Name: Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez la mesure de la perméabilité épithéliale en temps réel dans des organoïdes intestinaux humains par microinjection de FITC-dextran et imagerie en direct. Cette méthode permet de visualiser et quantifier les effets de toxines ou traitements pharmacologiques sur l'intégrité de la barrière épithéliale.

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Les auteurs tiens à remercier les Drs Stephanie Spohn et Abuaita de Bâle pour beaucoup des discussions fructueuses sur organoïde microinjection. JRS est pris en charge par le Consortium de cellules souches intestinales (U01DK103141), un projet de recherche financé par le National Institute of Diabetes et digestif et Kidney Diseases (NIDDK) et le National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). JRS et VBY sont pris en charge par le roman de NIAID, Alternative Model Systems Consortium maladies entériques (NAMSED) (U19AI116482). DRH est pris en charge la subvention des mécanismes de la pathogénie microbienne de formation de la National Institute of Allergy et maladies infectieuses (NIAID, T32AI007528) et le prix de la clinique et translationnelle Science à l’Institut de Michigan de cliniques et de santé Recherche (UL1TR000433).
Les fichiers de données complet et le code d’analyse de données utilisées dans ce manuscrit sont disponibles à https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

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Les auteurs ont pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts de divulguer.

Ce protocole établit une méthode polyvalente pour la microinjection de HIOs dérivés hPSC et dérivé de tissu intestinal organoïdes et la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale en temps réel. Nous avons aussi démontré notre approche à l’analyse et l’interprétation des données obtenues à l’aide de ces méthodes. Compte tenu de l’adoption croissante d’organoïdes intestinale systèmes modèles16,20,21,28 et l’intérêt de longue date dans la perméabilité de la barrière intestinale comme un physiologiquement pertinents fonctionnelle résultat3,4,5,6, nous prévoyons que d’autres personnes travaillant dans ce domaine sera en mesure d’appliquer et de tirer parti de ces méthodes.
Il y a plusieurs étapes qui sont indispensables pour l’application de cette technique. Accès à hPSC de haute qualité - ou tissu dérivée HIO tissu devrait être établi avant une vaste expérimentation avec microinjection. HIO macrostructure peut être hétérogène, avec des variations en taille et en forme, bien que l’identité de tissu et de la morphologie cellulaire est hautement reproductible lors de l’utilisation d’une méthodologie éprouvée pour générer HIOs24. HIOs sphériques consistant en une simple lumière semi transparente et mesure environ 1 mm de diamètre sont idéales pour la microinjection et mesure de la fluorescence luminale en temps réel. Dans certains cas, microinjection échoue, entraînant l’effondrement de la HIO ou fuite évidente de substance injectée. HIOs défaillants peuvent être retirés de la culture bien à la discrétion de l’utilisateur à l’aide d’une micropipette standard. Envisagez les lentilles de l’objectif disponibles sur une plate-forme d’imagerie lors de la sélection HIOs pour microinjection et l’imagerie. En général, 2-4 X objectif objectifs sont idéales pour capter le signal fluorescent HIO complet, même si un objectif 10 X peut être utilisé si les lentilles de faible puissance ne sont pas disponibles ou si les HIOs disponibles sont &#60; 1 mm de diamètre. Logiciel d’imagerie doit permettre la capture automatique d’images fluorescentes à des moments définis dans le temps.
Plusieurs modifications du présent protocole sont possibles afin de répondre aux besoins expérimentaux. Par exemple, les résultats des tests de la fonction barrière pourraient dépendre de la taille moléculaire des composés à l’usage43 et il peut être approprié tester la préparation de dextran de différents poids moléculaires. En outre, l’imagerie fond clair peut être effectuée en plus de l’imagerie de fluorescence comme indicateur de l’intégrité structurale globale du tissu25. Lorsque vous effectuez la microinjection de bactéries vivantes25,28,31,32,33,44, il peut être nécessaire d’ajouter de la pénicilline et streptomycine ou gentamicine pour les milieux de culture HIO avant ou après la microinjection. L’extérieur de la microcapillaire va être contaminée au cours du remplissage avec la suspension de la culture bactérienne et cela peut être transféré dans les médias HIO. Alternativement, microinjection peut être effectuée sur HIOs suspendus dans la matrice extracellulaire (p. ex., Matrigel) sans les médias, ajoutant les médias après que la microinjection est terminée. Cela peut limiter la contamination à la matrice extracellulaire et la face externe de la HIO. Lors de la planification des essais de croissance microbienne, il peut être nécessaire d’enlever des antibiotiques dans les médias après 1-2 h pour éviter de ralentir ou d’empêcher le développement d’organismes microinjectés.
Enfin, reconnaissant que pas tous les chercheurs auront accès à l’équipement de microscopie adapté à l’imagerie de in vitro , il est important de souligner que les procédures décrites dans le présent protocole de collecte de données de fluorescence peuvent être appliquées aux images prises à intervalles fixes microscopie épifluorescente standard sans capture d’image automatisé ou contrôles environnementaux. Exemples de cette approche se trouvent dans les rapports de Leslie et Huang et al. 25, qui ont examiné l’activité toxine Clostridium organoïdes intestinale dérivée de hPSC, et Koenig et Odile et al. 44, qui ont examiné la perméabilité de la barrière épithéliale dans semblables dérivés hPSC organoïdes intestinale micro avec direct e. coli. Le fonctionnement manuel de matériel d’imagerie peut entraîner une plus grande variation et la difficulté en normalisant le signal fluorescent. Exécution manuelle d’imagerie du FITC-dextran injection HIOs, il est essentiel de maintenir le grossissement fixe, intensité d’excitation fluorescente et temps d’exposition tout au long de l’expérience pour ne pas fausser les mesures d’intensité de fluorescence.

