux de stimulation7. Les protéines impliquées dans ces processus sont soumis à un mouvement brownien et par conséquent affichent nanoscopiques organisation capable de soutenir un éventail de mesures qui sous-tendent ces fonctions physiologiques de liaison. Protéines de la membrane plasmique sont très dynamiques, permettant aux latéraux piégeage de molécules en nanoclusters sur la membrane plasmique7,8,9,10,11, 12. À ce titre, enquête sur la mobilité de ces protéines aide à élucider leur mode d’action8. Les protéines synaptiques telles que les N-éthylmaléimide facteur sensible fixation protéique récepteurs solubles (pièges), par exemple syntaxine-1 a, sont maintenant connus pour pièce latérale rapide mobilité, mais aussi latérale de piégeage dans nanoclusters qui peut servir comme moléculaire dépôts et sites pour vésicule fusion9,13,14,15.
Le développement récent des protéines fluorescentes et, comme monomère (m) Eos16,17 et18de Kaede, a permis la résolution nanoscopique des protéines de la membrane plasmique neuronale par l’utilisation d’approches telle comme la localisation de photoactivation microscopie (PALM) et stochastique optique reconstruction microscopie (tempête)14,15,19. Ces développements ont permis aux enquêtes sur la mobilité et la nanoclustering des protéines biologiques dans des cellules vivantes et les neurones. Plus récemment, des études ont été menées pour élucider (avec une résolution élevée similaire) la dynamique et l’organisation de ces protéines membranaires dans les neurones d’êtres vivants d’intactes telle Mus musculus, Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Enquête sur la dynamique et l’organisation d’une protéine en vivo nécessite non seulement l’utilisation des outils d’imagerie Super-résolution récemment développés (par exemple les fluorophores et PALM et STORM), mais aussi la capacité de surmonter des obstacles tels accessibilité de la protéine et la profondeur de pénétration de l’imagerie laser. Imagerie des protéines intracellulaires chez un animal intact est intrinsèquement difficile qu’est l’imagerie protéines sur structures intégrées profondément dans les tissus vivants de l’animal intact, comme l’hippocampe d’une souris intacte. Par conséquent, les protéines sur ou près de la surface du tissu sont plus facilement imagés. Une autre difficulté d’imagerie in vivo est en assurer la reproductibilité entre animaux. Comme l’anatomie peut différer d’un échantillon à l’autre, en sélectionnant une structure avec une facilité de réplication dans différents échantillons animaux intacts pourrait également s’avérer difficile. L’utilisation des structures stéréotypées, comme synapses, aider à surmonter certaines de ces difficultés.
Des études récentes ont photographié mobilité de protéines chez les animaux avec un épiderme optiquement transparent comme Caenorhabditis elegans22, tandis que d’autres enquêtes ont photographié Organisation de protéine sur la surface d’un tissu ou d’organe, par exemple imagerie de l’actine dans des neurones corticaux à travers le crâne d’une souris vivante21. Dans certains cas, les anesthésiques ont été utilisés pour garder l’animal immobile ; Toutefois, les anesthésiques spécifiques peuvent nuire à la protéine d’intérêt. Il conviendrait donc des moyens alternatifs pour garder les animaux immobiles durant l’imagerie in vivo pour minimiser l’erreur.
Une autre restriction de Super-résolution d’imagerie in vivo est que les lasers utilisés pour illuminer les protéines d’intérêt qui pourraient affecter les tissus environnants, et donc de garder l’intensité d’excitation aussi bas que possible est recommandée. Illumination du tissu environnant par le laser tend aussi à augmenter le signal de fond. L’utilisation de l’intensité d’excitation faible contribue à réduire le fond, la mise en garde qu’il pourrait également conduire à une diminution de rendement de photon de protéine fluorescente. Soustraction de fond pendant l’analyse pourrait être utilisée comme un autre moyen de réduire le signal de fond avant l’analyse de l’image.
Drosophila présente l’organisme idéal pour l’imagerie in vivo car il fournit des outils génétiques bien établis pour l’étude de la fonction des protéines spécifiques. La séquence activatrice en amont (UAS)-système de Gal4 permet une expression temporelle et spatiale des protéines et peut donc être utilisée pour manipuler la neurotransmission23, telle que stimulation thermo-génétique à l’aide de Drosophila transitoire sous-famille potentiels récepteurs A1 (dTRPA1)24 ou stimulation opto-génétique à l’aide de sombre-rouge-décalé CsChrimson25 peut être combinée avec l’imagerie14. Nous avons surmonter bon nombre des complications de l’exécution de l’imagerie in vivo molécule unique dans ce système et maintenant décrire comment particule de suivi peut être effectuée au troisième stade larvaire de Drosophila melanogaster .

