Name: Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Apprenez la nanolithographie par sonde à balayage sur grande surface pour étudier les interactions cellules-surfaces nanostructurées. Cette méthode permet d'analyser les cellules souches mésenchymateuses et de guider la conception de biomatériaux avancés.

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Les auteurs reconnaissent l’aide financière de diverses sources, y compris l’UK Engineering and Physical Sciences Research Council (refs de subventions. EP/K011685/1, EP/K024485/1) et une bourse d’étude universitaire pour JH ; le Leverhulme Trust (RPG-2014-292) ; le Fonds de soutien stratégique institutionnel du Wellcome Trust (105610/Z/14/Z) ; le British Council (216196834) ; et l’Université de Manchester pour une Université de Manchester Research Institute (fonds d’amorçage pompe UMRI) et une bourse de doctorat présidentielle à l’assistance technique de SW. par Dr. Andreas Lieb (Nanosurf AG) est également grandement appréciées.

<ol><li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0034-4885/73/3/036501/meta">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501(2010).</li>
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<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
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<li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li>
<li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour%3A+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li>
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</ol>

L’algorithme d’alignement et les logiciels ont été développés par et sont la propriété de, l’Université de Manchester. Il est disponible en téléchargement sur http://www.click2go.umip.com/.

Ce protocole sert à fournir aux utilisateurs une méthode pratique pour réaliser rapidement nanolithographic le patterning avec grande uniformité et contrôlables taille plus grande des zones (cm2). Substrats portant ces nanopatterns de grande surface peuvent alors être précisées pour une variété d’applications. Une application majeure de cette technologie est de la génération des surfaces nanofabriquées pour les études sur les interactions de surface cellulaire. Ce rapport montre quelques exemples de culture cellulaire sur ces matériaux, démontrant le contrôle du CSAH morphologie par nanofabriquées substrats.
L’élément clé de ce protocole est l’automatisation de la procédure d’alignement (étape 4) qui permet une production très uniforme et à haut débit des caractéristiques sur les surfaces, jusqu'à résolution nanométrique, qui permet la rotation rapide des expériences de culture cellulaire. La lithographie de stylo de polymère réalisée à l’aide de cet algorithme d’alignement est capable de générer les caractéristiques d’échelle nanométrique dans environ 30 min. La reproductibilité et la précision de l’alignement automatique et donc l’uniformité des motifs caractéristiques, est cependant critique dépend de la qualité des tableaux sonde qui sont produites (phases 1 et 2). Les défauts dans leur préparation qui donnent lieu à des sondes émoussés, cassées ou manquantes ; tels que l’air emprisonné bulles (étape 1.5) ou une mauvaise séparation des sondes du maître (étape 1.8) peut entraîner l’alignement imprécis et lithographie de mauvaise qualité.
Cela rapporté méthode partage une limitation en commun avec d’autres méthodes d’alignement qui s’appuient sur le retour de force. La détermination précise de quand les sondes sont en contact avec la surface est limitée par la nécessité de tenir compte de vibrations de fond causées par l’environnement ambiant et le mouvement de la scène de l’échantillon. En général, les capteurs ont une sensibilité de force dans le régime µN (2 µN dans ce cas), mais l’algorithme d’alignement est conçu pour enregistrer seulement une force d’au moins 490 µN définitif de contact entre la sonde et la surface, afin d’éviter toute resul « faux positifs » Ting du bruit de fond. 13 par conséquent, cette méthode tend à produire des grandes fonctions (1 à 2 µm) puisque les sondes doit étendre une grande distance sur le z-axe (avec une force plue conséquente) afin d’enregistrer le contact. Pour compenser, petits éléments peuvent être générés en réduisant le z-axe distance parcourue pendant l’étape de la lithographie (p. ex., entrant dans le paramètre « Noir » à l’étape 5.2.3.2 comme 3 µm au lieu de 5 µm).
