Name: Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Découvrez le séquençage ciblé de l'ARNr 16S dans le lait maternel à l'aide d'un protocole semi-automatisé. Cette méthode facilite l'étude du microbiome humain et ses implications pour la santé.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous tenons à remercier Helty Adisetiyo, Ph.d et Shangxin Yang, Ph.d pour l’élaboration du protocole. Soutien global pour l’International maternelle pédiatrique Adolescent sida clinique essais Group (IMPAACT) a été fourni par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) sous les numéros de prix UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) et UM1AI106716 (IMPAACT LC), avec un cofinancement de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) et le National Institute of Mental Health (NIMH). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

<ol><li>Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+human+gut+microbiota+for+effector+strains+that+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system.</a> Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+How+Microbial+Metabolites+Affect+Human+Health+and+Shape+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System.</a> Cell Metab. , (2017).</li>
<li>Hall, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-personal+diversity+and+temporal+dynamics+of+dental%2C+tongue%2C+and+salivary+microbiota+in+the+healthy+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2(2017).</li>
<li>Perez Perez, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+Site+Is+a+More+Determinant+Factor+than+Human+Population+Diversity+in+the+Healthy+Skin+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome.</a> PLoS One. 11 (4), e0151990(2016).</li>
<li>Hamady, M., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+profiling+for+human+microbiome+projects%3A+Tools%2C+techniques%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges.</a> Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).</li>
<li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+human+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A framework for human microbiome research.</a> Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+and+dodging+pitfalls+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research.</a> Microbiome. 5 (1), 52(2017).</li>
<li>Hugerth, L. W., Andersson, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+Microbial+Community+Composition+through+Amplicon+Sequencing%3A+From+Sampling+to+Hypothesis+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing.</a> Front Microbiol. 8, 1561(2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Pannaraj, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Breast+Milk+Bacterial+Communities+and+Establishment+and+Development+of+the+Infant+Gut+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome.</a> JAMA Pediatr. , (2017).</li>
<li>Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+and+breast+milk+cells.+A+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatr+Scand%22%5BJournal%5D)">Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study.</a> Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).</li>
<li>Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+T-lymphocyte+population+of+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk.</a> J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).</li>
<li>Sabbaj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk.</a> J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).</li>
<li>Jimenez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Milk+of+Healthy+and+Mastitis-Suffering+Women%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hum+Lact%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women.</a> J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).</li>
<li>Ghosh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).</li>
<li>Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+DNA%2FRNA+Co-extraction+Workflow+Protocol+Suitable+for+Inhibitor-Rich+Environmental+Samples+That+Focuses+on+Complete+DNA+Removal+for+Transcriptomic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses.</a> Front Microbiol. 7, 1588(2016).</li>
<li>Bender, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+HIV+infection+influences+the+microbiome+of+HIV-uninfected+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants.</a> Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100(2016).</li>
<li>Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+the+human+microbiome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing the human microbiome in health and disease.</a> Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).</li>
<li>Lauder, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+placenta+samples+with+contamination+controls+does+not+provide+evidence+for+a+distinct+placenta+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota.</a> Microbiome. 4 (1), 29(2016).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Walker, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+gene-based+profiling+of+the+human+infant+gut+microbiota+is+strongly+influenced+by+sample+processing+and+PCR+primer+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice.</a> Microbiome. 3, 26(2015).</li>
<li>Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+bacterial+DNA+contamination+of+extraction+and+sequencing+reagents+may+affect+interpretation+of+microbiota+in+low+bacterial+biomass+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples.</a> Gut Pathog. 8, 24(2016).</li>
<li>Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+bias+of+illumina-based+bacterial+16S+rRNA+gene+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).</li>
<li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
<li>Aho, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+human+lower+airways%3A+a+next+generation+sequencing+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organ+J%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective.</a> World Allergy Organ J. 8 (1), 23(2015).</li>
<li>Charlson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+continuity+of+bacterial+populations+in+the+healthy+human+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).</li>
<li>Bittinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+characterization+of+medically+relevant+fungi+in+the+human+respiratory+tract+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing.</a> Genome Biol. 15 (10), 487(2014).</li>
<li>Jervis-Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+accurate+microbiota+profiles+from+human+samples+with+low+bacterial+content+through+post-sequencing+processing+of+Illumina+MiSeq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data.</a> Microbiome. 3, 19(2015).</li>
<li>Knights, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+community-wide+culture-independent+microbial+source+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking.</a> Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).</li>
<li>Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+16S+rRNA+gene+amplicon+sequence+datasets+based+on+bacterial+load+assessment+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR.</a> BMC Microbiol. 16, 73(2016).</li>
<li>Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Genetics+and+Gut+Microbiome%3A+Challenges+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives.</a> Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).</li>
<li>ATCC. Mock microbial communities. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1">https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1</a> (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ciblée génération séquençage des ARNr 16 s est une technique largement utilisée, rapide pour microbiome caractérisation18. Cependant, de nombreux facteurs, y compris les effets du traitement par lots, contamination de l’environnement, cross-contamination des échantillons, sensibilité et reproductibilité peuvent nuire résultats expérimentaux et confondre leur interprétation7,19 , 20. pour mieux faciliter l...

