Mesure automatique de Capsule de Polysaccharide cryptococcique espèces et corps cellulaire

L’objectif global de cette technique est d’automatiser les mesures manuelles fastidieuses. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cryptocoques, telles que la relation entre la taille de la capsule ou du corps cellulaire, et les différents aspects de la virulence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’analyser d’énormes volumes d’échantillons sans fatigue.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la cryptococcose, car la taille de la capsule et du corps cellulaire sont des aspects importants de l’agent pathogène. Pour préparer une lame d’encre de Chine, commencez par pipeter 10 microlitres d’échantillon cryptococcique sur une lame. N’importe quelle souche yi circulaire avec du travail, mais pour cette expérience, H99 était la seule souche utilisée.

Pipetez deux microlitres d’encre de Chine sur l’échantillon et mélangez-le en poussant physiquement la pointe de la pipette dans l’échantillon et en la déplaçant dans un mouvement circulaire jusqu’à ce que l’encre de Chine apparaisse uniformément répartie. Placez une lamelle sur l’échantillon en maintenant le bord gauche de la lamelle contre la surface de la lame. Ensuite, abaissez doucement et uniformément le côté opposé de la lamelle sur l’échantillon.

Laissez la diapositive sécher à l’air libre pendant cinq minutes. Ensuite, appliquez une légère couche de vernis à ongles sur la bordure de la lamelle pour former un joint et préserver la tache d’encre de Chine. Pour imager les échantillons, placez une lame sous un microscope à fond clair avec la fixation de la caméra et la conversion pixel en micron connue.

Ajustez les filtres, les objectifs et les contrastes, et assurez-vous que le champ de vision est dense, mais pas surpeuplé, avec des cellules cryptococciques avec un contraste clair entre la capsule cellulaire et l’arrière-plan, et correctement focalisé avec le corps cellulaire visualisé comme une bande sombre. Après avoir pris des images, enregistrez-les dans un seul répertoire avec des titres clairs, car l’algorithme de mesure sera exécuté sur les images dans un seul répertoire et les données de sortie seront organisées en fonction des noms des fichiers image. Suite à la configuration de l’algorithme selon le protocole texte, lancez l’application en double-cliquant sur QCA.py.

Tout en suivant les étapes décrites dans le programme, entrez le type d’extension des fichiers image, précédé d’un point et séparé par des points-virgules. Cliquez ensuite sur le bouton Entrée. Choisissez le répertoire dans lequel se trouvent les fichiers image en cliquant sur le bouton Sélectionner un répertoire et sélectionnez le dossier qui contient les images.

Générez la liste des fichiers image dans le répertoire en cliquant sur le bouton Générer une liste d’images. Les images seront répertoriées dans la zone de texte à droite. Examinez et assurez-vous que la liste est exacte et complète.

Ensuite, sélectionnez une image aléatoire dans la liste à utiliser comme aperçu en cliquant sur le bouton Sélectionner une image aléatoire. Ensuite, entrez l’objectif du microscope et les paramètres de compartimentage. Si les paramètres par défaut ne correspondent pas au microscope utilisé, sélectionnez Conversion de pixels personnalisée et entrez la conversion de pixels en micromètres pour les fichiers d’image.

Une fois sélectionné, cliquez sur le bouton Calculer la conversion et assurez-vous que la conversion est correcte selon la zone de texte de droite. Pour saisir les paramètres de l’algorithme pour la détection de cercle, entrez les rayons minimum et maximum détectables pour la détection de la capsule externe, en tant qu’entrées de rayon min et max de la capsule. Ensuite, entrez les rayons minimum et maximum détectables pour la détection du corps de cellule en tant qu’entrées de rayon de corps de cellule min et max.

Maintenant, déplacez les curseurs de sensibilité de la capsule et du corps cellulaire pour ajuster le seuil de sensibilité de l’algorithme. Une sensibilité faible sera stricte et réduira la détection de cercles faux positifs, mais peut également détecter moins de cercles réels. À l’inverse, une sensibilité élevée augmentera le taux de détection, mais peut également entraîner des cercles de faux positifs.

Maximisez le nombre de corps et de capsules détectés et inspectez visuellement si les cercles semblent s’adapter correctement. Le nombre de corps détectés à l’intérieur des capsules sera affiché dans la zone de texte à droite. Sinon, manipulez les paramètres de l’algorithme jusqu’à ce que les résultats soient précis.

Exécutez l’algorithme de détection sur l’ensemble du répertoire de fichiers image en cliquant sur le bouton Commencer l’analyse. Chaque image sera analysée et le programme affichera Terminé dans la zone de texte à droite lorsque toutes les images auront été analysées. Cliquez ensuite sur le bouton Associer et nettoyer.

Cela permettra d’apparier les corps cellulaires détectés aux capsules détectées dans lesquelles ils résident, et de calculer le véritable rayon de la capsule en soustrayant le corps de la capsule. Dans le répertoire image, recherchez les données terminées dans CleanedOutput. fichier CSV.

Si une seule donnée a été sélectionnée, le fichier sera étiqueté CleanedBodies. csv ou CleanedCapsules.csv. Comme on le voit ici sur cette image microscopique d’une lame d’encre de Chine, les cellules sont séparées et en densité suffisamment faible pour ne pas submerger le champ de vision.

Une quantité suffisante de colorant a également été utilisée pour créer un contraste entre les cellules et l’arrière-plan. L’algorithme détermine un seuil unique à chaque image en prenant la valeur d’intensité moyenne et en ajoutant l’écart-type. Les intensités de pixels dont l’intensité est supérieure au seuil sont considérées comme blanches et celles dont l’intensité est inférieure sont considérées comme noires.

Le corps cellulaire doit être visualisé sous la forme d’un cercle noir robuste sur le fond blanc de la capsule. Le meilleur plan focal à utiliser est celui dans lequel le corps cellulaire apparaît comme une bande sombre et concentrée. Ce plan focal est acceptable en tant que norme, car il fait correctement la mise au point de la cellule.

Celui-ci a été confirmé en visualisant la paroi cellulaire avec UVITEX, une sorte de coloration qui est clairement une paroi cellulaire nette et concentrée avec un signal faible au centre. Lorsque le protocole est suivi avec précision et que des images optimales sont obtenues, l’algorithme est précis et fiable. Cependant, si le protocole n’est pas suivi correctement et que des images sous-optimales sont obtenues en raison d’une mauvaise coloration, d’une surcharge ou d’autres paramètres mentionnés précédemment, l’algorithme perd en précision et ne peut pas récapituler les mesures humaines.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes environ si elle est effectuée correctement. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de vous faire une idée de l’acquisition d’images optimales à l’avance, afin d’être prêt lors de l’acquisition d’échantillons réels. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche cryptococcique pour explorer la taille des capsules et des corps cellulaires dans tout système d’imagerie dans lequel les deux sont clairement visualisés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer les capsules cryptococciques et les corps cellulaires. N’oubliez pas que travailler avec des cryptocoques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la sécurité de base BSL2 doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.