Name: Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Découvrez la microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaire dans les embryons vivants de Xenopus laevis. Cette méthode rapide et peu invasive permet d'analyser le métabolisme cellulaire en développement.

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Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions GM114854 (pour avis) et CA211635 (pour avis), le Arnold et Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator grant (pour avis), le prix DuPont jeune professeur (pour avis), l’American Society for Mass Bourse de recherche de spectrométrie (pour avis) et bourses de la Fondation du Club COSMOS (à R.M.O. et E.P.P.). Les opinions et les conclusions exprimées dans cette publication sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement l’opinion officielle des sources de financement.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Microprobe CE-ESI-MS permet la caractérisation directe des métabolites dans des cellules individuelles en direct, librement des embryons en développement. Au cœur de l’approche sont deux sous-composants techniques, à savoir in situ les Microprélèvement capillaire et haute sensibilité CE-ESI-Mme comparativement à germes entiers dissection, Microprélèvement capillaire a l’avantage d’un fonctionnement rapide (quelques secondes par rapport à 5 min / élément de dissection), compatibilité avec la morphologie tridimens...

Une compréhension approfondie du développement embryonnaire nécessite la caractérisation de tous les changements moléculaires qui se déroulent dans chaque cellule de l’organisme en développement. Tandis que Next-Generation Sequencing avec amplification moléculaire permet de mesure profonde des unicellulaires transcriptomes1 en développement systèmes2,3, beaucoup moins on connaît la suite de molécules plus petites produite dans les cellules embryonnaires unique, y compris les protéines et, surtout, de métabolites (masse moléculaire &#60; ~ 1 500 Da). Avec une réponse rapide et dynamique aux événements intrinsèques et extrinsèques, le métabolome est un puissant descripteur d’État moléculaire de la cellule. Le métabolome unicellulaires, soulève donc la possibilité de suivre le développement spatial et temporel de l’hétérogénéité des cellules dans l’embryon précoce et d’identifier de nouvelles molécules pour les études fonctionnelles. Cependant, sans amplification moléculaire disponible pour ces molécules, détection du métabolome exige une sensibilité exceptionnelle à l’aide de la spectrométrie de masse (MS), qui est la technologie de choix pour l’analyse des métabolites.
Unicellulaire MS est une collection de technologies avec une sensibilité suffisante pour mesurer les métabolites dans des cellules individuelles (voir commentaires 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Échantillonnage reproductible des cellules et l’extraction efficace des métabolites sont essentiels à la réussite détection des métabolites dans des cellules individuelles. Dissection de la cellule entière de cellules identifiées d’embryons de Xenopus a permis la caractérisation des petites molécules et de peptides16. Autres approches emploient micropipettes pour échantillonner des cellules vivantes individuelles suivies de détection par ionisation par électrospray (ESI) MS. Par exemple, métabolites ont été mesurés en usine ou des cellules de mammifères par cellule unique vidéo MS17, sonde de pression18, seule sonde19et microscopie force fluidique20, parmi d’autres techniques21, 22,23,24. En outre, l’incorporation de séparation chimique avant d’ionisation dans le flux de travail MS unicellulaires simplifie efficacement le métabolome, atténuant ainsi les interférences potentielles pendant la génération d’ions avant la détection. Ce qui est important, séparation renseigne également composé spécifique afin d’aider à l’identification moléculaire. Électrophorèse capillaire (EC) a été utilisé pour détecter des métabolites dans unique disséqués25,26 microsampled27nerveuses, capture de petites molécules différences entre les phénotypes de neurone. Récemment, nous avons adapté CE au tandem ESI MS pour permettre la détection de niveau de trace de centaines de métabolites dans des cellules individuelles qui ont été disséqués de jeunes embryons de Xenopus laevis16,28. Ces études ont révélé des différences métaboliques surprenants entre les cellules à un stade précoce du développement embryonnaires et conduit à la découverte de métabolites avec précédemment inconnue des impacts du développement16.
Ici, nous fournissons un protocole permettant la détection des métabolites dans des cellules individuelles directement dans un embryon de vertébrés vivant à l’aide de la microsonde unicellulaires CE-ESI-MS29,30. L’organisme modèle choisi est la 8 à 32-cellule embryonnaire de X. laevis , bien que l’approche est également applicable aux derniers stades de développement et d’autres types d’organismes modèles. Ce protocole utilise capillaires affûtées multi-axes contrôle traductionnel sous direction par un système d’imagerie à haute résolution d’aspirer une partie de nL ~ 10 de cellules identifiées in situ dans l’embryon en développement morphologiquement complexe. Cette microsonde est évolutif à petites cellules et fonctionne dans les secondes, ce qui est suffisamment rapide pour suivre les lignées cellulaires chez l’embryon. Après extraction de polar ou de petites molécules apolaires, tels que les métabolites et de peptides, de l’échantillon prélevé en environ 4-5 µL de solution d’extraction, un 10 ~ nL de l’extrait obtenu est analysé dans une plate-forme de CE fait sur mesure, couplée à un spectromètre de masse ESI. Construction et l’exploitation de la plate-forme de CE-ESI-MS s’appuie sur les protocoles décrits ailleurs. 31 , 32 l’interface CE-ESI coaxiale est construit comme décrit ailleurs. 31 cette plate-forme est maintenue dans le régime de pulvérisation de cône-jet pour atteindre trace-niveau sensibilité avec une capacité pour la quantification sur une plage de dynamique de journal-ordre de 4-5 (relative28,29,30 ou absolue16). La plateforme de CE-ESI-MS offre 60-amol limite inférieure de détection avec 8 % écart-type relatif (RSD) en analyse quantitative sur une gamme éprouvée de 10 nM à 1 µM pour les petites molécules16, qui suffisent à caractériser les métabolites endogènes dans X. laevis cellules. Microprobed cellules continuent à se diviser au fur et l’embryon par le biais de développement30, permettant une analyse temporellement et spatialement résolue du métabolisme cellulaire. En effet, seule cellule CE-ESI-MS peut être utilisé pour trouver les différences métaboliques entre les cellules qui occupent la dorsale-ventral16,29, animal-végétal16et gauche-droite28 axes du développement ainsi que les cellules qui forment la lignée dorsale vouée de tissu nerveux d’une cellule d’ancêtre commun dans X. laevis30. Outre l’interrogation des différences métaboliques entre différentes cellules embryonnaires à différents stades de développement de l' embryon de X. laevis 30, nous prévoyons que les protocoles décrits ici soient appliquent à un large éventail de biomolécules et microsampled de cellules individuelles des différents stades du développement embryonnaire, mais aussi des autres types de cellules et des organismes modèles. En outre, la microsonde pourrait servir pour Microprélèvement alors qu’une autre plateforme compatible avec minuscules échantillons pourrait être utilisée pour la séparation et/ou la caractérisation des biomolécules.