Les communautés microbiennes qui colonisent les humains sont censées être d’une importance cruciale pour la santé humaine et les maladies qui influencent le métabolisme, développement immunitaire, susceptibilité à la maladie et les réponses à la vaccination et le médicament de thérapie1, 2. efforts pour comprendre l’influence de la microflore sur la santé humaine actuellement mettent l’accent sur l’identification des microbes associés définis compartiments anatomiques(p. ex., peau, intestin, oral, etc.), ainsi que des sites localisés au sein ces compartiments3,4. Ces efforts d’enquête repose sur l’émergence rapide et une plus grande accessibilité des technologies de séquençage de prochaine génération (NGS) qui fournissent une plate-forme massivement parallèle pour l’analyse du contenu génétique microbiens (microbiome) d’un échantillon. Pour beaucoup d’échantillons physiologiques, le microbiome associé est complexe et abondante (c.-à-d., selles), mais, pour certains échantillons, le microbiome est représenté par la biomasse microbienne faible (p. ex., le lait humain, des voies respiratoires inférieures) où sensibilité, objets d’art expérimentales et contamination possible devient grands enjeux. Les défis communs du microbiome études et conception expérimentale appropriée ont fait l’objet de multiples examen articles5,6,7,8.
Présentées ici un pipeline expérimental robuste de NGS repose sur le séquençage ciblé de l’ARNr 16 s V4 région9 pour caractériser le microbiome du lait maternel. Analyse de microbiome du lait maternel n’est pas compliqué que par une faible biomasse microbienne10, mais en plus de haut niveaux d’ADN humain fond11,12,13,14 et report éventuel du PCR inhibiteurs15,16 extrait acide nucléique. Ce protocole repose sur des plateformes semi-automatiques qui peuvent aider à réduire au minimum la variabilité entre les lots de préparation échantillon et de kits d’extraction disponible dans le commerce. Il intègre une communauté simulacre bactérienne bien définie comme un contrôle de la qualité pour valider chaque étape dans le protocole et fournir une métrique indépendante de la robustesse du pipeline de traitement aux côtés d’échantillons. Bien que le protocole comme décrit est spécifique pour les échantillons de lait maternel, il est facilement adaptable à d’autres types d’échantillon dont les selles, rectale, vaginale, peau, écouvillons aréolaires et orale10,17et peut servir de point de départ pour chercheurs qui souhaitent effectuer des analyses sur le microbiome.

<table><tbody><tr><td>AllPrep Mini Kit ARN/ADN</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Kit d’extraction d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Fisher Scientific</td><td>435532</td><td>RNase, DNase, décontaminant</td></tr><tr><td>ADN Thermo Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> Tampon <td>vortexer à température contrôlée</td></tr><tr><td>RLT plus</td><td>Tampon de lyse de thiocyanate de guanidinium Qiagen 1053393 / Partie du kit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Allprep&szlig ;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td>&szlig ;-ME est un agent réducteur qui dénaturera de manière irréversible les RNases en réduisant les liaisons disulfure</td></tr><tr><td>LME Beads</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914050</td><td>tube à billes</td></tr><tr><td>QIAgen TissueLyzer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>kit d’adaptateur disrupteur d’échantillon automatisé</td></tr><tr><td>QIAshredder column</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tube microcentrifuge du fabricant du tube</td><td></td><td></td> RB QIAgen en kit</tr><tr><td>QIAcube et articles en plastique associés</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td>instrument automatisé de purification d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>DNA exitus plus</td><td>Applichem</td><td>A7089</td><td>Solution de décontamination non enzymatique</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampon d’élution</td></tr><tr><td>QIAgility et articles</td> <td>en plastique associésQiagen</td><td>9001532</td><td>robot manipulateur de liquides</td></tr><tr><td>PCR eau</td><td>MO BIO</td><td>17000-5PRIME</td><td></td></tr> <tr><td>HotMasterMix</td><td>Quantabio</td><td>2200400</td><td></td></tr><tr><td>Amorces inversées à code-barres</td><td>Eurofin</td><td>No Catalog #'s</td><td>designed and ordered</td></tr><tr><td>96 well PCR plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-9708</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200 et articles en plastique associés</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>analyseur automatisé de fragments d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>Réactifs D1000 pour Tapestation</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>Le tampon d’échantillon et l’échelle font partie de ce kit Kit d’élimination des</td></tr><tr><td>inhibiteurs de PCR OneStep</td><td>Zymo Research</td><td>50444470</td><td>l’élimination des inhibiteurs de PCR se fait selon les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Kit de purification PCR QIAquick</td> Kit de nettoyage de l’ADN <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>: purification des produits PCR à base de membrane de silice</td></tr><tr><td>Kit de dosage HS Qubit dsDNA Thermo</td><td>Fisher</td><td>Q32854</td> Le <td>tampon de dilution à base de diméthylsulfoxyde et le colorant font partie de ce kit.</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Spectrophotomètre microvolume</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 300 V2 kit</td><td>Illumina</td><td>15033624/15033626</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>No Catalog #</td><td>Séquenceur de nouvelle génération</td></tr></tbody></table>

