Name: Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez l'analyse structurale hybride par cristallographie aux rayons X et SAXS pour modéliser les régions désordonnées de la protéine Nsa1 de S. cerevisiae. Cette méthode permet d'étudier les domaines dynamiques inaccessibles à la cristallographie seule.

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Diffraction des données ont été recueillies à Southeast Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) 22-ID et 22-BM faisceaux à l’Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Les données SAXS ont été recueillies sur la ligne de faisceaux SIBYLLES à la Source de lumière avance (SLA), Lawrence Berkeley National Laboratory. Nous tenons à remercier le personnel à la source de rayonnement SIBYLLES pour leur contribution à la collecte de données à distance et le traitement. Nous sommes reconnaissants à la National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) recherche de spectrométrie de masse et le groupe de soutien pour aider à déterminer les limites du domaine protéine. Ce travail a été soutenu par l’U.S. National Institute de santé intra-muros recherche Program ; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247 à R. E. S.) et les Instituts canadiens de recherche en santé (du Canada IRSC, 146626 à M.C.P). Utilisation de l’APS a été soutenue par le US Department of Energy, le Bureau de la Science, le Bureau des Sciences de l’énergie base sous le contrat no. W-31-109-Eng-38. Utilisation de l’Advanced Light Source (ALS) a été prise en charge par le directeur, Office of Science, Office de base Sciences de l’Energie, de l’US Department of Energy, sous le contrat no. DE-AC02-05CH11231. Un soutien supplémentaire pour le SIBYLLES SAXS beamline provient de l’Institut National de la santé du projet MINOS (R01GM105404) et un haut de gamme Instrumentation Grant S10OD018483. Nous tenons également à remercier Andrea Moon et Dr. Sara Andres pour leur lecture critique de ce manuscrit.