<table><tbody><tr><td>PDMS (kit d’élastomère de silicone Sylgard 184)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture à fond de verre</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope optique</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler incurvée (style 5/45)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>Broches minutien (0.1mm)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider’s Insect Medium</td><td>Sigma, Sciences de la vie</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinces fines (Dumont #5)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscope</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (16 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear snaplock Tube de microcentrifugation (1,7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black logiciel d’acquisition</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>Plugin PALM Tracer</td></tr><tr><td>Souche</td><td></td><td>de mouche w1118 ; HA-SX1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique drosophila

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Un nombre croissant des techniques de microscopie de Super-résolution aident à découvrir les mécanismes qui gouvernent le monde cellulaire de l’échelle nanométrique. Imagerie de la molécule unique gagne du terrain car il fournit un accès exceptionnel à la visualisation des molécules dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons une technique que nous avons développé pour effectuer la microscopie de localisation de photoactivation de suivi de la particule (sptPALM) chez les larves de drosophile . Communication synaptique repose sur des protéines clés présynaptiques qui agissent en d’amarrage, d’amorçage et en encourageant la fusion neurotransmetteur contenant des vésicules avec la membrane plasmique. Une gamme des interactions protéine-protéine et protéine-lipide réglemente étroitement ces processus et les protéines présynaptiques donc présentent des changements dans la mobilité associée à chacun de ces événements majeurs. Étudier comment la mobilité de ces protéines est en corrélation avec leur fonction physiologique chez un animal vivant intacte est essentielle pour comprendre leur mécanisme d’action précis. Extraction de mobilité de la protéine avec haute résolution en vivo nécessite de surmonter les limitations telles que la transparence optique, l’accessibilité et la profondeur de pénétration. Les auteurs décrivent comment les protéines fluorescentes et le tag à la protéine présynaptique syntaxine-1 a peut être visualisé via léger éclairage oblique et suivis au terminal des nerfs moteurs ou le long de l’axone des motoneurones du troisième stade larvaire Drosophila larve.