une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

A Method for Targeted 16S Sequencing of Human Milk Samples

Études des communautés microbiennes sont multipliées avec le développement du séquençage relativement peu coûteux, rapide et haut débit. Cependant, comme avec toutes ces technologies, des résultats reproductibles dépendent un flux de travail de laboratoire qui intègre les contrôles et les précautions d’usage. Ceci est particulièrement important avec des échantillons de faible biomasse où la contamination ADN bactérien peut générer des résultats trompeurs. Cet article décrit un flux de travail semi-automatique pour identifier les microbes des échantillons de lait maternel à l’aide de séquençage ciblé de la région de V4 de l’ARN ribosomique (ARNr) 16 s sur une échelle de faible à moyenne throughput. Le protocole décrit la préparation de l’échantillon de lait entier, y compris : lyse, extraction des acides nucléiques, l’amplification de la région de la V4 du gène ARNr 16 s et préparation de bibliothèque avec des mesures de contrôle de la qualité de l’échantillon. Ce qui est important, le protocole et la discussion tenir compte des questions qui sont importantes pour la préparation et l’analyse des échantillons de faible biomasse, y compris les contrôles positifs et négatifs appropriés, enlèvement d’inhibiteur de la PCR, contamination des échantillons par environnement, réactif, ou sources expérimentales et des pratiques exemplaires expérimentaux visant à garantir la reproductibilité. Le protocole tel que décrit est spécifique aux échantillons de lait maternel, mais il est adaptable à nombreux types d’échantillons de faible et haute-biomasse, y compris les échantillons sur écouvillons, congelés soignée, ou stabilisés dans un tampon de préservation.

Le protocole présenté ici comprend important contrôle qualité (CQ) des mesures pour s’assurer que la rencontre de données générées de repères pour le contrôle de sensibilité, spécificité et contamination protocole. Première étape QC du protocole suit amplification par PCR de la région de V4 16 s (Figure 2). 1 µL du produit PCR de chaque échantillon a été analysé par électrophorèse pour confirmer qu’il était dans la plage de la taille attendue de bp 315-450 (<...

Un workflow semi-automatisé est présenté pour le séquençage des ARNr 16 s de lait maternel et d’autres types d’échantillons de faible biomasse ciblé.

Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

Studies of microbial communities have become widespread with the development of relatively inexpensive, rapid, and high throughput sequencing. However, as ...

L’objectif global de cette méthode est d’amplifier 16 ARNR à partir de lait maternel et d’autres échantillons à faible biomasse à l’aide d’un protocole semi-automatisé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement et les perturbations du microbiome humain en ce qui concerne à la fois la santé et la maladie. Le principal avantage de la technique est qu’elle est semi-automatisée, relativement facile à réaliser et adaptable à plusieurs types d’échantillons, notamment les sécrétions, les écouvillons et les selles.Après la décongélation et l’attribution du lait entier selon le protocole textuel, faites tourner les échantillons à 5000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les cellules. Utilisez une spatule en plastique ou une pointe de pipette de gros calibre pour retirer la couche supérieure de graisse. Ensuite, sans déranger le granulé, retirez tout le surnageant, à l’exception de 100 microlitres.Avec un millilitre de PBS, remettez en suspension et lavez la pastille. Préparez ensuite un contrôle négatif en ajoutant un millilitre de PBS stérile dans un tube de cinq millilitres. Transférez la suspension dans un tube à centrifug

a-method-for-targeted-16s-sequencing-of-human-milk-samples

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La caractérisation de la communauté microbienne est un objectif de longue date en microbiologie environnementale. Les méthodes de séquençage de nouvelle génération permettent désormais de caractériser les communautés microbiennes à une profondeur sans précédent avec un coût et une main-d’œuvre minimes. Nous détaillons ici notre approche pour séquencer les gènes de l’ARN ribosomique 16S bactérien à l’aide d’un séquenceur de paillasse.

