Microsonde électrophorèse capillaire spectrométrie de masse pour la métabolomique unicellulaires dans les embryons de grenouilles vivent (Xenopus laevis)

L’objectif général de ce protocole est de caractériser les métabolites dans les cellules vivantes d’embryons en développement par micro-échantillonnage in situ, électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire et du développement, car elle permet d’analyser le métabolisme dans des cellules uniques directement dans des embryons vivants en développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rapide, qu’elle s’adapte à différentes tailles de cellules et qu’elle permet un échantillonnage peu invasif de cellules individuelles dans des embryons vivants.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes sont difficiles à apprendre car l’embryon se développe relativement rapidement et un instrument d’ionisation par électronébulisation par électrophorèse capillaire construit sur mesure est utilisé. Commencez cette procédure par la préparation de 2 % d’agarose dans une solution de Steinberg 1X. Pendant qu’il est encore liquide, enduire le fond des boîtes de Pétri de 60 millimètres avec la solution.

Une fois que le gel d’agarose a refroidi et s’est solidifié, faites chauffer l’extrémité d’une pipette Pasteur de six pouces jusqu’à ce qu’elle forme une boule. Ensuite, touchez légèrement l’extrémité chauffée pour imprimer cinq à 10 puits d’environ un millimètre de profondeur dans l’agarose. Pour fabriquer des micropipettes à pointe conique, tirez d’abord des capillaires en borosilicate dans un extracteur capillaire de type Flaming/Brown en utilisant les paramètres trouvés dans le protocole de texte.

Ensuite, cassez la pointe de la micropipette tirée à l’aide d’une paire de pinces fines et tranchantes pour obtenir un diamètre extérieur de pointe capillaire d’environ 20 microns. Effectuez cette étape sous un stéréomicroscope pour plus de précision et de reproductibilité. Obtenir des embryons par accouplement naturel induit par la gonadotrophine de xenopus laevis adultes ou par fécondation in vitro comme indiqué dans le protocole de texte.

Retirez les couches de gelée entourant les embryons lorsqu’ils commencent à se fendre dans le stade bicellulaire en laissant d’abord les embryons reposer dans la solution de déjellying pendant deux minutes. Ensuite, faites-les tourner doucement pendant deux minutes supplémentaires pour empêcher les embryons d’adhérer à la surface de la boîte de collecte. Versez délicatement le contenu du plat dans un bécher propre et décantez rapidement la solution de dégelée du bécher.

Couvrez immédiatement les œufs avec 0,1 fois de solution de Steinberg pour rincer le reste de la solution de dégelée. Agitez doucement puis décantez la solution. Répétez cette étape quatre fois pour bien laver les embryons.

Transférez les embryons dégelées dans une solution de Steinberg 1X dans une boîte de Pétri. Pour minimiser l’encombrement à l’intérieur des assiettes, placez environ 100 embryons par boîte de 100 millimètres. Triez les embryons clivés au stade bicellulaire dans une boîte séparée dans laquelle la pigmentation stéréotypée marque avec certitude l’accès ventral dorsal en référence pour établir des cartes de sulfate

Identifiez correctement les embryons clivés en veillant à ce que le premier sillon de clivage, qui marque le plan médio-sagittal, coupe en deux l’attraction animale pigmentée foncée et l’attraction animale légèrement pigmentée de sorte que les deux moitiés soient des images miroir. Ensuite, montez une micropipette fabriquée sur un micromanipulateur multi-axes. Connectez la micropipette à un micro-injecteur.

À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, aspirez environ cinq des huit embryons et transférez-les dans la boîte d’échantillonnage contenant 0,5 fois la solution de Steinberg. À l’aide d’une boucle de cheveux, positionnez l’embryon à prélever dans un puits individuel et assurez-vous que la cellule d’intérêt correctement identifiée fait face à la microsonde à un angle d’environ 90 degrés. Tout en travaillant au stéréomicroscope, guidez la pointe de la micropipette dans la cellule unique identifiée dans l’embryon vivant.

Prélevez une partie souhaitée du contenu de la cellule en appliquant des impulsions de pression négative sur le microcapillaire à l’aide du micro-injecteur. Rétractez doucement la microsonde de la cellule et transférez son extrémité dans quatre microlitres de solvant d’extraction de métabolites refroidis dans un flacon de taille micrométrique. Ensuite, appliquez une surpression de 80 psi pendant une seconde au capillaire à l’aide du micro-injecteur pour expulser l’aspiration dans le solvant.

Fermez hermétiquement le flacon pour éviter qu’il ne s’évapore et remettez-le sur de la glace jusqu’à ce que l’échantillonnage soit terminé. Une fois l’échantillonnage terminé, mélanger au vortex l’échantillon contenant les flacons de microcentrifugeuse pendant environ une minute pour accélérer l’extraction des métabolites. Ensuite, centrifugez les flacons à 8 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les débris cellulaires et autres particules.

Stockez les extraits cellulaires avec les débris cellulaires et précipitez à moins 20 degrés Celsius pendant une journée ou à moins 80 degrés Celsius pendant un mois jusqu’à ce que la mesure soit effectuée par CE-ESI-MS. Construire la plate-forme d’injection CE capable de translation verticale rapide d’un étage contenant le flacon d’électrolyte de fond et le microflacon de chargement d’échantillon, comme indiqué dans le protocole de texte. Assemblez l’interface CE-ESI en montant d’abord l’émetteur métallique par électronébulisation dans un raccord en T à trois ports.

Ensuite, faites passer le capillaire CE de séparation à travers l’émetteur par électronébulisation, ce qui lui permet de dépasser d’environ 40 à 100 microns au-delà de l’extrémité de l’émetteur. Travaillez sous un stéréomicroscope pour améliorer la précision. Connectez le capillaire de la solution en feuille à l’orifice restant pour fournir la solution d’électronébulisation.