Néanmoins, même avec cette restriction, l’algorithme d’automatisation est capable d’aborder un aspect essentiel dans l’application des méthodes de la lithographie de sonde à balayage parallélisée, comme alignement c’était auparavant le plus exigeant et imprécis pas de temps dans la mise en œuvre de ces techniques. Cette automatisation maintenant décale l’étape cinétiquement limitante du processus de fabrication de l’alignement à l’écriture lithographique lui-même. Alors que ce protocole illustre l’application de cette procédure d’alignement à PPL, le cadre pourrait être appliqué à un certain nombre de techniques SPL comme lipides-DPN26 et Lithographie assistée par matrice27 ainsi que futur potentiel catalytique systèmes de sonde. 28

Progrès en nanotechnologie sont tributaire de l’évolution des techniques capables de fabriquer des dispositifs nanométriques sur surfaces efficace et fiable. 1 , 2 Toutefois, générant ces dispose de manière fiable sur de grandes surfaces (plusieurs cm2) et à un coût relativement faible est un effort non négligeable. La plupart des techniques existantes, dérivés de l’industrie des semi-conducteurs, dépendent de la photolithographie ablative pour fabriquer des matières « dures ». Plus récemment, des techniques lithographiques, dérivés de la microscopie de sonde (SPM) sont apparus comme une approche pratique et polyvalente pour le prototypage rapide des conceptions de l’échelle nanométrique. 3 techniques axées sur le SPM peuvent facilement et rapidement « écrire » n’importe quel modèle défini par l’utilisateur. Le plus connu d'entre eux est dip-pen nanolithographie (DPN), mis au point par Mirkin et al.,4 où une sonde de balayage est utilisée comme une « plume » de transférer un « ink » moléculaire à la surface, produisant des caractéristiques d’une manière analogue à l’écriture. Dans des conditions ambiantes, comme une sonde est analysée à travers une surface, les molécules « ink » sont transférés à la surface via un ménisque de l’eau qui se forme entre la sonde et la surface (Figure 1). DPN permet donc la déposition de nanolithographic d’un large éventail de matériaux, y compris ceux « en douceur » tels que les polymères et les biomolécules. 5 techniques connexes à l’aide de sondes conçues avec des chaînes pour livraison fluide, diversement appelé « nanopipettes » et « nano-stylos », ont également été signalés. 6 , 7 , 8
Le principal obstacle à une application plus large de la lithographie de SPM-dérivé est le débit, car elle exige un temps excessivement long aux zones de modèle à l’échelle du centimètre avec une seule sonde. Premiers efforts visant à résoudre ce problème, axé sur la parallélisation des DPN axée sur le cantilever, avec « one-dimensional » et « bidimensionnelle » tableaux de sonde (2D) signalés pour la lithographie de zones taille centimètre. 5 , 9 Toutefois, ces baies en porte-à-faux sont produites par des méthodes de fabrication de plusieurs étapes relativement complexes et sont relativement fragiles. L’invention de la lithographie de stylo de polymère (PPL) a abordé cette question en remplaçant les encorbellements SPM standards avec un tableau 2D de doux siloxane élastomère sondes collé sur une lame de verre. 10 cette configuration simple sonde diminue considérablement le coût et la complexité de la structuration des grandes surfaces, ouvrant la nanolithographie à un large éventail d’applications. Cette architecture en porte-à-faux-libre a également été élargie à la pointe en dur tendre-printemps de lithographie,11 , qui prévoit un hybride de soutien élastomère souple avec embouts silicone dur donnant une résolution améliorée par rapport aux modèles fabriqués à l’aide de doux conseils d’élastomère.
Un facteur crucial dans l’exécution de ces technologies de tableau 2D, c’est que le tableau de la sonde doit être exactement parallèle à la surface substrat afin que lorsque lithographie est utilisée, toutes les sondes en contact avec la surface simultanément. Même un petit décalage peut provoquer une grande différence dans la taille d’un côté du tableau à l’autre, puisque certaines sondes entrera en contact avec la surface plus tôt au cours de la descente du tableau, tandis que d’autres viendront en contact plus tard ou pas du tout. 12 alignement exact est particulièrement important avec le PPL en raison de la déformabilité des sondes élastomère souple, où les sondes de contact avec la surface plus tôt seront compressés, laissant une plus grande empreinte sur la surface.
