Combinant la diffractométrie de rayons x avec la diffusion des rayons x petit Angle pour modéliser des régions non structurées de Nsa1 de S. Cerevisiae

L’objectif global de cette procédure est de produire une protéine recombinante composée d’un mélange de domaines ordonnés et désordonnés pour l’analyse structurale hybride par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie structurale sur l’utilisation de la fonction biologique de sorte que la détermination de toutes les solutions reste la structure de la protéine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour modéliser des régions dynamiques d’une protéine ou d’une macromolécule qui ne peuvent pas être résolues par cristallographie aux rayons X.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal au début à apprendre à évaluer correctement la qualité de leurs données SAXS. Pour commencer la procédure, transformez un plasmide d’expression Nsa1 en une souche d’expression d’E. coli appropriée. Cultivez les cellules, induisez l’expression de Nsa1 et récoltez les cellules.

Remettre les cellules en suspension dans 25 millilitres de tampon de lyse, pré-refroidir à quatre degrés Celsius, contenant un comprimé inhibiteur de protéase sans EDTA. Soniquez les cellules à quatre degrés Celsius pendant sept minutes, avec un cycle de deux secondes de marche, deux secondes d’arrêt. Ensuite, centrifugez le lysat à 26, 900 fois la gravité pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.

Assurez-vous que le mélange ne gèle pas pendant la centrifugation. Ensuite, équilibrez une colonne d’écoulement par gravité contenant 10 ml de résine d’affinité de cobalt immobilisée avec tampon de lyse. Chargez le lysat clarifié sur la colonne et laissez-le s’écouler à travers la résine à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez la résine deux fois avec des portions de 100 ml de tampon de lyse. Éluer Nsa1 de la colonne avec 20ml de tampon d’élution. Appliquez une aliquote de 15 mcl de l’éluée sur un gel SDS-PAGE de quatre à 15 % pour confirmer l’élution de la protéine.

Ensuite, ajoutez 1 ml de la solution mère de protéase TEV 1 mg/ml à l’éluère. Incuber l’éluère à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour retirer l’étiquette MBP. Ensuite, utilisez une unité de filtration centrifuge de 10 kilodaltons pour concentrer le Nsa1 clivé par MBP à environ 5 ml, en faisant attention de ne pas trop concentrer.

Purifiez la protéine concentrée sur une colonne de filtration sur gel pré-équilibrée avec le tampon A.L’une des étapes critiques de cette procédure consiste à s’assurer que vous éliminez tous les agrégats pendant la purification. Les agrégats interfèrent avec la cristallisation et l’acquisition et l’analyse des données SAXS. Analysez des échantillons de 15 mcl de chaque fraction de colonne avec SDS-PAGE pour confirmer la séparation de MBP et de Nsa1.

Combinez les fractions contenant Nsa1. Utilisez une unité de filtration centrifuge de 10 kilodaltons pour concentrer les fractions combinées à environ 8 mg/ml. Mesurez l’absorbance à 289 nanomètres et calculez la concentration en protéines.

Procéder immédiatement au criblage protéolytique et aux essais de cristallisation. Pour commencer le criblage protéolytique, préparez des solutions mères de 1 mg/ml d’alpha-comotrypsine, de trypsine, d’élastase, de capayine, de septilisine et d’endoprotéinase GluC. Diluer chaque solution mère avec un tampon de dilution à 1:10, 1:100 et 1:1, 000.

Diluez la solution de 8 mg/ml de Nsa1 à 1 mg/ml avec le tampon A.Ensuite, pour chaque dilution de protéase, combinez 1 mcl de dilution de protéase avec 9 mcl de stock de protéines diluées. Incuber les solutions à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, ajoutez 10 mcl de 2 échantillons SDS-PAGE pour tamponner chaque solution et chauffez les solutions à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Exécutez les solutions sur un gel SDS-PAGE de quatre à 15 % pour identifier les domaines résistants à la protéase. Créez des constructions d’expression tronquées qui excluent les régions labiles de la protéase. Exprimer et purifier ces protéines pour optimiser la cristallisation.

Après avoir acquis des données SAXS pour la protéine Nsa1 sur une plage de concentrations, définissez le chemin d’accès au fichier shell du terminal dans le répertoire contenant les données. Ensuite, lancez le logiciel d’analyse. Chargez les courbes de diffusion dans le logiciel d’analyse.

Utilisez l’outil RG automatique pour déterminer le rayon de giration et l’intensité de diffusion vers l’avant pour chaque courbe. Ensuite, générez des diagrammes de Kratky pour chaque courbe de diffusion afin de déterminer le degré de compacité. À l’aide de l’outil autonome, vous pouvez calculer la fonction de distribution par paires pour chaque courbe, en utilisant une dimension maximale de départ de 3x le rayon de giration.

Optimisez la dimension maximale pour obtenir une courbe de fonction de distribution lisse, par paire, cohérente avec la courbe de diffusion expérimentale. Comparer les paramètres structurels entre les concentrations pour vérifier l’absence de dommages causés par le rayonnement ou d’effets dépendants de la concentration. Il est essentiel de comparer les paramètres structurels clés, notamment le rayon de giration, la masse moléculaire, la diffusion vers l’avant et les fonctions de distribution de distance de paire sur une série de concentrations.

Et c’est pour s’assurer qu’il n’y a pas de dommages causés par les radiations ou d’effets sur la concentration. Ensuite, exécutez l’utilitaire de méthode d’optimisation d’ensemble à l’aide du fichier de structure cristalline de protéine de départ, du fichier de séquence de protéine cible et du fichier de données expérimental SAXS. Comparez les valeurs du chi carré du fichier de structure cristalline de départ au fichier d’ensemble pour déterminer si le modèle d’ensemble s’adapte bien aux données expérimentales.

Utilisez un logiciel de visualisation moléculaire pour superposer la structure cristalline avec les conformateurs générés. Notez le nombre total de conformants et la fraction d’occupation de chaque conformateur contribuant à la courbe de diffusion. Le clivage protéolytique de la protéase labile C terminale de Nsa1 a entraîné la formation de cristaux orthorhombiques.

Le Nsa1 fraîchement purifié a formé des cristaux cubiques, mais la structure cristalline manquait encore de densité électronique pour l’extrémité c terminale labile. Le domaine WD-40 de l’hélice bêta à sept blattes n-terminale de Nsa1 était bien résolu dans les deux structures. Le domaine Nsa1 WD-40 seul n’était pas bien adapté aux données expérimentales SAXS.

Une combinaison de modélisation de corps rigide et de reconstruction abinitiale de l’extrémité C a considérablement amélioré la qualité de l’ajustement. La modélisation d’ensemble a permis d’améliorer encore plus la qualité de l’ajustement, révélant l’échantillonnage de confirmation de la queue C-terminale en solution. Bien que SAXS soit une technique structurale à basse résolution, elle complète très bien les études structurales à haute résolution, comme la cristallographie aux rayons X.

Vous pouvez donc modéliser des régions souples et désordonnées. En collectant et en analysant les données SAXS de la macromolécule, vous pouvez commencer à comprendre le changement de confirmation qui s’est produit lors de Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de résoudre la structure d’une protéine composée de régions ordonnées et désordonnées à la fois par cristallographie aux rayons X et SAXS.