<table><tbody><tr><td>Réactifs <> forts pour milieux de culture d’embryons</> fortschlorure</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>potasium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 366-1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>M 65-3</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de calcium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Cystéine</td><td>MP Biomedicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Trizma chlorhydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Metabolite Solvants d’extraction </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Water (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solvants et étalons pour CE-ESI-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide formique (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Eau (grade LC-MS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>5641-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’acétylcholine</td><td>Acros Organics</td><td>159170050</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Configuration de fabrication de microsonde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropippette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en borosilicate</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine et tranchante : Dumont #5, Biologie/Dumoxel</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc</td><td>11252-30</td><td>Résistant à la corrosion et autoclavable.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microprobe Sampling Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Stereomicroscope TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Doit être isolé vibratoirement.</td></tr><tr><td>Illuminateur, p. ex. Cols de cygne</td><td>Nikon</td><td>C-FLED2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>Warner Instrument, Handem, CT</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert (en plastique, jetables)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm et 80 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08184</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre (borosilicate, jetables)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend X1R</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation haute tension</td><td>Spellman</td><td>CZE1000R</td><td>Le HVPS peut être contrôlé à distance à l’aide d’un programme basse tension généré par un ordinateur personnel. Attention : La haute tension présente un risque d’électrocution ; Toutes les pièces de connexion doivent être mises à la terre ou soigneusement blindées pour éviter toute exposition accidentelle des utilisateurs.</td></tr><tr><td>Pousse-seringues (2)</td><td>Appareil Harvard</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Amscope</td><td>SM-3BZZ</td><td>Stéréomicroscope capable d’un grossissement de 4,5&fois, équipé d’un illuminateur pour surveiller le mode de pulvérisation de l’interface CE-ESI.</td></tr><tr><td>Étape de traduction XYZ</td><td>Thorlabs</td><td>PT3</td><td></td></tr><tr><td>Étape de traduction XYZ</td><td>Construite</td><td></td> sur mesure <td>Cette plate-forme est capable de charger des quantités de nanolitres d’échantillon dans le capillaire de séparation par injection hydrodynamique et de fournir le BGE pour l’EC. Les deux interfaces décrites dans ce travail ont permis d’injecter 6&ndash ; 10 nL d’échantillon en 1 min dans un capillaire de séparation de 1 m</td></tr><tr><td>Flacons d’échantillon en acier inoxydable</td><td>Fabrication</td><td></td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Flacon BGE en acier inoxydable</td> Capillaire en silice fondue <td>sur</td><td></td><td></td>mesure</tr><tr><td>(40 & micro ; m/105 et micro ; m ID/OD ; 100 cm)</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>capillaire en silice fondue (75 &micro ; m/360 et micro ; m ID/OD ; 100 cm)</td><td>Polymicro technologies</td><td>TSP075375</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur en acier inoxydable avec embouts émoussés (130/260 & micro ; m ID/OD)</td><td>Comté de Hamilton</td><td>21031A</td><td>Pour de meilleures performances, clivage laser et polissage fin de la pointe de l’émetteur.</td></tr><tr><td>Seringues (étanches au gaz) : 500 - 1000 & micro ; L</td><td>Hamilton Co.</td><td>Multimètre numérique 1750TTL</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse haute résolution</td><td>Fluke</td><td></td> Fluke 117 Bruker Daltonics Maxis Impact HD <td>Spectromètre de masse tandem haute résolution équipé d’une interface atmosphère-pression configurée pour ESI</td></tr><tr><td>Mélange de réglage pour l’étalonnage du spectromètre</td><td>de masse Agilent technologies</td><td>ESI-L G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Analyse des données <td></td></tr><tr><td> ver. 4.3 software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Ancillary Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur de vide capable de fonctionner à 4&ndash ; 10&deg ; C</td><td>Labconco</td><td>7310022</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance analytique (XSE105DU)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01911005</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur (-20 &deg ; C)</td><td>Congélateur Fisher Scientific</td><td>97-926-1</td><td></td></tr><tr><td>(-80 &deg ; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>88300ASP</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur réfrigéré</td><td>Fisher Scientific</td><td>11475126</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Benchmark</td><td>BS-VM-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (xenopus laevis)