<ol><li>Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+biogenesis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).</li>
<li>Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Puzzle+of+Life%3A+Crafting+Ribosomal+Subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits.</a> Trends Biochem Sci. , (2017).</li>
<li>Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+preribosomal+RNA+processing+pathways+in+yeast%2C+plant+and+human+cells+-+focus+on+coordinated+action+of+endo-+and+exoribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells - focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases.</a> FEBS Lett. , (2017).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19879902">Driving ribosome assembly.</a> Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).</li>
<li>Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA+ATPase+Rix7+powers+progression+of+ribosome+biogenesis+by+stripping+Nsa1+from+pre-60S+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles.</a> J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).</li>
<li>Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA-ATPase+NVL2+acts+on+MTR4-exosome+complex+to+dissociate+the+nucleolar+protein+WDR74%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophy+Res+Co%22%5BJournal%5D)">AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74.</a> Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).</li>
<li>Maserati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr74+is+required+for+blastocyst+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse.</a> PLoS One. 6 (7), e22516(2011).</li>
<li>Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+noncoding+regulatory+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer.</a> Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).</li>
<li>Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+Reveals+Features+of+Ribosome+Assembly+Factor+Nsa1%2FWDR74+Important+for+Localization+and+Interaction+with+Rix7%2FNVL2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2.</a> Structure. 25 (5), 762-772 (2017).</li>
<li>Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+hybrid%3A+EM%2C+crystallography%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Go hybrid: EM, crystallography, and beyond.</a> Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?</a> Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).</li>
<li>Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+flexible+proteins+using+small-angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering.</a> J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).</li>
<li>Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+expression+and+purification+problems+of+RhoGDI+using+a+family+of+%22parallel%22+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expres+Purif%22%5BJournal%5D)">Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of "parallel" expression vectors.</a> Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).</li>
<li>Doublie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+selenomethionyl+proteins+for+phase+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination.</a> Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallography+for+aspiring+crystallographers+or+how+to+avoid+pitfalls+and+traps+in+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination.</a> FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Crystallography%2C+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision-making+in+structure+solution+using+Bayesian+estimates+of+map+quality%3A+the+PHENIX+AutoSol+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>McCoy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+structures+of+protein+complexes+by+molecular+replacement+with+Phaser%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D%22%5BJournal%5D)">Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser.</a> Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Dyer, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SAXS+for+the+characterization+of+biomolecules+in+solution%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach.</a> Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).</li>
<li>Forster, S., Apostol, L., Bras, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?s0021889810008289">Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering.</a> J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).</li>
<li>Petoukhov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+the+ATSAS+program+package+for+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis.</a> J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).</li>
<li>Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?ks5004">PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis.</a> J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).</li>
<li>Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0087">Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria.</a> J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).</li>
<li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+mass%2C+models+and+resolution+by+small-angle+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering.</a> Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+rigid+body+modeling+of+macromolecular+complexes+against+small-angle+scattering+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data.</a> Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).</li>
<li>Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889895007047">CRYSOL - A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates.</a> J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).</li>
<li>Schrödinger, LLC. The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://pymol.org">https://pymol.org</a> (2015).</li>
<li>Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Physiol+Biophys%22%5BJournal%5D)">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).</li>
<li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26841758">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+in+proteins%3A+impact+of+the+crystal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment.</a> Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).</li>
<li>Shtykova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+influenza+A+virus+matrix+protein+M1+and+its+self-assemblies+at+low+pH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH.</a> PLoS One. 8 (12), e82431(2013).</li>
<li>Mallam, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structures+of+DEAD-box+RNA+chaperones+reveal+conformational+changes+and+nucleic+acid+tethering+by+a+basic+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).</li>
<li>Papaleo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Protein+Loops+and+Linkers+in+Conformational+Dynamics+and+Allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery.</a> Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).</li>
<li>Rozycki, B., Boura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large%2C+dynamic%2C+multi-protein+complexes%3A+a+challenge+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology.</a> J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103(2014).</li>
<li>Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+structural+biology+to+unravel+molecular+mechanisms+of+protein-RNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition.</a> Methods. 118, 119-136 (2017).</li>
<li>Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Functional+Dynamics+of+Modular+Multidomain+Proteins+by+SAXS+and+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR.</a> Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Utilisant ce protocole, recombinant Nsa1 de S. cerevisiae a été généré pour les études structurales par cristallographie aux rayons x et SAXS. Nsa1 s’est bien comporté en solution et cristallise sous plusieurs formes cristallines. Au cours de l’optimisation de ces cristaux, on a découvert que l’extrémité C-terminale de Nsa1 a été sensible à la dégradation de la protéase. La haute résolution, forme cristalline orthorhombique n’a pu être reproduite avec des variantes de troncation de C-terminal de Nsa1, probableme...