Les premiers travaux sur PPL employé contrôle purement visuel pour guider le processus d’alignement, en utilisant une caméra montée au-dessus du tableau d’observer la déformation des sondes pyramidales, comme ils ont été mis en contact avec la surface. 10 l’alignement a été jugé en observant quel côté des sondes est entré en contact avec la surface de tout d’abord, puis en réglage de l’angle et en répétant la procédure de manière itérative jusqu'à ce que la différence de contact de chaque côté de la sonde a été Impossible de distinguer à le œil. Comme cette procédure d’alignement s’appuie sur une inspection visuelle subjective par l’opérateur, la reproductibilité est faible.
Par la suite, une approche plus objective a été développée, composé d’un capteur de force monté sous le substrat pour mesurer la force appliquée au contact de la sonde sur la surface. 12 alignement a été ainsi obtenu en ajustant les angles d’inclinaison afin de maximiser la force exercée, qui a indiqué que toutes les sondes étaient simultanément en contact. Cette méthode a montré que l’alignement à 0,004 ° de la surface parallèle était possible. Cette « force feedback nivellement » a maintenant été implémentée dans des systèmes entièrement automatisés dans deux rapports indépendants. 13 , 14 fois utiliser une triade de capteurs de force montés sous le substrat ou au-dessus du tableau et mesurer la quantité de force exercée lors du contact entre les baies de la sonde et la surface. Ces systèmes donnent de haute précision, rapports des désalignements de 0,001 ° sur une échelle de longueur de 1 cm, le14 ou le ≤ 0,0003 ° sur 1,4 cm.13 ces systèmes d’alignement automatisé prévoient aussi grandes économies en temps opérateur et temps global pris pour compléter le procédé de lithographie.
Une application majeure de fabrication surface haut débit a permis par cette technologie est la génération de substrats de culture cellulaire. Il est maintenant bien établi que phénotype cellulaire peut être manipulé en contrôlant l’interaction initiale entre les cellules et les caractéristiques de la surface, et que cela peut être amélioré à l’échelle nanométrique. 15 précisément, balayage méthodes lithographie de sonde ont démontré qu’une méthode facile pour produire une variété de surfaces nanofabriquées pour de telles expériences de culture cellulaire. 16 par exemple, les surfaces présentant des motifs nanométriques de monocouches auto-assemblées et matrice extracellulaire protéines basé sur un modèle par PPL et DPN ont été utilisés pour étudier le potentiel des matériaux nano-modifiée en matière induit la différenciation des cellules souches. 17
Ce protocole décrit l’utilisation d’une force atomique mis à jour le microscope (AFM) système qui permet de grande surface PPL. Nous détaillons la détection de la force à l’aide de plusieurs capteurs de force comme le moyen de déterminer la sonde-surface de contact, avec un algorithme qui automatise le processus itératif d’alignement. Fonctionnalisation subséquente de ces modèles avec la fibronectine de protéine de matrice extracellulaire et la culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSAH) sont décrits, comme une démonstration de surfaces fabriqués en PPL, appliqué pour la culture cellulaire.