L’épithélium intestinal constitue une barrière sélective qui intervient dans le transport directionnel de nutriments, H2O, des ions et des déchets produits tout en minimisant les non-spécifique échange induite par la diffusion d’autres particules entre la lumière et la mésenchymateuse tissu ou sang d’alimentation1,2. La perméabilité non spécifique de la barrière épithéliale intestinale a longtemps été considéré comme un paramètre clé fonctionnel à la fois la santé et la maladie3,4,5,6, qui reflète le taux de diffusion de petites molécules à travers l’épithélium via l’espace paracellulaire. Mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale peut être effectuée en7 de modèles animaux et des patients humains8 par l’ingestion de lactulose, qui n’a aucun transporteur spécifique dans le tractus gastro-intestinal et la collecte ultérieure et la mesure des concentrations de lactulose dans le sang périphérique. Les marqueurs ingérés remplaçant de la fonction de barrière comme glucides fluorescent étiquetés sont également disponibles9,10. Cette approche a été adaptée pour les cultures de cellules épithéliales intestinales sur Transwell appuie11, une approche simplifiée qui permet un meilleur contrôle expérimental mais a aussi été critiquée comme un mauvais prédicteur de in vivo perméabilité en raison de l’absence de différenciation épithéliales sous-types et tissu structure12. Moyen de chambres représentent encore une autre approche et permettent la mesure de la fonction de barrière épithéliale muqueuse intestinale ensemble ex vivo13. Application de cette technique est souvent limitée par tissu disponibilité et condition13,14. Ainsi les nouvelles méthodes qui équilibre la reproductibilité et le débit avec pertinence physiologique sont nécessaires.
Développements récents en in vitro de l’organogenèse ont conduit à l’adoption de systèmes de modèles 3D de vitroplants dans une plateforme sophistiquée pour récapitulant la dynamique complexe de tissus15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. En particulier, humains ou les cellules souches (hPSC) dérivé organoïdes intestinale humaine (HIOs)19,24 ont émergé comme un système modèle reproductible et expérimentalement tractable pour l’étude des interactions hôte-microbienne et barrière épithéliale dynamique25,26,27,28. De même, humaine dérivée de tissu organoïdes (également connu sous le nom enteroids) peuvent être dérivés d’une procédure de biopsie simple et utilisable comme un système souple d’étudier la physiologie humaine et la maladie15,29,30. La microinjection d’organoïdes intestinale humaine permet la prestation de composés expérimentaux25 ou vivre des microbes25,31,32,33 à l’apicale épithéliales surface de la lumière organoïde. Leslie et Huang et al. 25 a récemment adapté cette technique pour mesurer la perméabilité de la barrière à HIOs micro avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) étiqueté dextran après une exposition à des toxines bactériennes.
Ce protocole se veut un guide pour la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale en HIOs dérivés hPSC et HIOs dérivé de tissu par microscopie fluorescente. Avec des modifications mineures, il peut également servir une amorce générale sur microinjection de HIOs avec composés expérimentaux. Les utilisateurs peuvent compléter ce protocole avec supplémentaires ou autres applications en aval après microinjection.