Les ribosomes sont des machines de ribonucléoprotéine grand qui exécutent le rôle essentiel de la traduction des ARNm en protéines dans toutes les cellules vivantes. Les ribosomes sont composées de deux sous-unités qui sont produites dans un processus complexe appelé ribosome biogenèse1,2,3,4. Assemblage du ribosome eucaryote s’appuie sur l’aide de centaines d’Assemblée ribosomique essentiels facteurs2,3,5. Nsa1 (Nop7 associés 1) est un facteur d’assemblage de ribosomes eucaryotes qui est formellement requis pour la production de la grande sous-unité ribosomique6, et est connu comme WD-répétition contenant 74 (WDR74) au plus élevé des organismes7. WDR74 s’est avéré être requis pour la formation du blastocyste en souris8et le promoteur WDR74 est fréquemment muté dans les cellules de cancer9. Cependant, la fonction et des mécanismes précis de Nsa1/WDR74 dans l’assemblage du ribosome sont encore largement inconnus. Pour commencer à découvrir le rôle de Nsa1/WDR74 au cours de la maturation des ribosomes eucaryotes, multiples analyses structurelles ont été effectuées, y compris la cristallographie aux rayons x et petit angle de dispersion (SAXS) rayons x10.
Cristallographie aux rayons x, spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), microscopie électronique et SAXS sont tous importants techniques pour étudier la structure macromoléculaire. Taille, forme, disponibilité et stabilité des influences de macromolécules adaptée de la méthode de biologie structurale pour lesquels une macromolécule particulière sera le meilleure, cependant combinant plusieurs techniques grâce à une approche dite « hybride » devient un outil de plus en plus bénéfique11. En particulier, diffraction et SAXS sont puissants et complémentaires des méthodes pour la détermination de structure des macromolécules12.
Cristallographie fournit la structure atomique haute résolution allant de petites molécules à grande machinerie cellulaire telles que le ribosome et a conduit à de nombreuses percées dans la compréhension des fonctions biologiques de protéines et d’autres 13de macromolécules. En outre, conception de médicaments basée sur la structure exploite la puissance des structures cristallines pour l’amarrage moléculaire par des méthodes de calcul, ajoutant une dimension critique à la drogue découverte et développement14. Malgré son applicabilité large, souples et désordonnées des systèmes sont difficiles à évaluer par cristallographie puisque l’empilement cristallin peut être entravé ou cartes de densité d’électron peuvent être incomplètes ou de mauvaise qualité. À l’inverse, SAXS est une approche structurelle faible résolution et axée sur la solution capable de décrire les systèmes flexibles allant de boucles désordonnées et termini à protéines intrinsèquement désordonnées12,15,16. Vu qu’il est compatible avec un large éventail de tailles de particules12, SAXS peuvent agissent en synergie avec la cristallographie à élargir l’éventail des questions biologiques qui peuvent être traités par des études structurales.
Nsa1 est adapté pour une approche structurelle de l’hybride car il contient un domaine WD40 bien structuré, suivi d’un C-terminus fonctionnel, mais flexible qui n’est pas favorable à des méthodes de diffraction des rayons x. Voici un protocole pour le clonage, expression et purification de Nsa1 de S. cerevisiae pour la détermination de structure hybride par cristallographie aux rayons x et SAXS. Ce protocole peut être adapté pour étudier les structures d’autres protéines qui sont constituées d’une combinaison de régions ordonnées et désordonnées.