En utilisant le protocole transgénique énumérés ci-dessus, syntaxine-1 a-mEos2 Drosophilamelanogaster ont été générés (Figure 1). Transgenic troisième stade larvaire Drosophila larves ont été disséqués sur le socle cylindrique de PDMS (Figure 2 a-F). Pour visualiser des molécules simples de la syntaxine-1 a, nous avons utilisé PALM sur un microscope TIRF avec laser légèrement oblique illumination14.
Molécules simples de la syntaxine-1 a ont été suivis sur les bornes présynaptiques nerf moteur musculaire 6 du second segment abdominal. La fluorescence verte de mEos2 pouvait être détectée comme illustré par l’image basse résolution de la syntaxine-1 a-mEos2 sur les boutons 1 b de type lorsqu’il est excité à l’aide du laser à 488 nm (Figure 3 a). Dans les expériences d’imagerie, la 405 nm et 561 nm excitation laser d’imagerie profondeurs étaient 133,5 nm et 165,6 nm, respectivement. L’image verte fut acquis en une moyenne de 16 images individuelles. Cette image verte a été utilisée pour créer la zone d’intérêt permet de limiter l’analyse des localisations dans le film de photoconverted aux bornes présynaptiques nerf moteur seuls.
L’analyse des films sptPALM photoconverted acquis généré une intensité extrêmement résolue, coefficient de diffusion, et des cartes de trajectoire (Figure 3 a). Mobilité de la syntaxine-1 a-mEos2 a été encore quantifiée par analyse du déplacement quadratique moyenne (TMS) des trajectoires individuelles (Figure 3 b). Comparaisons statistiques peuvent être faits en utilisant l’aire sous la courbe de la MSD (Figure 3 b). Une analyse plus approfondie de la mobilité donne la distribution de coefficient de diffusion de la syntaxine-1 a-mEos2, et cela peut être statistiquement évaluée par comparaison de la téléphonie mobile aux populations immobiles (Figure 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figure 1 : Générer des constructions mEos2-tag. Le pFL44S-attB-MCS-vecteur w + est linéarisé avec BamHI et XbaI. Des fragments qui se chevauchent chaîne par polymérase (PCR) codant pour la protéine d’intérêt (POI) et mEos2, respectivement, peut être cloné, par exemple, par une recombinaison in vivo dans des cellules de levure ura3 - ou par assemblage de Gibson. Notez que pour générer le transgène syntaxine-1 a-mEos2, nous avons cloné la construction flanquée par les séquences de promoteur et terminateur syntaxine-1 a endogènes. La construction qui en résulte peut ensuite être injectée dans des embryons de drosophile pour créer une ligne mouche transgénique exprimant la protéine d’intérêt (POI) fusionnée à mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figure 2 : Drosophila dissection de la larve et éclairage oblique. (A) schéma montrant la dissection de larve de drosophile effectuée sur base PDMS demi-cylindrique. Une larve en filets se tenait sur les PDMS gel par l’utilisation de broches minutien. (B-C) La préparation de la larve-PDMS a été placée à l’intérieur d’une boîte de Petri à fond de verre contenant les insecte milieu de Schneider. Un microscope TIRF dans une configuration d’éclairage légèrement oblique a été utilisé pour visualiser la syntaxine-1 a-mEos2 dans les terminaisons des nerfs moteurs. (D-F) Une base PDMS demi-cylindrique avec larve de drosophile disséqué. La préparation de la larve-PDMS a été placée dans un plat d’imagerie rempli de milieu de Schneider, et la larve a été photographiée sur le microscope PALM Super-résolution. Barre de l’échelle, 10 mm. (ce chiffre a été modifié par14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figure 3 : In vivo suivi de la syntaxine-1 a-mEos2 au nerf moteur présynaptique borne. (A) A la FRBR image à basse résolution de la syntaxine-1 a-mEos2 sur un nerf moteur 1 b type terminal. Analyse de photoconversion films projetés à 33 Hz généré sptPALM intensité Super résolu, coefficient de diffusion et trajectoire cartes. 5 309 trajectoires individuelles ont été imagé plus 16 000 images film acquisition. Echelle, 3 μm. (B-C) Quadratique moyenne cylindrée (MSD) de la syntaxine-1 a-mEos2 a été tracée de 6 bornes de différents nerfs moteurs ; aire sous la courbe de la MSD (AUC) a été utilisé pour quantifier le degré de mobilité. La distribution de coefficient de diffusion révèle mobiles et immobiles populations syntaxine-1 a qui peuvent être quantifiées sous forme de rapport des uns des autres ; une moyenne de ~ 2 400 trajectoires ont été obtenues par des nerfs moteurs terminal (n = 3 larves). Données présentées comme moyenne erreur-type de la moyenne. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Suivi in vivo d’une seule molécule à la terminaison nerveuse motrice présynaptique de la drosophile. Cette technique décrit comment des protéines uniques peuvent être suivies et imagées in vivo au niveau des terminaisons nerveuses motrices des larves de drosophile du troisième stade. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’imager, de suivre et de localiser des protéines uniques à des résolutions élevées similaires à celles observées dans les systèmes in vitro.Conception de drosophile transgénique. La protéine synaptique d’intérêt est marquée par un fluorophore photoconvertible, qui est exprimé chez Drosophila melanogaster. Dissection de la larve de drosophile du troisième stade.Placez une larve errante du troisième stade sur une base Sylgard de forme cylindrique ou semi-cylindrique. Ajoutez 40 microlitres de Schneider’s Insect Medium sur la larve. Sous un microscope à dissection, enfoncez une épingle minutien dans la tête et une autre dans la queue de la larve pour l’immobiliser.Pour permettre l’accès, utilisez une épingle minutien pour faire une incision étroite sur la ligne médiane de la face dorsale de la région abdominale de la larve. À partir de ce point d’incision, à l’aide de ciseaux à ressort, coupez le long de la paroi du corps dans la direction antérieure et postérieure. Retirez les organes internes de la larve à l’aide de pinces fines et de ciseaux à ressort.Lavez la larve disséquée avec le milieu pour insectes de Schneider. Enfoncez deux épingles minutieuses dans chacun des deux rabats de la paroi du corps pour produire une préparation de larve disséquée en forme d’hexagone. Utilisez des ciseaux à ressort pour détacher le cerveau de la larve du cordon nerveux ventral.À l’aide d’une pince à épiler incurvée, enfoncez les goupilles minutien dans la base Sylgard. Microscopie de localisation photo-activée à suivi de particule unique. Renversez la base Sylgard de la larve sur une boîte de culture à fond de verre remplie de deux millilitres de milieu pour insectes Schneider à température ambiante.Appliquez de l’eau sur l’objectif à immersion dans l’eau 63x d’un microscope ELYRA PS.1, puis placez la parabole sur la platine. Allumez la lumière transmise et utilisez l’oculaire pour localiser la larve sur la base Sylgard à l’aide de l’objectif aérien 10x. Passez à l’objectif d’immersion dans l’eau 63x et identifiez le muscle six à l’aide d’un éclairage en champ clair.À l’aide du logiciel d’acquisition ZEN Black, sélectionnez la configuration TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Commutez le laser de 488 nanomètres pour visualiser eMos2 en vert. Localisez les jonctions neuromusculaires, qui ressemblent à des perles sur une ficelle, et acquérez une image TIRF à basse résolution, allumez simultanément le laser de 405 nanomètres et le laser de 561 nanomètres afin de photoconvertir et d’imager les espèces rouges eMos2.Utilisez une très faible puissance laser pour le laser de 405 nanomètres afin de permettre des photoconversions stochastiques modérément constantes. Ici, un laser de 405 nanomètres fonctionne à 0,09 % tandis qu’un laser de 561 nanomètres fonctionne à 50 %Dans les options d’angle TIRF du logiciel, faites légèrement glisser l’angle critique TIRF. Réglez le temps d’exposition à 30 millisecondes.Acquérir une série chronologique d’images de la jonction neuromusculaire. Ici, un film de 15 000 images a été acquis. Enregistrez le film au format czi.Analyse des données. Analysez les films acquis à l’aide d’un logiciel d’analyse de suivi monomoléculaire approprié. Localisez les coordonnées x et y de la localisation de chaque protéine fluorescente par l’ajustement gaussien de la fonction d’étalement du point d’intensité.Pour suivre la trajectoire de chaque localisation, définissez un seuil d’un minimum de huit apparences d’image différentes continues pour chaque localisation et d’une mobilité maximale de trois pixels entre chaque image. Obtenez l’image de la trajectoire, le déplacement carré moyen, ainsi que le coefficient de diffusion de toutes les localisations suivies. Des résultats représentatifs.Le déplacement carré moyen des trajectoires individuelles de Syntaxin-1A-eMos2 à partir de plusieurs jonctions neuromusculaires chez trois larves différentes a été tracé, comme moyenne plus moins erreur type de moyenne. L’aire sous la courbe de déplacement carré moyen a également été tracée. Le coefficient de diffusion de Syntaxin-1A-mEos2 a été obtenu de manière similaire à partir de plusieurs jonctions neuromusculaires et tracé sous forme d’histogramme de la distribution de fréquence relative.Le seuil du coefficient de diffusion a révélé deux populations de Syntaxin-1A, une population mobile et une population immobile. Le rapport entre les populations mobiles et immobiles de Syntaxin-1A-mEos2 a été calculé. Conclusion. Cette vidéo devrait permettre de comprendre comment le suivi d’une seule protéine peut être effectué à la jonction neuromusculaire des larves de drosophile.Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la communication neuronale de visualiser et d’observer la mobilité et l’organisation de protéines uniques à haute résolution in vivo.