Utilisez des manchons appropriés et des raccords serrés à la main pour un fonctionnement sans fuite de l’interface CE-ESI. À l’aide d’un support de plaque, montez l’interface CE-ESI sur une platine de translation à trois axes et positionnez la pointe de l’émetteur d’électronébulisation à environ deux millimètres de l’orifice du spectromètre de masse. Pour nettoyer les composants de l’interface, il faut d’abord introduire la solution de feuille d’électrospray par l’émetteur d’électrospray à raison d’un microlitre par minute et le BGE par la capillarité de séparation CE.

Utilisez des pousse-seringues pour alimenter les solvants à un rythme régulier. Ensuite, rincez le capillaire de séparation CE avant chaque mesure en connectant une seringue à l’extrémité d’entrée du capillaire. Utilisez efficacement de grandes seringues pour minimiser le remplissage et l’amorçage des conduites d’alimentation en solvant.

Après avoir rincé le capillaire de séparation pendant environ cinq minutes, transférez son entrée dans la solution BGE située dans le flacon en acier inoxydable. Positionnez la pointe de l’émetteur d’électronébulisation à environ deux millimètres de l’orifice du spectromètre de masse. Ajustez avec précision cette distance à l’aide d’une platine de translation pour générer de l’électropulvérisation dans le régime stable de jet conique tout en surveillant la pulvérisation à l’aide d’un stéréomicroscope.

Surveillez la stabilité du courant ionique total ou TIC pendant environ 30 à 45 minutes pour assurer un fonctionnement stable. Appliquez 21 kilovolts de plus ou moins deux kilovolts dans le flacon BGE en augmentant progressivement le potentiel sur environ 15 secondes, générant généralement environ 7,5 microampères de courant à travers le capillaire de séparation en utilisant 1 % d’acide formique comme BGE. Avant chaque mesure, assurez-vous de la stabilité du système en surveillant le profil TIC pendant environ cinq à 10 minutes, puis abaissez progressivement le potentiel de séparation à zéro volt.

Pipeter un microlitre de la solution étalon de refroidissement de l’acétyle dans le flacon d’injection et transférer le capillaire de séparation du flacon BGE dans le flacon d’injection. Soulevez l’étage d’injection CE de 15 centimètres en une seconde. Après 60 secondes, injectez hydrodynamiquement six nanolitres de l’échantillon dans le capillaire de séparation.

Par la suite, ramenez l’étage aux niveaux de départ et déplacez doucement l’extrémité de l’entrée capillaire dans le BGE. Immédiatement après, augmentez la tension CE pour démarrer la séparation électrophorétique et l’acquisition de l’état EMA. Une fois que la norme a été détectée, arrêtez l’acquisition de données et abaissez progressivement la tension de séparation à zéro volt.

Ensuite, récupérez l’émetteur à deux centimètres de l’orifice. Rincez le capillaire de séparation pendant cinq minutes avant d’analyser l’extrait cellulaire. Mesurez 10 nanolitres d’extrait de cellule unique en répétant ces étapes pendant 90 secondes pour injecter hydrodynamiquement l’échantillon.

Un électrophérogramme représentatif de l’extrait cellulaire est présenté ici, dans lequel la séparation d’une série de métabolites identifiés est affichée. 70 signaux différents ont été identifiés avec un degré de confiance élevé comme de petits métabolites polaires sur la base du temps de migration et des modèles de fragmentation MS/MS des signaux d’extraction cellulaire par rapport à ceux d’une bibliothèque spectrale de masse standard ou en tandem. L’identification des métabolites est effectuée en comparant la masse précise, le temps de migration et le comportement de fragmentation du signal inconnu de l’échantillon par rapport à l’étalon de métabolite ou aux données disponibles dans une base de données de métabolites.

Cette étape est démontrée pour l’histidine. Ici, les cellules dorsales individuelles qui ont été identifiées et échantillonnées à l’aide de la microsonde CE-ESI-MS sont présentées aux stades embryonnaires à huit cellules, 16 cellules et 32 cellules. L’analyse multivariée des métabolites identifiés dans les trois types de cellules différents a révélé des profils métaboliques différents et des tendances métaboliques complexes à travers les stades cellulaires.

L’analyse en composantes principales des métadonnées quantitatives a révélé des changements métaboliques lorsqu’une cellule progénitrice identifiée de l’embryon de huit cellules s’est divisée pour former un clone cellulaire dans l’embryon de 16 cellules et de 32 cellules. Des tendances représentatives sont observées pour certains métabolites. Les métabolites tels que l’acétylcholine ont diminué en abondance avec la division cellulaire, tandis que la trolamine et la sérine/arginine ont montré des tendances opposées dans ces types de cellules.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée très rapidement, généralement en moins de 10 secondes pour chaque cellule. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons commencé la cartographie de l’hétérogénéité cellulaire métabolique dans l’embryon précoce de xénope laevis. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’électrophorèse capillaire à microsonde-spectrométrie de masse pour analyser les métabolites dans des cellules embryonnaires uniques.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler rapidement car le métabolome est dynamique et les cellules se divisent rapidement dans l’embryon en développement. Examinez également les détails analytiques pour vous assurer que des données de haute fidélité qualitative sont recueillies sur le métabolisme cellulaire. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic d’échantillons vivants, car notre approche de spectrométrie de masse à microsondes fonctionne rapidement, est peu invasive et compatible avec de petits échantillons.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le suivi des sulfates peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’impact des métabolites sur la spécification des tissus. N’oubliez pas que travailler avec des alimentations haute tension peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’isolation électrique des interfaces électrifiées doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.