<table><tbody><tr><td>EGTA 0,5 M stérile (pH 8,0)</td><td>Bioworld</td><td>405200081</td><td></td></tr><tr><td>Solution matricielle cellulaire (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision RT système d’imagerie de cellules vivantes</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/</td></tr> <tr><td>Caméra</td><td>GE Life Sciences</td><td>29065728</td><td>Inclus avec</td>le</tr><tr><td>logiciel d’imagerie softWoRx</td><td></td> du système Deltavision <td>29065728</td><td>Inclus avec le système Deltavision</td></tr><tr><td>Armoire de biosécurité</td><td>Labconco</td><td>Cell Logic+</td><td>http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Composant des milieux ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>B27 supplement (50X)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Composant des milieux ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>L-glutamine (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Composant des milieux ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td>Composant du support ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narshge</td><td>UM-3C</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narshge</td><td>UM-1PF</td><td></td></tr><tr><td>Porte-pipette</td><td>Narshge</td><td>UP-1</td><td>Alternate to Xenoworks Porte-pipette</td></tr><tr><td>Support magnétique</td> Lunette de dissection <td>Narshge</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SX61</td><td>Lunette recommandée, bien que d’autres modèles soient probablement compatibles</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent Olympus IX71</td><td></td><td></td><td>Inclus avec le système Deltavision</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Photometrics</td><td>29065728</td><td>Inclus avec le système Deltavision</td></tr><tr><td>Recombinant C. difficile Toxine A/TcdA Protéine</td><td>R& D Systems</td><td>8619-GT-020</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td>Composant des milieux ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>R-spondin 1</td><td>R& D Systems</td><td>4645-RS</td><td>Composant du support ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>Composant du milieu ENR ; voir McCraken et al. 24</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>FITC-dextran (4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Lames de chambre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526PK</td><td></td></tr><tr><td>Filaments de verre</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micropipette</td><td>Xenoworks</td><td>BR-MH2</td><td>Appareil préféré</td></tr><tr><td>Kit de tubes analogiques</td><td>Xenoworks</td><td>BR-AT</td><td></td></tr><tr><td>1/16 po virole transparente</td><td>Xenoworks</td><td>V001104</td><td></td></tr><tr><td>1-1,2 mm Joint torique</td><td>Xenoworks</td><td>V300450</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Avances dans la culture 3D des tissus intestinaux obtenus par biopsie ou générés à partir des cellules souches pluripotentes par différenciation dirigée, ont abouti à des modèles sophistiqués en vitro de la muqueuse intestinale. S’appuyant sur ces systèmes modèles émergents nécessitera l’adaptation d’outils et de techniques mises au point pour les animaux et les systèmes de culture 2D. Nous décrivons ici une technique pour mesurer la perméabilité de la barrière épithéliale dans une organoïdes intestinale humaine en temps réel. Ceci est accompli par microinjection de dextran fluorescent marqué et d’imagerie sur un microscope inversé muni de filtres épifluorescence. Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière en organoïdes intestinale facilite la génération de données temporelles à haute résolution dans le tissu épithélial intestinal humain, bien que cette technique peut également être appliquée à fixe validant des approches d’imagerie. Ce protocole est facilement adaptable pour la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale après une exposition à des agents pharmacologiques, des produits bactériens ou des toxines ou des micro-organismes vivants. Avec des modifications mineures, ce protocole peut servir aussi comme une amorce générale sur la microinjection d’organoïdes intestinale et utilisateurs peuvent souhaiter compléter ce protocole avec supplémentaires ou autres applications en aval après microinjection.

