Name: Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Découvrez le séquençage ciblé de l'ARNr 16S dans le lait maternel à l'aide d'un protocole semi-automatisé. Cette méthode facilite l'étude du microbiome humain et ses implications pour la santé.

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Nous tenons à remercier Helty Adisetiyo, Ph.d et Shangxin Yang, Ph.d pour l’élaboration du protocole. Soutien global pour l’International maternelle pédiatrique Adolescent sida clinique essais Group (IMPAACT) a été fourni par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) sous les numéros de prix UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) et UM1AI106716 (IMPAACT LC), avec un cofinancement de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) et le National Institute of Mental Health (NIMH). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ciblée génération séquençage des ARNr 16 s est une technique largement utilisée, rapide pour microbiome caractérisation18. Cependant, de nombreux facteurs, y compris les effets du traitement par lots, contamination de l’environnement, cross-contamination des échantillons, sensibilité et reproductibilité peuvent nuire résultats expérimentaux et confondre leur interprétation7,19 , 20. pour mieux faciliter l...

Les communautés microbiennes qui colonisent les humains sont censées être d’une importance cruciale pour la santé humaine et les maladies qui influencent le métabolisme, développement immunitaire, susceptibilité à la maladie et les réponses à la vaccination et le médicament de thérapie1, 2. efforts pour comprendre l’influence de la microflore sur la santé humaine actuellement mettent l’accent sur l’identification des microbes associés définis compartiments anatomiques(p. ex., peau, intestin, oral, etc.), ainsi que des sites localisés au sein ces compartiments3,4. Ces efforts d’enquête repose sur l’émergence rapide et une plus grande accessibilité des technologies de séquençage de prochaine génération (NGS) qui fournissent une plate-forme massivement parallèle pour l’analyse du contenu génétique microbiens (microbiome) d’un échantillon. Pour beaucoup d’échantillons physiologiques, le microbiome associé est complexe et abondante (c.-à-d., selles), mais, pour certains échantillons, le microbiome est représenté par la biomasse microbienne faible (p. ex., le lait humain, des voies respiratoires inférieures) où sensibilité, objets d’art expérimentales et contamination possible devient grands enjeux. Les défis communs du microbiome études et conception expérimentale appropriée ont fait l’objet de multiples examen articles5,6,7,8.
Présentées ici un pipeline expérimental robuste de NGS repose sur le séquençage ciblé de l’ARNr 16 s V4 région9 pour caractériser le microbiome du lait maternel. Analyse de microbiome du lait maternel n’est pas compliqué que par une faible biomasse microbienne10, mais en plus de haut niveaux d’ADN humain fond11,12,13,14 et report éventuel du PCR inhibiteurs15,16 extrait acide nucléique. Ce protocole repose sur des plateformes semi-automatiques qui peuvent aider à réduire au minimum la variabilité entre les lots de préparation échantillon et de kits d’extraction disponible dans le commerce. Il intègre une communauté simulacre bactérienne bien définie comme un contrôle de la qualité pour valider chaque étape dans le protocole et fournir une métrique indépendante de la robustesse du pipeline de traitement aux côtés d’échantillons. Bien que le protocole comme décrit est spécifique pour les échantillons de lait maternel, il est facilement adaptable à d’autres types d’échantillon dont les selles, rectale, vaginale, peau, écouvillons aréolaires et orale10,17et peut servir de point de départ pour chercheurs qui souhaitent effectuer des analyses sur le microbiome.

<table><tbody><tr><td>AllPrep Mini Kit ARN/ADN</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Kit d’extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, décontaminant</td></tr><tr><td>ADN Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> Tampon <td>vortexer à température contrôlée</td></tr><tr><td>RLT plus</td><td>Tampon de lyse de thiocyanate de guanidinium Qiagen 1053393 / Partie du kit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Allprep&szlig ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig ;-ME est un agent réducteur qui dénaturera de manière irréversible les RNases en réduisant les liaisons disulfure</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>tube à billes</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>kit d’adaptateur disrupteur d’échantillon automatisé</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tube microcentrifuge du fabricant du tube</td><td></td><td></td> RB QIAgen en kit</tr><tr><td>QIAcube et articles en plastique associés</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>instrument automatisé de purification d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>Solution de décontamination non enzymatique</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampon d’élution</td></tr><tr><td>QIAgility et articles</td> <td>en plastique associésQiagen</td><td>9001532</td><td>robot manipulateur de liquides</td></tr><tr><td>PCR eau</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Amorces inversées à code-barres</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #'s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 et articles en plastique associés</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>analyseur automatisé de fragments d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>Réactifs D1000 pour Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Le tampon d’échantillon et l’échelle font partie de ce kit Kit d’élimination des</td></tr><tr><td>inhibiteurs de PCR OneStep</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>l’élimination des inhibiteurs de PCR se fait selon les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Kit de purification PCR QIAquick</td> Kit de nettoyage de l’ADN <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>: purification des produits PCR à base de membrane de silice</td></tr><tr><td>Kit de dosage HS Qubit dsDNA Thermo</td><td>Fisher</td><td>Q32854</td> Le <td>tampon de dilution à base de diméthylsulfoxyde et le colorant font partie de ce kit.</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Spectrophotomètre microvolume</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #</td><td>Séquenceur de nouvelle génération</td></tr></tbody></table>