<table><tbody><tr><td><fort>Équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexAFM monté sur un 5 axes motorisé (XYZ&Theta ; &phi ;) platine de traduction et goniomètre</td><td>NanoSurf</td><td>P40008</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de contrôle AFM</td><td>NanoSurf</td><td>C3000</td><td></td></tr><tr><td>Stylo de gravure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225568</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyant plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>PlasmaFlo</td><td>Plasma Harrick</td><td>PDC-FMG-2</td><td></td></tr><tr><td>Pompe de service d’oxygène sec</td><td>économique Plasma Harrick</td><td>PDC-OPE-2</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de tube</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur sous vide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Système de purification d’eau Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>ZRXQ015WW</td><td></td></tr><tr><td>Générateur d’humidité modulaire</td><td>proUmid</td><td>MHG32</td><td></td></tr><tr><td>Proline Plus Pipette 100-1000 &micro ; L</td><td>Sartorius</td><td>728070</td><td></td></tr><tr><td>Silicon masters</td><td>NIL Technology</td> Microscope à fluorescence instantané vertical <td>sur mesure</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Objectifs de microscope</td><td>Olympus</td><td>10x et 60x UPlan FLN &infin ;/-/FN 26.5</td><td></td></tr><tr><td>Microscope droit à champ clair</td><td>Leica</td><td>DM 2500M</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoniseur</td><td>Ultrawave Ltée</td><td>U95</td><td></td></tr><tr><td>Tableur pour l’enregistrement et l’interprétation automatisés des résultats d’alignement</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34863</td><td></td></tr><tr><td>FLAMMABLE Microscope Sildes, Transparent, Moulu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>451000</td><td></td></tr><tr><td>(7&ndash ; Copolymère de vinylméthylsiloxane)-diméthylsiloxane à 8 %, terminé par le triméthylsiloxy</td><td>Gelest</td><td>VDT-731</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5,7-tétraméthyl-1,3,5,7-tétravinylcyclotétrasiloxane</td><td>Gelest</td><td>SIT7900.0</td><td></td></tr><tr><td>Platine(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tétraméthyldisiloxane solution complexe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>479527</td><td>NOCIF, TOXIQUE(</td></tr><tr><td>25&ndash ; Copolymère 35 % méthylhydrosiloxane)-diméthylsiloxane, terminé par triméthylsiloxane</td><td>Gelest</td><td>HMS-301</td><td></td></tr><tr><td>Weigh Boat 100 mL</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>BALI828</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Appleton Woods</td><td>KS230</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ST10-031T</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif en carbone</td><td>Agar scientifique</td><td>AGG3939</td><td></td></tr><tr><td>Acide 16-mercaptohexadécanoïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448303-1G</td><td>NOCIF, TOXIQUE</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td>INFLAMMABLE</td></tr><tr><td>Lame de microscope recouverte</td><td>d’or Sigma-Aldrich</td><td>643203</td><td>Une fois ouvert, l’or restera réactif aux thiols pendant au moins 1 mois</td></tr><tr><td>Thiourée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>NOCIF, TOXIQUE</td></tr><tr><td>Nitrate de fer(III) nonahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529303</td><td>NOCIF, TOXIQUE</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84415</td><td>NOCIF, TOXIQUE(</td></tr><tr><td>11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylène glycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675105</td><td>NOCIF, TOXIQUE</td></tr><tr><td>Fibronectine du plasma humain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de cobalt (II) hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203106</td><td>NOCIF, TOXIQUE</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Saline Tamponné</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MSCGM Milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses</td><td>Lonza UK</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches mésenchymateuses humaines</td><td>Lonza UK</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1</td><td>Centrifugeuse Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Centrifuge Tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/0840/53</td><td>NOCIF, TOXIQUE</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>"Détergent » dans le manuscrit</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratoires</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-fibronectine de lapin</td><td>Abcam</td><td>ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10253041</td><td></td></tr><tr><td>tissu T75 fiole de culture</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790113</td><td></td></tr><tr><td>porte-à-faux</td><td>BudgetSensor</td><td>ContAl-G</td><td></td></tr></tbody></table>

grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son application à la fabrication de substrat pour les études de culture de cellules

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Microscopie à sonde a permis la création d’une variété de méthodes pour la fabrication de haut en bas (« additive ») constructive des caractéristiques de l’échelle nanométrique. Historiquement, un inconvénient majeur de lithographie de sonde à balayage a été l’intrinsèquement faible débit des systèmes de sonde unique. Cela a été abordé par l’utilisation de tableaux de plusieurs sondes pour permettre un débit accru nanolithographie. Afin de mettre en œuvre ce nanolithographie parallélisée, l’alignement précis des tableaux de sonde avec la surface du substrat est essentiel, afin que toutes les sondes de prendre contact avec la surface simultanément lorsque lithographique répétition commence. Ce protocole décrit l’utilisation de la lithographie de stylo de polymère pour produire des dispositifs nanométriques sur les zones taille centimètre, facilitées par l’utilisation d’un algorithme pour l’alignement rapide, précise et automatisée des baies de la sonde. Ici, nanolithographie de thiols sur substrats or illustre la génération de fonctions avec grande uniformité. Ces modèles sont ensuite fonctionnalisés avec la fibronectine pour utilisation dans le cadre des études de morphologie axés sur la surface cellulaire.