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

La quantification des petites molécules dans des cellules individuelles déclenche des nouvelles possibilités pour mieux comprendre les processus fondamentaux qui sous-tendent le développement embryonnaire. Pour activer unicellulaires enquêtes directement en embryons vivants, nouvelles approches analytiques sont nécessaires, notamment ceux qui sont sensibles, sélectif, quantitative, robuste et évolutive à la taille des cellules différentes. Nous présentons ici un protocole qui permet l’analyse in situ du métabolisme dans des cellules individuelles à développer librement des embryons de la sud africaine Xenopus laevis (Xenopus laevis), un puissant modèle cellulaire et biologie du développement. Cette approche utilise une microsonde capillaire pour aspirer une partie définie de simples cellules identifiées dans l’embryon, laissant les cellules voisines intactes pour analyse ultérieure. Le contenu de cellules recueillies est analysé par une microéchelle électrophorèse capillaire electrospray ionisation (CE-ESI) interface couplée à un spectromètre de masse à haute résolution en tandem. Cette approche est extensible à différentes tailles de cellule et compatible avec la structure complexe en trois dimensions de l’embryon en développement. Ainsi, nous démontrons que microsonde qu'unicellulaires CE-ESI-MS permet à l’élucidation de l’hétérogénéité métabolique cellulaire qui se déploie comme une cellule progénitrice donne lieu aux descendants au cours du développement de l’embryon. Outre cellulaire et biologie du développement, les protocoles d’analyse unicellulaires décrites ici sont prêtent d’autres tailles de cellules, types de cellules ou des modèles animaux.

Nous avons récemment utilisé microsonde unicellulaires CE-ESI-MS pour caractériser les métabolites dans des cellules individuelles identifiés à développer librement des embryons de Xenopus laevis 29,30. La microsonde permet rapide (~ 5 sec/cellule), in situ l’aspiration d’environ 10 nL d’une cellule individuelle, des aspirations multiples de la même cellule ou plusieurs cellules différentes au sein des mêmes ou u...