HIOs étaient différenciés de cellules souches pluripotentes humaines et mis en culture en solution à matrice cellulaire comme précédemment décrit19,24. Après 4 semaines de culture, les HIOs avaient élargi suffisamment pour permettre une microinjection. HIOs étaient micro avec 4 kDa conjugué FITC dextran suspendu dans PBS ou PBS contenant la toxine de Clostridium difficile TcdA. C. difficile est un pathogène opportuniste gastro-intestinal qui présente épithéliale toxicité induite par la toxine HIOs25. Comme témoin positif, EGTA a été ajouté pour les milieux de culture HIO dans un sous-ensemble de HIOs injecté avec PBS et FITC-dextran. EGTA est un chélateur du calcium qui provoque rapide la polymérisation de l’actine cytosquelette42. Fluorescence FITC a été suivie en temps réel sur un microscope d’imagerie live dans une chambre à environnement contrôlé et images ont été capturées dans des intervalles de 10 minutes.
Analyse a posteriori des données d’imagerie a révélé des différences substantielles dans la rétention de la fluorescence FITC (Figure 5). HIOs injectés avec du PBS conservé la quasi-totalité du signal fluorescent à t = 0, bien qu’HIOs qui ont été injectés également avec TcdA des traités avec l’EGTA présentaient une diminution sensible de l’intensité de fluorescence par microinjection après 8 heures (Figure 5 a). données d’imagerie ont été quantifiées pour HIOs tous à tous moments générer un dataset haute résolution représentant la variation relative de l’intensité de fluorescence au fil du temps dans chacune des conditions expérimentales (Figure 5 b). Les différences de perméabilité épithéliale ont été évaluées en calculant la durée moyenne d’élimination (t1/2 ) du FITC pour chaque groupe de traitement (tableau 1) et en comparant les différences en t t1/2 entre les groupes à l’aide de l’élève t-test. HIOs témoins traités retenus la majorité des signaux fluorescent FITC pendant plus de 16 heures (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Traitement par EGTA considérablement réduit temps élimination FITC-dextran par rapport au témoin HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h ; P = 1,3 x 10-8). Conformément aux résultats déjà publiés25, microinjection de TcdA a considérablement augmenté perméabilité de la barrière épithéliale par rapport au traitement témoin (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h ; P = 5,4 x 10-4). Ainsi, aussi bien externes (EGTA) et microinjecté (TcdA) composés sont capables d’induire des changements significatifs dans la perméabilité de la barrière épithéliale à HIOs. Ces résultats suggèrent que les effets d’un large éventail d’agents pharmacologiques, métabolites, produits bactériens, cytokines, facteurs de croissance et d’autres composés sur la fonction barrière épithéliale peuvent être évaluées à l’aide de cette approche.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Traitement</td>
			<td>Demi-vie (h)</td>
			<td>SEM (h)</td>
			<td>Bas 95 % IC (h)</td>
			<td>Haut 95 % IC (h)</td>
			<td>n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrôle</td>
			<td>17.11</td>
			<td>0,3</td>
			<td>16 h 45</td>
			<td>17,78</td>
			<td>11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>2,58</td>
			<td>0,19</td>
			<td>1,78</td>
			<td>3.38</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TcdA</td>
			<td>7.56</td>
			<td>0,63</td>
			<td>5.93</td>
			<td>9.18</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : élimination de temps moyen (t1/2) pour FITC-dextran à HIOs traités par EGTA ou TcdA. Les unités sont microinjection après heures.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig1.jpg"> 
Figure 1 : agencement de base d’un microinjector et un micromanipulateur pour microinjection HIO. Cette image montre l’effectif complet de l’équipement utilisé pour l’exécution de microinjection de HIOs. Composantes clés sont étiquetés et informations de commande se trouvent dans la table des matières. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig2.jpg"> 
Figure 2 : micropipettes. Le cuivre chauffage bobine SC, bride supérieure c1, collier bas (c2), bras de l’extracteur (pa), activer/désactiver sélection de chaleur (ht) sont identifiés par les flèches. Le réglage correct pour 1 chaleur et PULL sont indiqués en rouge. L’encart montre un filament de verre correctement monté prêt pour le chauffage. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig3.jpg"> 
Figure 3 : images représentatives d’une HIO dérivé de tissu injecté avec FITC-dextran. (A) Image de montrant le positionnement de la microcapillaire verre juste avant l’insertion dans le HIO et microinjection. (B) image de fond clair d’une organoïdes intestinale humaine dérivée de tissu après microinjection de FITC-dextran. Notez que le signal de fluorescence est apparent même sans l’utilisation d’un ensemble de filtres spécifique. Cette coloration facilite la précision de microinjection. Grossissement de X 3 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig4.jpg"> 