Pour vérifier si l’alignement automatisé avait réussi, les graphiques tracés à partir des données de l’alignement (dans la feuille de calcul de l’étape 4,8) ont été examinés. Lorsque le processus d’alignement avait réussi les deux parcelles, correspondant à l’angle par lequel la scène de l’échantillon a été inclinée le long des axes θ et φ, montrent une série en hausse et décroissant de points de données. Dans chacune des parcelles, deux ajustements linéaires des points de données ont montré une intersect bien défini « peak » indiquant le maximum de z-extension et l’angle correspondant au cours de laquelle l’alignement a été obtenue (Figure 4 a et 4 b). Ce processus est répété quatre fois (c'est-à-diredeux fois pour chaque axe) et tracés comme un ensemble de quatre coordonnées. L’intersection de chaque paire de coordonnées montre ainsi les angles globale optimales (Figure 4). 13 dans le cas où l’alignement n’a pas réussi, on peut observer que leur correspondant θ et φ angle parcelles ne donnent pas d’ajustements linéaires de bonne qualité, ou ne se croisent pas (Figure 5). Ces alignements ayant échouées sont généralement à la suite les baies étant mal entretenue ou monté sur le support de sonde (étapes 1.7, 1.8 et 2.2). Dans ces cas, les tableaux ont été rejetées et un nouveau préparé et monté (étapes 1 et 2), et le processus d’alignement répété (étape 4).
Après alignement réussie et lithographie avec MHA par PPL, substrats or à motifs ont été ensuite imagés à l’aide de la microscopie de force latérale afin de déterminer si le dépôt a eu lieu. Un examen de surface plus grand des surfaces imprimées a été également réalisé par microscopie optique des substrats après l’attaque de l’or non protégé par le thiol déposé (Figure 6 et Figure 7). Cependant, les modèles gravées ne peuvent être utilisés pour plus de fonctionnalisation et ne doivent être utilisés que pour confirmer les patrons sur des échantillons représentatifs d’un lot de substrats de surface imprimées. Si les modèles gravées indiquent des zones blanches correspondant à un enclos individuel (Figure 8), ce résultat indique que la production de tableaux de la sonde n’a pas été faite avec succès, et que certaines sondes sont manquantes ou endommagées. Ce manque d’homogénéité des sondes peut être due à l’utilisation d’un vieux maître où le revêtement perfluorés a usé (étape 1.3), ce qui entraîne certaines sondes arrachés lorsque le tableau est séparé du maître. Dans ces cas, on utilisera un nouveau maître. Le résultat peut également être due à la présence d’air, bulles emprisonnées entre le verre support et le capitaine (étape 1.5), ou si le tableau de la sonde ne était pas proprement séparé du maître après durcissement (étape 1.8).