<table><tbody><tr><td>Molecular Cloning of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMBP2</td><td>parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)</td><td></td><td>Nous avons utilisé une version modifiée de pMBP2 qui comprenait un His-tag N-terminal (pHMBP)</td></tr><tr><td>S. cerevisiae genomic</td><td>DNA ATCC</td><td>204508D-5</td><td></td></tr><tr><td>Primers for cloning Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLFw</td><td>IDT</td><td></td><td>CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGT GGATAG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_FLRv</td><td>IDT</td><td></td><td>AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCFw</td><td>IDT</td><td></td><td>GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG</td></tr><tr><td>SC_Nsa1_DeltaCRv</td><td>IDT</td><td></td><td>GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC</td></tr><tr><td>Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>pMBP- NSA1 et diverses troncatures</td><td>Lo et al., 2017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Selenomethionine</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD12-503B</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, sans dioxane</td><td>Promega</td><td>V3953</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase sans EDTA Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>7560-1-80</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Tris, 1 M pH7.5</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-029</td><td></td></tr><tr><td>bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1M Imidazole, pH 8,0</td><td>Teknova</td><td>I6980-06</td><td></td></tr><tr><td>Talon Affinity Resin</td><td>Clonetech</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL Filtre centrifuge (MWCO 10K)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Colonne de filtration</td><td>GE-Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>TEV Protéase</td><td>préparée par NIEHS Expression protéique</td><td>Plasmide d’expression de base fourni par NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)</td><td></td></tr><tr><td>4-15 % Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>456-8056</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization, Proteolytic Screening</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Écran Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Écran Crystal 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>Salt Rx</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Index Screen</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Écran PEG/Ion</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>JCSG+</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-37</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Precipitant Synergy</td><td>Dimensions moléculaires</td><td>MD15-PS-T</td><td></td></tr><tr><td>Swissci 96-well 3-drop UVP</td> sitting drop plates <td>TTP Labtech</td><td>4150-05823</td><td></td></tr><tr><td>Ruban d’étanchéité transparent cristallin de 3 pouces de large</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td></td></tr><tr><td>Proti-Ace Kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-429</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1500</td><td>Dimensions</td> <td>moléculairesMD2-100-6</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Dimensions moléculaires</td><td>MD2-100-3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES/hydroxyde de sodium pH 7,5</td><td>Dimensions moléculaires</td><td>MD2-011-Citrate</td><td></td></tr> <tr><td>de sodium tribasique</td><td>Dimensions moléculaires</td><td>MD2-100-127</td><td></td></tr><tr><td>22 mm x 0,22 mm Lames de couverture siliconées</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>24 Plaques de puits avec mastic (Plaque VDX avec Produit d’étanchéité)</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>18 mM Boucles en nylon montées (0,05 mm à 0,5 mM)</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perles de rocaille</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Capuchons à cristaux magnétiques</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-779</td><td></td></tr><tr><td>Baguette cryogénique magnétique</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Mousse cryogénique Dewar</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Système de rondelle en cristal</td><td>MiTeGen</td><td>M-CP-111-021</td><td></td></tr><tr><td>Jupe complète 96 puits Plaque transparente</td><td>VWR</td><td>10011-228</td><td></td></tr><tr><td>Tapis d’étanchéité AxyMat</td><td>VWR</td><td>10011-130</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVEX-m</td><td>JAN Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Nanodrop Lite</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Robot</td><td>TTP Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software/Websites</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HKL2000</td><td>Otwinoski et Minor, 1997</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>Adams et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>Emsley et al., 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATSAS</td><td>Petoukhov et al., 2012</td><td></td><td>https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/</td></tr> <tr><td>Scatter</td><td>Rambo et Tainer, 2013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Le système de graphisme moléculaire PyMOL, version 1.8 Schr&ouml ; dinger, LLC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUNCH</td><td>Petoukhov et Svergun, 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRYSOL</td><td>Svergun et al, 1995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al, 2003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOM</td><td>Tria et al, 2015</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit angle pour modéliser des régions non structurées de nsa1 de s. cerevisiae

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Détermination de la structure pleine longueur de facteur d’assemblage de ribosome Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) est difficile à cause du désordre et de la protéase labile extrémité C-terminale de la protéine. Cet article décrit les méthodes pour purifier recombinant Nsa1 de S. cerevisiae pour l’analyse structurale par diffraction des rayons x et SAXS. Cristallographie aux rayons x a été utilisée pour résoudre la structure du domaine N-terminal WD40 bien ordonnée de Nsa1, et ensuite les SAXS a été utilisée pour résoudre la structure de l’extrémité C-terminale de la Nsa1 en solution. Données de diffusion solution a prélevé la pleine longueur Nsa1 en solution. Les amplitudes de diffusion théoriques sont calculées à partir de la structure cristalline à haute résolution de la domaine de WD40, et une combinaison de corps rigide et ab initio de modélisation révèle alors l’extrémité C-terminale de Nsa1. Grâce à cette approche hybride, la structure quaternaire de la protéine entière a été reconstruite. Les méthodes présentées ici devraient être généralement applicables pour la détermination de structure hybride d’autres protéines, composé d’un ensemble de domaines structurées et non structurées.

Nsa1 était PCR amplification de l’ADN génomique de S. cerevisiae et subcloned dans un vecteur contenant une balise d’affinité N-terminal 6 x-Histidine suivie de MBP et un site de protéase TEV. Nsa1 fut transformé en cellules d’e. coli BL21 (DE3) et des rendements élevés de l’expression de la protéine ont été obtenues suite à induction avec IPTG et croissance à 25 ° C durant la nuit (Figure 1 a). Nsa1 a été purifiés par affinité sur résine co...