Figure 4 : Live de flux de travail d’imagerie. (A) capture d’écran illustrant les étapes nécessaires pour définir les paramètres de microscope, trouver les HIOs sur la diapositive et enregistrer la position de l’étape pour chaque HIO être photographié. (B) les paramètres de l’imagerie pré pour capturer le canal FITC à intervalles réguliers à chacune des positions spécifiés dans exportation post-imagerie A. (C) des données au format DV fichiers sous forme d’images TIFF avec une image TIFF par HIO par point dans le temps.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56960/56960fig5.jpg"> 
Figure 5 : résultats représentatifs. (A) les cellules souches dérivées des organoïdes intestinales humaines (HIO) micro avec 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) photographié pendant 20 heures. HIOs étaient également micro avec PBS (contrôle) ou de la toxine de Clostridium difficile TcdA (12,8 ng/µL) ou traités avec 2 mM EGTA ajoute le support de culture externe. Grossissement de X 4. (B) parcelle de moyenne intensité normalisée de FITC au fil du temps à HIOs traités avec PBS (contrôle), TcdA ou EGTA. Barres d’erreur représentent S.E.M. et n = 11 HIOs (contrôle), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56960/56960fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la perméabilité de la barrière épithéliale dans les organoïdes intestinaux humains au fil du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la gastro-entérologie, telles que la façon dont des toxines spécifiques, des produits bactériens ou même des traitements pharmacologiques peuvent modifier la perméabilité de la barrière épithéliale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à la fois de visualiser et de mesurer quantitativement la perméabilité de la barrière épithéliale en temps réel et en utilisant du tissu épithélial intestinal humain.Avant de micro-injecter des organoïdes intestinaux humains, le micro-injecteur doit être installé, et le microcapillaire préparé, installé et testé comme décrit dans le protocole textuel. Pour remplir le microcapillaire avec le matériau d’injection, immergez l’extrémité du microcapillaire en verre dans la suspension d’injection FITC-dextran, en prenant soin de ne pas casser l’extrémité du microcapillaire contre le côté ou le fond du tube. Tirez sur la seringue d’huile minérale pour aspirer environ 10 microlitres de la suspension FITC-dextran dans le microcapillaire.Lorsque la suspension de micro-injection remplit 90 % de la longueur du microcapillaire en verre, arrêtez de remplir le microcapillaire. Appuyez légèrement sur la seringue avant de retirer le microcapillaire de la solution de micro-injection pour vous assurer que l’extrémité du microcapillaire ne contient pas de poches d’air. Retirez la plaque de culture d’organoïdes intestinaux humains de l’incubateur de culture cellulaire et transférez-la dans l’enceinte de sécurité biologique avec le micro-injecteur.Retirez le couvercle de la plaque de culture et centrez le premier puits sur la platine du microscope de sorte qu’il soit clairement visible à travers l’oculaire de la lunette au réglage de grossissement le plus bas. Tournez le bras du micromanipulateur de manière à ce que le microcapillaire soit dirigé vers le bas dans le puits de culture à un angle supérieur à 45 degrés par rapport à la platine du microscope. Positionnez l’extrémité du microcapillaire au-dessus du puits de la première culture, à environ un centimètre au-dessus de la surface du milieu.Vérifiez que l’extrémité du filament de verre et l’organoïde intestinal humain sont visibles à travers l’oculaire. La clé d’une micro-injection réussie est d’aligner soigneusement le microcapillaire avec l’organoïde avant de tenter la micro-injection. Et je recommande toujours aux nouveaux utilisateurs de s’entraîner avec des tissus de rechange avant de tenter une expérience critique.En tournant le bouton de commande de l’axe z dans le sens des aiguilles d’une montre, faites avancer lentement le microcapillaire. Percez l’organoïde intestinal humain avec l’extrémité microcapillaire. La surface externe de l’organoïde intestinal humain s’abaissera légèrement lorsque le microcapillaire commencera à appliquer une pression et reprendra sa forme lorsque l’extrémité pénètre dans la lumière.S’il est difficile de voir l’extrémité du microcapillaire dans la lumière, ajustez les paramètres d’éclairage ou de grossissement du microscope de dissection. Lorsque le microcapillaire est correctement positionné avec l’extrémité du microcapillaire près