Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la perméabilité de la barrière épithéliale dans les organoïdes intestinaux humains au fil du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la gastro-entérologie, telles que la façon dont des toxines spécifiques, des produits bactériens ou même des traitements pharmacologiques peuvent modifier la perméabilité de la barrière épithéliale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à la fois de visualiser et de mesurer quantitativement la perméabilité de la barrière épithéliale en temps réel et en utilisant du tissu épithélial intestinal humain.

Avant de micro-injecter des organoïdes intestinaux humains, le micro-injecteur doit être installé, et le microcapillaire préparé, installé et testé comme décrit dans le protocole textuel. Pour remplir le microcapillaire avec le matériau d’injection, immergez l’extrémité du microcapillaire en verre dans la suspension d’injection FITC-dextran, en prenant soin de ne pas casser l’extrémité du microcapillaire contre le côté ou le fond du tube. Tirez sur la seringue d’huile minérale pour aspirer environ 10 microlitres de la suspension FITC-dextran dans le microcapillaire.

Lorsque la suspension de micro-injection remplit 90 % de la longueur du microcapillaire en verre, arrêtez de remplir le microcapillaire. Appuyez légèrement sur la seringue avant de retirer le microcapillaire de la solution de micro-injection pour vous assurer que l’extrémité du microcapillaire ne contient pas de poches d’air. Retirez la plaque de culture d’organoïdes intestinaux humains de l’incubateur de culture cellulaire et transférez-la dans l’enceinte de sécurité biologique avec le micro-injecteur.

Retirez le couvercle de la plaque de culture et centrez le premier puits sur la platine du microscope de sorte qu’il soit clairement visible à travers l’oculaire de la lunette au réglage de grossissement le plus bas. Tournez le bras du micromanipulateur de manière à ce que le microcapillaire soit dirigé vers le bas dans le puits de culture à un angle supérieur à 45 degrés par rapport à la platine du microscope. Positionnez l’extrémité du microcapillaire au-dessus du puits de la première culture, à environ un centimètre au-dessus de la surface du milieu.

Vérifiez que l’extrémité du filament de verre et l’organoïde intestinal humain sont visibles à travers l’oculaire. La clé d’une micro-injection réussie est d’aligner soigneusement le microcapillaire avec l’organoïde avant de tenter la micro-injection. Et je recommande toujours aux nouveaux utilisateurs de s’entraîner avec des tissus de rechange avant de tenter une expérience critique.

En tournant le bouton de commande de l’axe z dans le sens des aiguilles d’une montre, faites avancer lentement le microcapillaire. Percez l’organoïde intestinal humain avec l’extrémité microcapillaire. La surface externe de l’organoïde intestinal humain s’abaissera légèrement lorsque le microcapillaire commencera à appliquer une pression et reprendra sa forme lorsque l’extrémité pénètre dans la lumière.

S’il est difficile de voir l’extrémité du microcapillaire dans la lumière, ajustez les paramètres d’éclairage ou de grossissement du microscope de dissection. Lorsque le microcapillaire est correctement positionné avec l’extrémité du microcapillaire près du centre de l’organoïde intestinal humain, retirez les mains des commandes du micromanipulateur. Appuyez légèrement sur la seringue remplie d’huile minérale pour pousser la solution de micro-injection hors du microcapillaire et dans la lumière organoïde intestinale humaine.

L’organoïde intestinal humain peut se dilater légèrement pour s’adapter au volume de l’injection. Avec le microcapillaire positionné au-dessus du milieu pour éviter d’endommager accidentellement les organoïdes intestinaux humains lors des manœuvres, passez à la cible suivante de l’organoïde intestinal humain. Entre les traitements ou en cas de casse, changez le microcapillaire.

Desserrez la pince à l’extrémité du bras du micromanipulateur et retirez le microcapillaire du porte-micro-pipette. Pour tester les composés délivrés dans l’épithélium apical, le composé doit être remis en suspension dans du PBS stérile contenant deux milligrammes par millilitre de FITC-dextran. Dans cette expérience représentative, réintroduisez la toxine TcdA de Clostridium difficile, ajoutez 12,8 nanogrammes par microlitre dans du PBS contenant du FITC-dextran avant la microinjection.

Micro-injecter le composé dans la lumière organoïde intestinale humaine comme démontré dans la section précédente. Pour tester les composés administrés dans le compartiment latéral basal, après une micro-injection de FITC-dextran, remplacez le milieu de culture externe par un nouveau milieu contenant deux millimolaires EGTA comme témoin positif, un véhicule PBS seul comme témoin négatif ou un autre composé expérimental. Commencer l’imagerie en direct immédiatement après la micro-injection.

Cette image représentative en champ clair montre un organoïde intestinal humain dérivé de tissus après micro-injection de FITC-dextran. Le signal fluorescent est apparent même sans l’utilisation d’un jeu de filtres spécifique. Des organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules souches ont été micro-injectés avec quatre kilodaltons de dextran conjugué FITC en suspension dans du PBS, ou du PBS contenant de la toxine Clostridium difficile TcdA.

En tant que témoin positif, EGTA a été ajouté au milieu de culture d’organoïdes intestinaux humains dans un sous-ensemble d’organoïdes intestinaux humains injectés avec du PBS et du FITC-dextran. Les organoïdes intestinaux humains ont été imagés pendant 20 heures. Comme l’illustrent ces images, les organoïdes intestinaux humains injectés avec du PBS ont conservé la quasi-totalité du signal fluorescent présent à T zéro.

Cependant, les organoïdes intestinaux humains qui ont également reçu une injection de TcdA, ou qui ont été traités avec EGTA, ont montré une diminution substantielle de l’intensité de la fluorescence huit heures après la microinjection. Les données d’imagerie ont été quantifiées pour tous les organoïdes intestinaux humains à tous les points temporels afin de générer un ensemble de données à haute résolution représentant la variation relative de l’intensité de la fluorescence au fil du temps dans chaque condition expérimentale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes à une heure selon le nombre de conditions expérimentales.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être patient et de prendre son temps lors de l’alignement des organoïdes intestinaux humains avec le microcapillaire avant la microinjection. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR, le western blot et la recherche d’ARN peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires concernant la réponse de l’organoïde intestinal humain au matériel injecté. Le développement de cette technique nous a permis d’examiner les effets des toxines bactériennes, des agents pharmacologiques, des cytokines et même des micro-organismes vivants sur la fonction de barrière épithéliale dans les organoïdes intestinaux humains.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de micro-injecter du dextran marqué par fluorescence et d’autres matériaux expérimentaux dans la lumière d’un organoïde intestinal humain. N’oubliez pas que lorsque vous travaillez avec des toxines bactériennes ou des organismes vivants, cela peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’utilisation d’EPI appropriés doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Enfin, faites particulièrement attention à éviter les plaies par perforation car les microcapillaires sont extrêmement tranchants.