Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

L’objectif global de cette méthode est d’identifier les propriétés phénotypiques et le potentiel de greffe des précurseurs clonaux de cellules souches hématopoïétiques ou CSH au cours du développement embryonnaire murin. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hématopoïèse développementale sur les contributions uniques de la lignée des précurseurs clonaux des CSH au cours du développement embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que les précurseurs hémogènes sont analysés au niveau de la cellule unique.

Cela permet d’identifier les propriétés phénotypiques uniques qui distinguent les précurseurs rares des CSH. Commencez par ajouter des tissus Aorta-Gonad-Mesonephros, AGM, disséqués à partir d’embryons entre 9,5 et 11,5 jours après le coït à un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de PBS complété par 10 % de FBS sur de la glace. Lorsque les tissus se sont déposés au fond du tube, aspirez le surnageant et ajoutez immédiatement un millilitre de collagénase à 0,25 % aux échantillons.

Après 25 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, arrêtez la réaction avec un millilitre de PBS plus FBS et utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour triturer les tissus 20 à 30 fois jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire. Ensuite, diluez les cellules avec huit millilitres supplémentaires de PBS plus FBS et collectez les cellules par centrifugation. Remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de tampon de blocage pendant cinq minutes sur de la glace.

Ajoutez ensuite 500 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt. Après une incubation de 15 à 20 minutes sur de la glace, lavez les cellules dans huit millilitres de PBS plus FBS et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS plus FBS frais. Filtrez les cellules à travers une crépine de 35 micromètres dans un tube de cinq millilitres, en lavant la crépine avec trois millilitres supplémentaires de PBS plus FBS pour collecter toutes les cellules et centrifuger à nouveau les cellules.

Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres de PBS plus FBS et placez les cellules sur de la glace. Pour régler les portes de tri en mode de tri par cellule unique et par indice, chargez une petite aliquote de cellules sur le cytomètre en flux et réglez l’acquisition sur le débit le plus bas. Ouvrez un tracé de zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale et définissez une porte pour inclure des cellules de taille variable.

Ouvrez un tracé de zone de diffusion vers l’avant en fonction de la largeur de la diffusion vers l’avant et un tracé de la zone de diffusion latérale en fonction de la largeur de la diffusion latérale et définissez une porte dans chaque graphique pour exclure les doublets. Définissez une zone de diffusion directe par rapport à un graphique DAPI pour bloquer les cellules vivantes. Ensuite, créez un tracé anti-endothélial endothélial Cadhérine par rapport au récepteur de la protéine C anti-endothéliale et contrôlez les cellules exprimant le récepteur de la protéine C endothéliale vasculaire positive et élevée.

Pour trier les cellules aorta-gonadiques-mésonéphros, placez une plaque de 96 puits précultivée avec des cellules endothéliales AGM dans un milieu sans sérum AGM et des cytokines dans le bloc de plaque du cytomètre en flux et chargez l’échantillon expérimental. Commencez l’acquisition de l’échantillon et vérifiez que le mode de cellule unique de tri d’index est sélectionné pour trier une seule cellule dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Lorsqu’une cellule a été triée dans chaque puits de la plaque, placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant sept jours maximum.

À la fin de la période de co-culture, des colonies hématopoïétiques de différentes tailles et morphologies peuvent être visualisées à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 100X. Pour analyser les clones par cytométrie en flux, utilisez une pipette multicanaux pour dissocier les cellules hématopoïétiques des couches endothéliales sans détacher les cellules endothéliales. Transférez ensuite 100 microlitres de cellules dans des puits individuels d’une nouvelle plaque à fond en V de 96 puits et retournez la plaque d’origine de 96 puits contenant les 100 microlitres de cellules restants dans l’incubateur de culture tissulaire.

Granulez les cellules de la plaque à fond en V par centrifugation et éliminez le surnageant en inversant et en effleurant la plaque en un seul mouvement rapide. Remettez les granulés en suspension dans chaque puits avec 50 microlitres de tampon de blocage à quatre degrés Celsius. Après cinq minutes, ajoutez le cocktail d’anticorps d’intérêt dans chaque puits pour une incubation de 20 minutes à quatre degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver chaque puits avec 200 microlitres de PBS plus FBS, en retournant la plaque à la fin de la centrifugation pour éliminer le surnageant. Remettez les granules en suspension dans 50 microlitres de PBS plus FBS et analysez les cellules selon les protocoles d’analyse de flux standard pour dépister les colonies contenant un potentiel de cellules souches hématopoïétiques. En sélectionnant les puits qui contiennent des cellules avec un phénotype de cellules souches hématopoïétiques par analyse de flux, utilisez une pipette multicanaux pour remettre en suspension les 100 microlitres de cellules restants de la co-culture d’origine et ajoutez cinq fois 10 à la quatrième cellule de moelle osseuse de sauvetage dans 100 microlitres de PBS plus 2 % FBS à chaque puits.

Après le transfert adoptif de chaque clone dans des animaux receveurs congéniques isolés irradiés létellement, prélevez des échantillons de sang périphérique sur les animaux greffés à intervalles réguliers après la transplantation. Pour identifier les clones avec une greffe à long terme, analysez les échantillons par cytométrie en flux selon les protocoles standard d’analyse de flux. Les propriétés phénotypiques de chaque clone peuvent alors être corrélées avec ses propriétés de greffe.

Les cellules souches pré-hématopoïétiques peuvent être enrichies par la positivité de la cadhérine endothéliale vasculaire et un niveau élevé d’expression du récepteur de la protéine C endothéliale. La coloration avec d’autres anticorps conjugués au fluorochrome permet l’analyse rétrospective de paramètres phénotypiques supplémentaires qui peuvent être enregistrés pour chaque cellule lors du tri indice. Après le tri de l’indice dans les co-cultures de cellules endothéliales aorta-gonades-mésonéphros, les clones individuels s’intègrent dans la couche de cellules endothéliales aorta-gonadiques-mésonéphros avant que les clones ne commencent à s’arrondir et à former des amas hématopoïétiques.

Après cinq à sept jours de co-culture, des colonies de tailles et de morphologies variées peuvent être détectées. Ici, quatre colonies différentes obtenues après co-culture sont montrées, trois colonies présentant des proportions différentes de cellules souches hématopoïétiques phénotypiques ainsi que d’autres types de cellules plus différenciées et la quatrième colonie dépourvue de cellules avec une expression de marqueur de cellules souches hématopoïétiques. Le transfert adoptif de la descendance de cellules clones permet d’évaluer la capacité de greffe multi-lignées à long terme de chaque clone suite à la contribution du donneur aux compartiments des cellules myéloïdes B et T du sang périphérique du receveur au fil du temps.

Bien que la plupart des colonies contenant des cellules avec un phénotype de cellules souches hématopoïétiques aient obtenu une greffe à long terme, une transplantation est nécessaire pour confirmer une greffe multi-lignées fonctionnelle, car certains clones perdent la greffe au fil du temps. Le potentiel fonctionnel des cellules souches hématopoïétiques de chaque clone peut ensuite être corrélé aux paramètres de tri d’indice d’origine de ce clone afin d’identifier ses caractéristiques phénotypiques précises. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la culture secondaire de la descendance hématopoïétique sur le stroma soutenant le développement des cellules B et T in vitro, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires sur les potentiels lymphocytaires des précurseurs hémogéniques individuels.