une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Études des communautés microbiennes sont multipliées avec le développement du séquençage relativement peu coûteux, rapide et haut débit. Cependant, comme avec toutes ces technologies, des résultats reproductibles dépendent un flux de travail de laboratoire qui intègre les contrôles et les précautions d’usage. Ceci est particulièrement important avec des échantillons de faible biomasse où la contamination ADN bactérien peut générer des résultats trompeurs. Cet article décrit un flux de travail semi-automatique pour identifier les microbes des échantillons de lait maternel à l’aide de séquençage ciblé de la région de V4 de l’ARN ribosomique (ARNr) 16 s sur une échelle de faible à moyenne throughput. Le protocole décrit la préparation de l’échantillon de lait entier, y compris : lyse, extraction des acides nucléiques, l’amplification de la région de la V4 du gène ARNr 16 s et préparation de bibliothèque avec des mesures de contrôle de la qualité de l’échantillon. Ce qui est important, le protocole et la discussion tenir compte des questions qui sont importantes pour la préparation et l’analyse des échantillons de faible biomasse, y compris les contrôles positifs et négatifs appropriés, enlèvement d’inhibiteur de la PCR, contamination des échantillons par environnement, réactif, ou sources expérimentales et des pratiques exemplaires expérimentaux visant à garantir la reproductibilité. Le protocole tel que décrit est spécifique aux échantillons de lait maternel, mais il est adaptable à nombreux types d’échantillons de faible et haute-biomasse, y compris les échantillons sur écouvillons, congelés soignée, ou stabilisés dans un tampon de préservation.

Le protocole présenté ici comprend important contrôle qualité (CQ) des mesures pour s’assurer que la rencontre de données générées de repères pour le contrôle de sensibilité, spécificité et contamination protocole. Première étape QC du protocole suit amplification par PCR de la région de V4 16 s (Figure 2). 1 µL du produit PCR de chaque échantillon a été analysé par électrophorèse pour confirmer qu’il était dans la plage de la taille attendue de bp 315-450 (<...

Un workflow semi-automatisé est présenté pour le séquençage des ARNr 16 s de lait maternel et d’autres types d’échantillons de faible biomasse ciblé.

Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

L’objectif global de cette méthode est d’amplifier 16 ARNR à partir de lait maternel et d’autres échantillons à faible biomasse à l’aide d’un protocole semi-automatisé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement et les perturbations du microbiome humain en ce qui concerne à la fois la santé et la maladie. Le principal avantage de la technique est qu’elle est semi-automatisée, relativement facile à réaliser et adaptable à plusieurs types d’échantillons, notamment les sécrétions, les écouvillons et les selles.Après la décongélation et l’attribution du lait entier selon le protocole textuel, faites tourner les échantillons à 5000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les cellules. Utilisez une spatule en plastique ou une pointe de pipette de gros calibre pour retirer la couche supérieure de graisse. Ensuite, sans déranger le granulé, retirez tout le surnageant, à l’exception de 100 microlitres.Avec un millilitre de PBS, remettez en suspension et lavez la pastille. Préparez ensuite un contrôle négatif en ajoutant un millilitre de PBS stérile dans un tube de cinq millilitres. Transférez la suspension dans un tube à centrifuger propre de cinq millilitres et faites-le tourner à 5000 fois G à température ambiante pendant une minute.Ensuite, utilisez une pointe de pipette filtrée stérile de 1000 microlitres pour jeter toute la couche graisseuse surnageante. Pour perturber et homogénéiser l’échantillon, ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse contenant du bêta-mercaptoéthanol à la pastille et transférez la suspension dans un tube à billes. Préparez un témoin positif avec un tampon de lyse et 20 microlitres de l’échantillon bactérien fictif.Agitez vigoureusement tous les tubes de perles pendant 15 secondes. Ensuite, chauffez les échantillons sur un vortex à température contrôlée à 37 degrés Celsius et 700 à 800 tr/min pendant 10 minutes. Chargez les tubes dans le kit d’adaptateurs de perturbateur d’échantillons automatisé.Ensuite, battez les échantillons à 30 hertz pendant une minute. Démontez l’adaptateur et basculez-le manuellement avec les plaques d’échantillon du bras robotique gauche au bras robotique droit de l’instrument. Battez les tubes à 30 hertz pendant une minute supplémentaire, puis centrifugez les tubes à 17, 200 fois G et 25 degrés Celsius pendant trois minutes.À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez tout le surnageant en prenant soin de ne pas prélever la couche graisseuse en haut ou le résidu de bille au bas de l’échantillon. Appliquer le surnageant sur les colonnes d’homogénéisation. Ensuite, centrifugez les colonnes à vitesse maximale et à 25 degrés Celsius pendant trois minutes.Transférez 350 microlitres d’eluid dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres du fabricant. Pour isoler l’ADN selon le protocole de texte, coupez les couvercles et lissez les bords des colonnes de spin individuelles pour l’ADN et l’ARN. Insérez la colonne de spin DNA sans le tube collecteur dans l’adaptateur de rotor.Jetez ensuite le tube de prélèvement. Ensuite, insérez les tubes vortex de deux millilitres dans un agitateur, en suivant le tableau de charge de l’instrument de purification automatisé de l’ADN/ARN conformément aux instructions du fabricant. Étiquetez les tubes de prélèvement d’un point de cinq millilitres et insérez-les dans les adaptateurs de rotor.Ensuite, placez les adaptateurs de rotor dans la centrifugeuse en suivant le tableau de charge de l’instrument de purification automatisé de l’ADN/ARN. Après avoir inséré les pointes filtrantes, l’eau libre de RNase et les réactifs dans le bloc de réactifs de l’instrument, fermez le couvercle de l’instrument et exécutez le programme de purification d’ADN personnalisé sur l’instrument. Lorsque la réaction est terminée, prélevez l’échantillon contenant les tubes de l’agitateur et, s’il reste de l’échantillon, conservez-le à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.Après avoir préparé la zone de travail et le master mix PCR, selon le protocole de texte, chargez 50 à 100 microlitres d’échantillons d’ADN dans un adaptateur d’échantillon d’instrument à 32 puits, en suivant la carte de plaque à 96 puits. Pour chaque plaque de PCR, mettez en place deux contrôles négatifs en pipetant 30 microlitres d’eau PCR dans un tube de prélèvement propre de cinq millilitres. Placez ensuite tous les échantillons sur l’adaptateur d’échantillon d’instrument à 32 puits avec les capuchons verrouillés en position ouverte.Sur l’adaptateur de réactif de l’instrument, retirez le capuchon de chaque amorce inversée avec des numéros de code-barres spécifiques un par un. Pour charger le manipulateur de liquide robotisé, placez l’adaptateur de réactif en position B1.In afin d’éviter un effet de bord, placez soigneusement un bord de l’adaptateur contre le côté de la poignée et abaissez lentement l’autre bord. Assurez-vous d’appuyer sur tous les coins des adaptateurs.Placez l’adaptateur d’échantillon en position C1, en veillant à pousser sur tous les coins des adaptateurs. Ensuite, vortex le mélange principal de cinq millilitres. Ouvrez le capuchon et placez-le en position A sur le bloc de mixage principal et de réactifs de l’instrument.Placez la plaque PCR sur l’adaptateur de l’instrument à 96 puits qui est destiné à contenir des plaques PCR à demi-jupe. Démarrez ensuite l’exécution et enregistrez-la en tant que nouveau fichier. Une fois l’exécution terminée, vérifiez qu’il n’y a pas eu d’erreurs.Utilisez ensuite 12 ou huit capuchons pour sceller la plaque. Vortex vigoureusement et utilisez une toupie à plaques de 96 puits pour faire tourner les plaques pendant une minute. Enfin, placez la plaque sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit déplacée dans la salle de post-amplification et chargée sur le thermocycleur.Après l’amplification par PCR, effectuer le contrôle de qualité et la préparation de la bibliothèque selon le protocole texte. La première étape du protocole après l’amplification par PCR de la région 16SV4. Comme le montre ici, un microlitre de produit PCR de chaque échantillon a été analysé par électrophorèse pour confirmer qu’il se situait dans la plage de taille attendue de 350 à 450 paires de bases.Certains échantillons de lait maternel ont généré de plus faibles quantités de produit spécifique, ce qui suggère soit de faibles niveaux d’ADN microbien extrait dans ces échantillons, soit un transfert d’inhibiteurs de PCR pendant l’extraction. La quantification d’un produit spécifique pour chaque échantillon était essentielle pour déterminer le volume requis pour un regroupement molaire égal des échantillons pour le séquençage. Une banque groupée pour le séquençage ciblé est généralement dominée par un produit PCR spécifique.S’il y a une quantité importante de produit non spécifique dans la bibliothèque, une étape de purification du gel doit être ajoutée au flux de travail. Les résultats du séquençage montrent une grande diversité dans les taxons associés au microbiome du lait humain et une variabilité dans le nombre de numérations de roseaux de séquençage pour chaque échantillon. En revanche, la composition des taxons et le nombre de roseaux pour le simulacre bactérien étaient comparables aux résultats obtenus pour le simulacre lors d’exécutions précédentes, ce qui suggère que la variabilité observée pour les échantillons de lait maternel est un résultat expérimental authentique et non une fonction de la variabilité intrinsèque du flux de travail.Si vous laissez un séquenceur fonctionner pendant la nuit, cette technique peut être réalisée en deux jours, pour 12 à 24 échantillons, si tous les échantillons s’amplifient lors de la PCR initiale. Sinon, une autre journée de coquillage est nécessaire. Lors de cette procédure, il est important de se déplacer uniquement de la zone pré-PCR à la zone post-PCR pour éviter toute contamination.Il est également essentiel de changer fréquemment de gants pour éviter toute contamination croisée. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons humains peut être dangereux et que des précautions, telles qu’un équipement de protection approprié et des enceintes de sécurité biologique, doivent toujours être utilisées.

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