du centre de l’organoïde intestinal humain, retirez les mains des commandes du micromanipulateur. Appuyez légèrement sur la seringue remplie d’huile minérale pour pousser la solution de micro-injection hors du microcapillaire et dans la lumière organoïde intestinale humaine.L’organoïde intestinal humain peut se dilater légèrement pour s’adapter au volume de l’injection. Avec le microcapillaire positionné au-dessus du milieu pour éviter d’endommager accidentellement les organoïdes intestinaux humains lors des manœuvres, passez à la cible suivante de l’organoïde intestinal humain. Entre les traitements ou en cas de casse, changez le microcapillaire.Desserrez la pince à l’extrémité du bras du micromanipulateur et retirez le microcapillaire du porte-micro-pipette. Pour tester les composés délivrés dans l’épithélium apical, le composé doit être remis en suspension dans du PBS stérile contenant deux milligrammes par millilitre de FITC-dextran. Dans cette expérience représentative, réintroduisez la toxine TcdA de Clostridium difficile, ajoutez 12,8 nanogrammes par microlitre dans du PBS contenant du FITC-dextran avant la microinjection.Micro-injecter le composé dans la lumière organoïde intestinale humaine comme démontré dans la section précédente. Pour tester les composés administrés dans le compartiment latéral basal, après une micro-injection de FITC-dextran, remplacez le milieu de culture externe par un nouveau milieu contenant deux millimolaires EGTA comme témoin positif, un véhicule PBS seul comme témoin négatif ou un autre composé expérimental. Commencer l’imagerie en direct immédiatement après la micro-injection.Cette image représentative en champ clair montre un organoïde intestinal humain dérivé de tissus après micro-injection de FITC-dextran. Le signal fluorescent est apparent même sans l’utilisation d’un jeu de filtres spécifique. Des organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules souches ont été micro-injectés avec quatre kilodaltons de dextran conjugué FITC en suspension dans du PBS, ou du PBS contenant de la toxine Clostridium difficile TcdA.En tant que témoin positif, EGTA a été ajouté au milieu de culture d’organoïdes intestinaux humains dans un sous-ensemble d’organoïdes intestinaux humains injectés avec du PBS et du FITC-dextran. Les organoïdes intestinaux humains ont été imagés pendant 20 heures. Comme l’illustrent ces images, les organoïdes intestinaux humains injectés avec du PBS ont conservé la quasi-totalité du signal fluorescent présent à T zéro.Cependant, les organoïdes intestinaux humains qui ont également reçu une injection de TcdA, ou qui ont été traités avec EGTA, ont montré une diminution substantielle de l’intensité de la fluorescence huit heures après la microinjection. Les données d’imagerie ont été quantifiées pour tous les organoïdes intestinaux humains à tous les points temporels afin de générer un ensemble de données à haute résolution représentant la variation relative de l’intensité de la fluorescence au fil du temps dans chaque condition expérimentale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes à une heure selon le nombre de conditions expérimentales.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être patient et de prendre son temps lors de l’alignement des organoïdes intestinaux humains avec le microcapillaire avant la microinjection. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR, le western blot et la recherche d’ARN peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la réponse de l’organoïde intestinal humain au matériel injecté. Le développement de cette technique nous a permis d’examiner les effets des toxines bactériennes, des agents pharmacologiques, des cytokines et même des micro-organismes vivants sur la fonction de barrière épithéliale dans les organoïdes intestinaux humains.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de micro-injecter du dextran marqué par fluorescence et d’autres matériaux expérimentaux dans la lumière d’un organoïde intestinal humain. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des toxines bactériennes ou des organismes vivants, cela peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’utilisation d’EPI appropriés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Enfin, faites particulièrement attention à éviter les plaies par perforation car les microcapillaires sont extrêmement tranchants.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit l’utilisation de préparations de tissus intestinaux excisés ou « sacs intestinaux » comme modèle ex vivo de la fonction de la barrière intestinale. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale et de la couche de gel muqueux à des sites intestinaux spécifiques dans des modèles animaux de maladies digestives.