Cette méthode décrit le clonage, expression et purification de Nsa1 recombinant pour détermination structurale par diffraction des rayons x et la diffusion des rayons x de petits angles (SAXS) et est applicable pour l’analyse structurale de l’hybride d’autres protéines contenant à la fois ordonnée et désordonnée des domaines.

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

L’objectif global de cette procédure est de produire une protéine recombinante composée d’un mélange de domaines ordonnés et désordonnés pour l’analyse structurale hybride par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie structurale sur l’utilisation de la fonction biologique de sorte que la détermination de toutes les solutions reste la structure de la protéine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour modéliser des régions dynamiques d’une protéine ou d’une macromolécule qui ne peuvent pas être résolues par cristallographie aux rayons X.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal au début à apprendre à évaluer correctement la qualité de leurs données SAXS. Pour commencer la procédure, transformez un plasmide d’expression Nsa1 en une souche d’expression d’E. coli appropriée. Cultivez les cellules, induisez l’expression de Nsa1 et récoltez les cellules.Remettre les cellules en suspension dans 25 millilitres de tampon de lyse, pré-refroidir à quatre degrés Celsius, contenant un comprimé inhibiteur de protéase sans EDTA. Soniquez les cellules à quatre degrés Celsius pendant sept minutes, avec un cycle de deux secondes de marche, deux secondes d’arrêt. Ensuite, centrifugez le lysat à 26, 900 fois la gravité pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.Assurez-vous que le mélange ne gèle pas pendant la centrifugation. Ensuite, équilibrez une colonne d’écoulement par gravité contenant 10 ml de résine d’affinité de cobalt immobilisée avec tampon de lyse. Chargez le lysat clarifié sur la colonne et laissez-le s’écouler à travers la résine à quatre degrés Celsius.Ensuite, lavez la résine deux fois avec des portions de 100 ml de tampon de lyse. Éluer Nsa1 de la colonne avec 20ml de tampon d’élution. Appliquez une aliquote de 15 mcl de l’éluée sur un gel SDS-PAGE de quatre à 15 % pour confirmer l’élution de la protéine.Ensuite, ajoutez 1 ml de la solution mère de protéase TEV 1 mg/ml à l’éluère. Incuber l’éluère à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour retirer l’étiquette MBP. Ensuite, utilisez une unité de filtration centrifuge de 10 kilodaltons pour concentrer le Nsa1 clivé par MBP à environ 5 ml, en faisant attention de ne pas trop concentrer.Purifiez la protéine concentrée sur une colonne de filtration sur gel pré-équilibrée avec le tampon A.L’une des étapes critiques de cette procédure consiste à s’assurer que vous éliminez tous les agrégats pendant la purification. Les agrégats interfèrent avec la cristallisation et l’acquisition et l’analyse des données SAXS. Analysez des échantillons de 15 mcl de chaque fraction de colonne avec SDS-PAGE pour confirmer la séparation de MBP et de Nsa1.Combinez les fractions contenant Nsa1. Utilisez une unité de filtration centrifuge de 10 kilodaltons pour concentrer les fractions combinées à environ 8 mg/ml. Mesurez l’absorbance à 289 nanomètres et calculez la concentration en protéines.Procéder immédiatement au criblage protéolytique et aux essais de cristallisation. Pour commencer le criblage protéolytique, préparez des solutions mères de 1 mg/ml d’alpha-comotrypsine, de trypsine, d’élastase, de capayine, de septilisine et d’endoprotéinase GluC. Diluer chaque solution mère avec un tampon de dilution à 1:10, 1:100 et 1:1, 000.Diluez la solution de 8 mg/ml de Nsa1 à 1 mg/ml avec le tampon A.Ensuite, pour chaque dilution de protéase, combinez 1 mcl de dilution de protéase avec 9 mcl de stock de protéines diluées. Incuber les solutions à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, ajoutez 10 mcl de 2 échantillons SDS-PAGE pour tamponner chaque solution