Les auteurs décrivent les étapes permettant d’échantillonnage rapide in situ d’une petite portion d’une cellule individuelle avec haute précision et une atteinte minimale à l’aide de base capillaire Microprélèvement, pour faciliter la caractérisation chimique d’une capture instantanée de l’activité métabolique dans embryons vivants à l’aide d’une cellule unique sur mesure électrophorèse capillaire et la plate-forme de la spectrométrie de masse.

Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

L’objectif général de ce protocole est de caractériser les métabolites dans les cellules vivantes d’embryons en développement par micro-échantillonnage in situ, électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire et du développement, car elle permet d’analyser le métabolisme dans des cellules uniques directement dans des embryons vivants en développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, qu’elle s’adapte à différentes tailles de cellules et qu’elle permet un échantillonnage peu invasif de cellules individuelles dans des embryons vivants.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes sont difficiles à apprendre car l’embryon se développe relativement rapidement et un instrument d’ionisation par électronébulisation par électrophorèse capillaire construit sur mesure est utilisé. Commencez cette procédure par la préparation de 2 % d’agarose dans une solution de Steinberg 1X. Pendant qu’il est encore liquide, enduire le fond des boîtes de Pétri de 60 millimètres avec la solution.Une fois que le gel d’agarose a refroidi et s’

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Xenopus embryonnaire épithéliums sont un système modèle idéal pour étudier les comportements cellulaires tels que le développement de polarité et changer de forme lors de la morphogenèse épithéliale. Histologie classique d'échantillons fixe est de plus en plus complétée par des cellules vivantes imagerie confocale. Ici nous démontrons méthodes pour isoler les tissus de grenouilles et de visualiser en direct les cellules épithéliales et de leur cytosquelette des cellules vivantes en utilisant la...

Imagerie des cellules vivantes et de l&#39;analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis</em

Ici, nous présentons des protocoles pour effectuer à la fois l’imagerie par spectrométrie de masse ambiante (MSI) des tissus et l’analyse MS à cellule unique vivante (SCMS) in situ à l’aide de la sonde unique, qui est un dispositif multifonctionnel miniaturisé pour l’analyse MS.

Applications de la mono-sonde: Mass Spectrometry Imaging et simple Cellule d&#39;analyse dans les conditions ambiantes

Une plate-forme intégrée de manipulation cellulaire est développée pour une utilisation en conjonction avec une configuration de spectrométrie de masse à sonde unique pour l'analyse en ligne des cellules de suspension individuelles dans des conditions ambiantes.

Plateforme intégrée de manipulation cellulaire couplée à la sonde unique pour l'analyse de spectrométrie de masse des médicaments et des métabolites dans les cellules de suspension unique

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Nous décrivons ici une caractérisation protéomique basée sur la spectrométrie de masse de lignées cellulaires avec des destins tissulaires connus chez l’embryon vertébré Xenopus laevis .

Protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement

Ce protocole vise à préserver les métabolites cellulaires pour la spectrométrie de masse sur cellule unique (SCMS) en combinant le lavage en solution de sel volatil, l’extinction rapide de l’azote liquide, la lyophilisation et le stockage à -8 °C. Il démontre que l’extinction de l’azote liquide est essentielle pour maintenir les profils de métabolites, tandis que le stockage prolongé au froid doit être minimisé pour prévenir les altérations métaboliques.

Préparation d’échantillons pour les études métabolomiques par spectrométrie de masse sur cellule unique : lavage, trempe, séchage et stockage combinés des cellules

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme.  Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non ciblée métabolomique fournit une hypothèse générer instantané d'un profil métabolique. Ce protocole démontrera l'extraction et l'analyse des métabolites provenant de cellules, le sérum ou les tissus. Une gamme de métabolites sont interrogés par extraction en phase liquide-liquide, microflow UltraPerformance chromatographie liquide / haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) couplé à un logiciel d'analyse différentielle.

Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

L’électrophorèse capillaire en solution libre est une méthode analytique rapide, peu coûteuse et robuste qui permet le suivi quantitatif des réactions chimiques en temps réel. Son utilité pour une analyse rapide, pratique et précise est démontrée ici par l’analyse de la greffe de peptides covalents sur des films de chitosane pour une meilleure adhérence cellulaire.

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In Situ Détection et Quantification de la cellule unique de nanoparticules d’oxyde métallique à l’aide de l’analyse par microsonde nucléaire

Découvrez la microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaire dans les embryons vivants de Xenopus laevis. Cette méthode rapide et peu invasive permet d'analyser le métabolisme cellulaire en développement.

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