Ex Vivo intestinale Sacs pour évaluer la perméabilité de la muqueuse dans les modèles de maladies gastro-intestinales

Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

Ici, nous décrivons une technique pour quantifier l’intégrité barrière des petits organoïdes intestinaux. Le fait que la méthode est basée sur des organoïdes vivants permet l’étude séquentielle de différentes substances modulant l’intégrité de barrière ou des combinaisons de celui-ci d’une manière résolue dans le temps.

Enquêter sur la dégradation des barrières intestinales chez les organoïdes vivants

Profitant de la microscopie intravitale, la méthode présentée ici permet la visualisation en temps réel de l’excrétion cellulaire épithéliale intestinale chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale topiquement tachée (acriflavine et rhodamineB-dextran) des souris anesthésiées est image jusqu’à la résolution d’une seule cellule utilisant la microscopie confoccale.

Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.

Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Le présent protocole décrit une méthode qui utilise le jaune de lucifer dans un modèle entéroïde apical-out pour déterminer la perméabilité intestinale. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la perméabilité paracellulaire chez les entéroïdes qui modélisent les maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante.

Détermination de la perméabilité intestinale à l’aide du jaune de Lucifer dans un modèle entéroïde apical-out

Cette étude présente un protocole de génération de monocouches intestinales bovines 2D à partir d’organoïdes, offrant un meilleur accès pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Il comprend des méthodes d’évaluation de l’intégrité et de la fonctionnalité des membranes, faisant progresser des modèles in vitro qui imitent la physiologie gastro-intestinale des bovins. Cette approche promet d’importants avantages biomédicaux et agricoles, notamment des stratégies de traitement améliorées.

Progrès de la technologie des organoïdes bovins utilisant des interfaces monocouches de l’intestin grêle et du gros intestin

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Le protocole présenté dans cette étude décrit des procédés pour la surveillance en temps réel de la progression de la reprogrammation par l'intermédiaire de la mesure cinétique des marqueurs de cellules souches pluripotentes positives et négatives à l'aide de l'analyse de cytométrie en flux. Le protocole comprend également l'évaluation fondée sur l'imagerie-de la morphologie, et le marqueur ou l'expression rapporteur lors de la génération iPSC.

Kinetic Mesure et visualisation en temps réel de Reprogrammation somatique

Découvrez la mesure de la perméabilité épithéliale en temps réel dans des organoïdes intestinaux humains par microinjection de FITC-dextran et imagerie en direct. Cette méthode permet de visualiser et quantifier les effets de toxines ou traitements pharmacologiques sur l'intégrité de la barrière épithéliale.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

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