Images de microscopie fluorescente des surfaces fibronectine fonctionnalisée couvés CSM ont également été recueillis (Figure 9). En général, tous les substrats sont demeurés stables dans l’environnement de culture in vitro et les cellules ont adhéré et adapté à leur morphologie pour les patrons imprimés en cas de petit isolé 20 x 20 gamme de fonctionnalités.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> Figure 1. Représentation schématique de la lithographie de stylo de polymère montrant encre moléculaire transport via un ménisque de l’eau sur l’embout de sonde. (A) vue latérale et (B) vue du tableau stylo polymère indiquent que lorsque le tableau de la sonde et la surface substrat sont parfaitement alignés, toutes les sondes entrent en contact avec la surface simultanément, résultant en lithographie parallélisée. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> Figure 2. Diagramme schématique de la lithographie de stylo de polymère mis en place (A) vue latérale élargi d’expérimental mis en place où le tableau préparé sonde est attaché pour sonder le titulaire et monté au scanner de l’AFM. Le substrat est placé sur la scène, au-dessous de laquelle se trouvent les trois capteurs de force. (B) une représentation de l’instrumentation Assemblée, montrant la tête de balayage AFM par rapport à la scène de l’échantillon. Vue du dessous (C) montrant l’emplacement de capteur de force. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> Figure 3. Représentation schématique illustrant le programme de la spectroscopie pour la procédure d’alignement. Le scanner de l’AFM est défini pour déplacer les sondes vers l’échantillon par une distance de 10 µm à 100 ms, qui s’est tenue en position pendant 250 ms, suivie d’une rétraction de 10 µm à 100 ms et puis qui s’est tenue pendant 250 ms en position rétractée. La requête est ensuite répétée tout au long du processus d’alignement. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> Figure 4. Graphiques illustrant un alignement réussi. Graphiques de position z contre les angles d’inclinaison (A) θ et φ (B) pour une harmonisation réussie, où ● indique les valeurs réelles mesurées et + le meilleur ajustement avec la méthode des moindres carrés. (C) graphe de φ contre θ monté angles avec les quatre points où la z-position maximum a été atteint. Le point d’intersection marqué est l’angle d’inclinaison optimal final sur les deux axes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> Figure 5. Graphiques illustrant un alignement infructueux. Graphiques de position z contre les angles d’inclinaison (A) θ et φ (B) pour un alignement infructueux, où ● indique les valeurs réelles mesurées et + le meilleur ajustement avec la méthode des moindres carrés. (C) graphe de φ contre θ monté angles avec les quatre points où la z-position maximum a été atteint. Pas clair optima ou point d’intersection sont observées et donc les angles d’alignement optimal ne sont pas résolus. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> Figure 6. Microscopie optique illustration et images de microscopie de force atomique d’or substrats qui ont modelé avec MHA par les baies de la PPL alignés et puis gravé à l’eau-forte. (A) et (B) sont des images de microscopie optique successivement agrandie des modèles gravées ; (C) est une image AFM de topographie d’une grille unique de modèles. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> Figure 7. Images illustratives microscopie optique de substrats or qui ont modelé avec MHA par les baies de la PPL alignés et puis gravé à l’eau-forte. (A) et (B) sont des images de microscopie optique successivement agrandie de motifs gravés et (C) est une image de grossissement inférieure qui montre grande surface profils homogènes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> Figure 8. Image de microscopie optique illustrative d’un substrat d’or qui était inégalement modelé avec MHA et ensuite gravé à l’eau-forte. Les modèles prévus (illustrées dans le médaillon) redoublaient grilles de 20 lignes de points disposés en 20 lignes, avec tous deux lignes produites en augmentant le z-extension de l’axe de 1 µm (allant de 5 à-5 µm). On voit que dans certaines régions aucune tendance n’est générés, en raison des sondes manquants dans ces lieux. Dans les zones où sont produites les deux lignes de points, ce résultat indique qu’une sonde est présente mais il n’est pas de la même hauteur que les sondes entièrement fonctionnels, donc le seul dépôt dispose lorsque le tableau est étendu à la pleine z-distance axiale. Dans cette image, le contraste a été délibérément modifié pour permettre l’observation des zones partiellement imprimées. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> Figure 9. Images de microscopie de fluorescence incidente du CSM cultivés sur les baies de la fibronectine basé sur un modèle par PPL. (A) et (B) sont fort grossissement images montrant des cellules individuelles. (C) montre un modèle de l’exemple du tableau la fibronectine sans adhérent cellulaire et (D) est une image de grand champ des cellules cultivées dans un arrangement de grille (une représentation schématique du motif imprimé transparaît aussi dans l’inlay). Les cellules sont colorées pour montrer la fibronectine (rouge), actine F (vert) et (bleu) de noyaux cellulaires. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole pour étendus balayage sonde nanolithographie activé par l’alignement itératif de sonde tableaux, ainsi que l’utilisation de modèles lithographiques pour études sur les interactions de surface cellulaire.