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

Utilisation de la fibrose kystique voies aériennes, par exemple, l'article présente un flux de travail complète comprenant une combinaison d'approches metagénomiques metatranscriptomic et de caractériser la communauté microbienne et virale dans des échantillons d'origine animale associée.

Purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

Le lait est une source primaire de nutrition pour le nouveau-né. L’analyse des composants du lait peut donner un aperçu des facteurs maternels qui affectent la santé de la progéniture. Ce protocole décrit une méthode manuelle de prélèvement d’échantillons de lait sur le rat allaitant, qui peut ensuite être utilisé pour une analyse ultérieure en aval.

La collecte du lait dans le rat en utilisant tubes capillaires et estimation de la teneur du lait en matières grasses en Creamatocrit

Nous décrivons une méthode efficace, robuste et rentable pour extraire l'acide nucléique à partir des prélèvements pour la caractérisation des communautés bactériennes en utilisant ARNr 16S séquençage de l'amplicon du gène. La méthode permet une approche de traitement commun pour les types d'échantillons multiples et peut accueillir un certain nombre de processus d'analyse en aval.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

Ce manuscrit décrit un protocole normalisé détaillé du séquençage de haut débit 16 s rRNA-amplicon. Le protocole introduit un protocole intégré, en uniforme, possible et peu coûteux à partir de prélèvement d’échantillons fécaux au moyen d’analyses de données. Ce protocole permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons contenant des normes rigoureuses et plusieurs contrôles.

Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

Nous décrivons ici la détection haut débit et la quantification des oligosaccharides de lait humain fucosylées (HMO) à l’aide d’un biocapteur à germes entiers. Nous démontrons ici, l’adaptation de cette plate-forme vers l’analyse des souches de production HMO, mettant l’accent sur l’amélioration du rapport signal sur bruit.

Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs

Décrit ici est une procédure d'exploitation standard simplifiée pour le profilage de microbiome utilisant le séquençage et l'analyse ménomiques rRNA 16S utilisant des outils librement disponibles. Ce protocole aidera les chercheurs qui sont nouveaux dans le domaine du microbiome ainsi que ceux qui ont besoin de mises à jour sur les méthodes pour atteindre le profilage bactérien à une résolution plus élevée.

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

Cet article décrit comment assembler un appareil qui peut être utilisé pour recueillir le lait de souris de laboratoire. Cet appareil est abordable, portable et permet de recueillir de 0,1 à 0,5 ml de lait par une seule personne formée. Un protocole de traite détaillé est également inclus.

Une technique efficace pour l’échantillonnage du lait sur des souris de laboratoire

L’article décrit un protocole de reconstitution du microbiote pasteurisé du lait maternel à l’aide du microbiote du lait de la mère dans des contextes pratiques et réels. Il démontre une croissance bactérienne et une modulation du microbiome efficaces, soutenant l’application réalisable de cette procédure dans les soins de routine d’une maternité et de sa banque de lait maternel associée.

Reconstitution individualisée du microbiote du lait maternel : une approche réalisable dans des contextes réels

Ce protocole est conçu pour accélérer et permettre l’isolement efficace des vésicules extracellulaires du lait maternel humain de haute pureté.

Isolement rapide de vésicules extracellulaires dérivées du lait maternel humain

Ce protocole permet une évaluation rapide et rentable de la composition microbienne des produits laitiers en combinant la culturomique avec la SM MALDI-TOF. Il fournit des résultats de taxonomie comparables au séquençage de l’ARNr 16S avec un délai d’exécution plus court que les méthodes de culture traditionnelles.

Évaluation de l’innocuité microbienne des laiteries à l’aide du profilage protéomique bactérien via l’approche MALDI

Découvrez le séquençage ciblé de l'ARNr 16S dans le lait maternel à l'aide d'un protocole semi-automatisé. Cette méthode facilite l'étude du microbiome humain et ses implications pour la santé.

Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

Explorer plus de vidéos