et chauffez les solutions à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Exécutez les solutions sur un gel SDS-PAGE de quatre à 15 % pour identifier les domaines résistants à la protéase. Créez des constructions d’expression tronquées qui excluent les régions labiles de la protéase. Exprimer et purifier ces protéines pour optimiser la cristallisation.Après avoir acquis des données SAXS pour la protéine Nsa1 sur une plage de concentrations, définissez le chemin d’accès au fichier shell du terminal dans le répertoire contenant les données. Ensuite, lancez le logiciel d’analyse. Chargez les courbes de diffusion dans le logiciel d’analyse.Utilisez l’outil RG automatique pour déterminer le rayon de giration et l’intensité de diffusion vers l’avant pour chaque courbe. Ensuite, générez des diagrammes de Kratky pour chaque courbe de diffusion afin de déterminer le degré de compacité. À l’aide de l’outil autonome, vous pouvez calculer la fonction de distribution par paires pour chaque courbe, en utilisant une dimension maximale de départ de 3x le rayon de giration.Optimisez la dimension maximale pour obtenir une courbe de fonction de distribution lisse, par paire, cohérente avec la courbe de diffusion expérimentale. Comparer les paramètres structurels entre les concentrations pour vérifier l’absence de dommages causés par le rayonnement ou d’effets dépendants de la concentration. Il est essentiel de comparer les paramètres structurels clés, notamment le rayon de giration, la masse moléculaire, la diffusion vers l’avant et les fonctions de distribution de distance de paire sur une série de concentrations.Et c’est pour s’assurer qu’il n’y a pas de dommages causés par les radiations ou d’effets sur la concentration. Ensuite, exécutez l’utilitaire de méthode d’optimisation d’ensemble à l’aide du fichier de structure cristalline de protéine de départ, du fichier de séquence de protéine cible et du fichier de données expérimental SAXS. Comparez les valeurs du chi carré du fichier de structure cristalline de départ au fichier d’ensemble pour déterminer si le modèle d’ensemble s’adapte bien aux données expérimentales.Utilisez un logiciel de visualisation moléculaire pour superposer la structure cristalline avec les conformateurs générés. Notez le nombre total de conformants et la fraction d’occupation de chaque conformateur contribuant à la courbe de diffusion. Le clivage protéolytique de la protéase labile C terminale de Nsa1 a entraîné la formation de cristaux orthorhombiques.Le Nsa1 fraîchement purifié a formé des cristaux cubiques, mais la structure cristalline manquait encore de densité électronique pour l’extrémité c terminale labile. Le domaine WD-40 de l’hélice bêta à sept blattes n-terminale de Nsa1 était bien résolu dans les deux structures. Le domaine Nsa1 WD-40 seul n’était pas bien adapté aux données expérimentales SAXS.Une combinaison de modélisation de corps rigide et de reconstruction abinitiale de l’extrémité C a considérablement amélioré la qualité de l’ajustement. La modélisation d’ensemble a permis d’améliorer encore plus la qualité de l’ajustement, révélant l’échantillonnage de confirmation de la queue C-terminale en solution. Bien que SAXS soit une technique structurale à basse résolution, elle complète très bien les études structurales à haute résolution, comme la cristallographie aux rayons X.Vous pouvez donc modéliser des régions souples et désordonnées. En collectant et en analysant les données SAXS de la macromolécule, vous pouvez commencer à comprendre le changement de confirmation qui s’est produit lors de Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de résoudre la structure d’une protéine composée de régions ordonnées et désordonnées à la fois par cristallographie aux rayons X et SAXS.

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Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal

Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

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