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Enregistrements électrophysiologiques...

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Ce protocole traite de la dissection en direct...

Visualisation in vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire

Ce protocole décrit une méthode fiable pour l'anesthésie et l'imagerie de...

L&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

Cette vidéo montre la technique d'enregistrement des courants synaptiques à partir d'un bouton synaptique à la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Cette technique permet de surveiller l’activité d’un seul bouton synaptique, ce qui est important pour l’étude des lignées de mouches mutantes avec une activité synaptique spontanée ou asynchrone accrue.

Enregistrement des courants synaptiques à la jonction neuromusculaire larvaire de la drosophile

Dans cette vidéo, les fibres nerveuses des larves de drosophile sont immergées dans un colorant FM, qui se lie aux lipides de la membrane cellulaire. La microélectrode d’aspiration et les impulsions électriques stimulent le processus d’endocytose, incorporant le colorant FM dans les vésicules endocytaires nouvellement formées. Cette méthode, qui permet de visualiser les stades présynaptiques de la neurotransmission, est utile pour étudier la fonction synaptique et la libération de...

Chargement et déchargement du colorant FM médié par des microélectrodes dans les cellules nerveuses des larves de drosophile

Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

Ici, nous décrivons la méthode que nous avons employée pour imager la filodose dendritique fortement motivoir dans une préparation en direct du cerveau larvaire de Drosophila, et le protocole que nous avons développé pour quantifier des ensembles de données d'imagerie 3D de time-lapse pour des évaluations quantitatives du dendrite dynamique dans le développement des neurones.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.

Utilisation de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile et des cellules musculaires pour visualiser le réseau de microtubules

Découvrez le suivi de molécules uniques in vivo au terminal nerveux moteur présynaptique de Drosophila melanogaster. Cette méthode PALM permet d'imager et de localiser des protéines synaptiques individuelles avec une haute résolution.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

Explorer plus de vidéos