Grande surface balayage sonde nanolithographie facilitée par alignement automatisé et son Application à la Fabrication de substrat pour les études de Culture de cellules

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Il existe un grand besoin d’outils pratiques pour générer des caractéristiques et des objets à l’échelle nanométrique, en particulier dans l’étude des interactions biologiques avec les matériaux et les surfaces nanostructurés. Ce protocole permet une réplication rapide et homogène de réseaux de protéines sur des zones à l’échelle centimétrique avec une résolution à l’échelle nanométrique. Cela nous permet d’étudier les interactions des cellules souches mésenchymateuses sur ces surfaces.Ces surfaces de modèle nous permettent d’examiner les interactions contrôlées entre des variables matérielles spécifiques et des cellules souches mésenchymateuses, fournissant des critères fondamentaux de conception de matériaux qui éclaireront les futures conceptions de biomatériaux. Pour commencer la procédure, mélangez soigneusement les composants du prépolymère PDMS dans un bateau de pesée. Dégazez le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que toutes les bulles de gaz aient disparu.Ensuite, placez le maître de silicium pour le réseau PPL dans une boîte de Pétri de quatre centimètres. Versez le mélange de prépolymère PDMS dégazé sur le master jusqu’à ce qu’il soit complètement recouvert. Dégazez le PDMS couvrant le maître pendant encore cinq minutes.Pendant le dégazage, traitez une lame de verre avec du plasma d’oxygène pendant une minute. Après le dégazage, placez soigneusement la lame sur le PDMS avec le côté traité vers le bas. Appuyez doucement la glissière sur le maître en silicone pour éliminer l’air emprisonné et pour vous assurer qu’une couche uniforme de PDMS est prise en sandwich entre le maître et la lame.Transférez le réseau PDMS pris en sandwich dans une autre boîte de Pétri avec le maître en silicium au fond. Faites durcir le PDMS dans un four à 70 à 80 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures. Ensuite, retirez la matrice PPL durcie du four et laissez-la refroidir pendant 15 minutes.À l’aide d’une lame de rasoir, coupez soigneusement l’excédent de PDMS à l’arrière et sur les côtés de la lame de verre. Soufflez les débris PDMS avec un jet d’azote gazeux sec. Il est important de couper l’excès de PDMS à l’arrière et sur les bords de la matrice pour permettre un alignement précis.Cela aide également l’utilisateur à mieux observer les conditions des sondes sous l’AFM pendant la lithographie. Calez une lame de rasoir dans le coin du réseau à une profondeur d’un millimètre et soulevez soigneusement le réseau du maître en silicium en un seul mouvement de levage continu. Ensuite, coupez et grattez soigneusement 0,5 millimètre du PDMS sur les bords du réseau avec une lame de rasoir.Les utilisateurs doivent être très prudents lorsqu’ils soulèvent les réseaux du maître pour assurer une bonne séparation et éviter d’endommager les sondes. Cela doit être fait en une seule action fluide sans que les matrices ne retombent sur le maître de silicium. Traitez le réseau PPL avec un plasmide d’oxygène pendant 30 secondes, puis déposez 20 microlitres d’eau désionisée sur la surface du réseau.Si l’eau ne se répartit pas uniformément sur l’ensemble du réseau, répétez le traitement au plasma. Séchez soigneusement le réseau traité au plasma, puis utilisez du ruban de carbone double face pour fixer le réseau au support de la sonde de microscopie à force atomique. Montez le support de sonde sur le support cinématique AFM.Pour encrer le réseau, appliquez une goutte de 20 microlitres d’une solution MHA d’un millimolaire dans de l’éthanol sur le réseau, en évitant tout contact entre la pointe de la pipette et la surface du réseau. Laissez la solution MHA se propager dans tout le réseau. Attendez que l’éthanol s’évapore.Montez le support de sonde avec le réseau PPL sur l’AFM, puis placez un substrat doré au centre de l’étage d’échantillonnage AFM. Fixez le substrat en place avec du ruban adhésif. Pour commencer l’alignement, exécutez le programme de configuration du contrôleur de scène pour réinitialiser tous les axes et angles à un point zéro pré-calibré.Utilisez le pupitre de commande de l’étage d’échantillonnage AFM sur les axes X et Y pour déplacer le substrat vers l’emplacement d’impression souhaité. Basculez le levier de déverrouillage de l’étage pour libérer l’étage d’échantillonnage et activer les capteurs de force. Laissez les capteurs s’équilibrer pendant au moins 15 minutes, puis utilisez le contrôleur de l’axe Z pour soulever l’étage d’échantillonnage jusqu’à ce que le réseau soit visuellement aussi proche que possible du substrat.Assurez-vous que le réseau se trouve à moins d’un millimètre du substrat. Ensuite, ouvrez le programme d’alignement automatique. Remplissez le pas d’angle, la distance de pas grossière et la distance de pas fin.Définissez le chemin d’accès au fichier de la feuille de calcul et joignez-y le modèle. Ouvrez ensuite le logiciel de contrôle AFM et accédez à la section spectroscopie. Configurez l’oscillation de l’axe Z de la tête de balayage pour étendre 10 micromètres sur 100 millisecondes, maintenir pendant 250 millisecondes, rétracter 10 micromètres sur 100 millisecondes et maintenir pendant 250 millisecondes.Démarrez l’oscillation de la tête de balayage et exécutez l’alignement automatique. Une fois que le logiciel indique que l’alignement est terminé, terminez le processus d’alignement. Inspectez l’ajustement linéaire généré automatiquement des données d’alignement pour déterminer si l’alignement a réussi et pour identifier les angles optimaux globaux, puis soulevez l’étage d’échantillonnage par incréments de 500 nanomètres jusqu’à ce que le contact entre le réseau et le substrat soit observé avec la caméra de vue de dessus AFM.Cliquez sur Stop dans le logiciel de contrôle AFM pour rétracter le réseau de 10 micromètres. Pour commencer le processus PPL, ouvrez la section lithographie du logiciel de contrôle AFM. Sélectionnez le mode de fonctionnement de modulation Z et accédez au motif de lithographie à importer.Renseignez la taille du motif à générer. Réglez le décalage d’origine sur 25 micromètres sur les axes X et Y, puis sélectionnez la position Modulation Z absolue, réglez l’instrument pour simplifier à deux couches et réglez les valeurs noir et blanc sur cinq et moins cinq micromètres, respectivement. Cliquez sur OK pour appliquer les paramètres et fermer la fenêtre.Ouvrez l’éditeur de calques à partir de la fenêtre de lithographie et définissez le temps de pause. Ensuite, abaissez la chambre d’isolation atmosphérique sur l’AFM et ouvrez son logiciel de contrôle. Réglez une humidité relative de 45 %, une température de 25 degrés Celsius et un débit d’échange d’atmosphère de 500 millilitres.Mettez en œuvre les paramètres et attendez que le niveau d’humidité souhaité soit atteint. Lancez ensuite la séquence lithographique. Une fois la lithographie terminée, rétractez la platine de 500 micromètres.Retirez la chambre d’isolation atmosphérique. Verrouillez l’étage d’échantillonnage pour désactiver les capteurs de force. Enfin, retirez le substrat de la scène pour la visualisation ou le traitement ultérieur.PPL a été utilisé pour produire des motifs homogènes à grande échelle de grilles fines ou d’images détaillées. Les motifs ont été visualisés pour la microscopie optique en gravant l’or non protégé par le thiol déposé. Un motif irrégulier indiquerait que les sondes sont endommagées ou manquantes.Des réseaux MHA imprimés sur de l’or avec PPL ont été fonctionnalisés avec de la fibronectine et incubés avec des cellules souches mésenchymateuses humaines. Les cellules individuelles ont adhéré aux réseaux fonctionnalisés par la fibronectine, adaptant leur morphologie aux motifs lorsque nécessaire. Cette technique PPL peut être utilisée pour déposer un large éventail de motifs protéiques pour des expériences de biologie cellulaire.Un utilisateur expérimenté peut générer des modèles comme ceux affichés en trois heures environ. N’oubliez pas qu’une préparation méticuleuse du réseau est la clé du succès. La technique PPL est assez générique et peut être utilisée pour le dépôt de composés allant des petites molécules aux polymères et aux biomolécules, ouvrant la voie à une variété d’études en chimie, en biologie et en science des matériaux.

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