Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel

L’objectif global de cette méthode est d’amplifier 16 ARNR à partir de lait maternel et d’autres échantillons à faible biomasse à l’aide d’un protocole semi-automatisé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le développement et les perturbations du microbiome humain en ce qui concerne à la fois la santé et la maladie. Le principal avantage de la technique est qu’elle est semi-automatisée, relativement facile à réaliser et adaptable à plusieurs types d’échantillons, notamment les sécrétions, les écouvillons et les selles.

Après la décongélation et l’attribution du lait entier selon le protocole textuel, faites tourner les échantillons à 5000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les cellules. Utilisez une spatule en plastique ou une pointe de pipette de gros calibre pour retirer la couche supérieure de graisse. Ensuite, sans déranger le granulé, retirez tout le surnageant, à l’exception de 100 microlitres.

Avec un millilitre de PBS, remettez en suspension et lavez la pastille. Préparez ensuite un contrôle négatif en ajoutant un millilitre de PBS stérile dans un tube de cinq millilitres. Transférez la suspension dans un tube à centrifuger propre de cinq millilitres et faites-le tourner à 5000 fois G à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, utilisez une pointe de pipette filtrée stérile de 1000 microlitres pour jeter toute la couche graisseuse surnageante. Pour perturber et homogénéiser l’échantillon, ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse contenant du bêta-mercaptoéthanol à la pastille et transférez la suspension dans un tube à billes. Préparez un témoin positif avec un tampon de lyse et 20 microlitres de l’échantillon bactérien fictif.

Agitez vigoureusement tous les tubes de perles pendant 15 secondes. Ensuite, chauffez les échantillons sur un vortex à température contrôlée à 37 degrés Celsius et 700 à 800 tr/min pendant 10 minutes. Chargez les tubes dans le kit d’adaptateurs de perturbateur d’échantillons automatisé.

Ensuite, battez les échantillons à 30 hertz pendant une minute. Démontez l’adaptateur et basculez-le manuellement avec les plaques d’échantillon du bras robotique gauche au bras robotique droit de l’instrument. Battez les tubes à 30 hertz pendant une minute supplémentaire, puis centrifugez les tubes à 17, 200 fois G et 25 degrés Celsius pendant trois minutes.

À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, retirez tout le surnageant en prenant soin de ne pas prélever la couche graisseuse en haut ou le résidu de bille au bas de l’échantillon. Appliquer le surnageant sur les colonnes d’homogénéisation. Ensuite, centrifugez les colonnes à vitesse maximale et à 25 degrés Celsius pendant trois minutes.

Transférez 350 microlitres d’eluid dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres du fabricant. Pour isoler l’ADN selon le protocole de texte, coupez les couvercles et lissez les bords des colonnes de spin individuelles pour l’ADN et l’ARN. Insérez la colonne de spin DNA sans le tube collecteur dans l’adaptateur de rotor.

Jetez ensuite le tube de prélèvement. Ensuite, insérez les tubes vortex de deux millilitres dans un agitateur, en suivant le tableau de charge de l’instrument de purification automatisé de l’ADN/ARN conformément aux instructions du fabricant. Étiquetez les tubes de prélèvement d’un point de cinq millilitres et insérez-les dans les adaptateurs de rotor.

Ensuite, placez les adaptateurs de rotor dans la centrifugeuse en suivant le tableau de charge de l’instrument de purification automatisé de l’ADN/ARN. Après avoir inséré les pointes filtrantes, l’eau libre de RNase et les réactifs dans le bloc de réactifs de l’instrument, fermez le couvercle de l’instrument et exécutez le programme de purification d’ADN personnalisé sur l’instrument. Lorsque la réaction est terminée, prélevez l’échantillon contenant les tubes de l’agitateur et, s’il reste de l’échantillon, conservez-le à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Après avoir préparé la zone de travail et le master mix PCR, selon le protocole de texte, chargez 50 à 100 microlitres d’échantillons d’ADN dans un adaptateur d’échantillon d’instrument à 32 puits, en suivant la carte de plaque à 96 puits. Pour chaque plaque de PCR, mettez en place deux contrôles négatifs en pipetant 30 microlitres d’eau PCR dans un tube de prélèvement propre de cinq millilitres. Placez ensuite tous les échantillons sur l’adaptateur d’échantillon d’instrument à 32 puits avec les capuchons verrouillés en position ouverte.

Sur l’adaptateur de réactif de l’instrument, retirez le capuchon de chaque amorce inversée avec des numéros de code-barres spécifiques un par un. Pour charger le manipulateur de liquide robotisé, placez l’adaptateur de réactif en position B1.In afin d’éviter un effet de bord, placez soigneusement un bord de l’adaptateur contre le côté de la poignée et abaissez lentement l’autre bord. Assurez-vous d’appuyer sur tous les coins des adaptateurs.

Placez l’adaptateur d’échantillon en position C1, en veillant à pousser sur tous les coins des adaptateurs. Ensuite, vortex le mélange principal de cinq millilitres. Ouvrez le capuchon et placez-le en position A sur le bloc de mixage principal et de réactifs de l’instrument.

Placez la plaque PCR sur l’adaptateur de l’instrument à 96 puits qui est destiné à contenir des plaques PCR à demi-jupe. Démarrez ensuite l’exécution et enregistrez-la en tant que nouveau fichier. Une fois l’exécution terminée, vérifiez qu’il n’y a pas eu d’erreurs.

Utilisez ensuite 12 ou huit capuchons pour sceller la plaque. Vortex vigoureusement et utilisez une toupie à plaques de 96 puits pour faire tourner les plaques pendant une minute. Enfin, placez la plaque sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit déplacée dans la salle de post-amplification et chargée sur le thermocycleur.

Après l’amplification par PCR, effectuer le contrôle de qualité et la préparation de la bibliothèque selon le protocole texte. La première étape du protocole après l’amplification par PCR de la région 16SV4. Comme le montre ici, un microlitre de produit PCR de chaque échantillon a été analysé par électrophorèse pour confirmer qu’il se situait dans la plage de taille attendue de 350 à 450 paires de bases.

Certains échantillons de lait maternel ont généré de plus faibles quantités de produit spécifique, ce qui suggère soit de faibles niveaux d’ADN microbien extrait dans ces échantillons, soit un transfert d’inhibiteurs de PCR pendant l’extraction. La quantification d’un produit spécifique pour chaque échantillon était essentielle pour déterminer le volume requis pour un regroupement molaire égal des échantillons pour le séquençage. Une banque groupée pour le séquençage ciblé est généralement dominée par un produit PCR spécifique.

S’il y a une quantité importante de produit non spécifique dans la bibliothèque, une étape de purification du gel doit être ajoutée au flux de travail. Les résultats du séquençage montrent une grande diversité dans les taxons associés au microbiome du lait humain et une variabilité dans le nombre de numérations de roseaux de séquençage pour chaque échantillon. En revanche, la composition des taxons et le nombre de roseaux pour le simulacre bactérien étaient comparables aux résultats obtenus pour le simulacre lors d’exécutions précédentes, ce qui suggère que la variabilité observée pour les échantillons de lait maternel est un résultat expérimental authentique et non une fonction de la variabilité intrinsèque du flux de travail.

Si vous laissez un séquenceur fonctionner pendant la nuit, cette technique peut être réalisée en deux jours, pour 12 à 24 échantillons, si tous les échantillons s’amplifient lors de la PCR initiale. Sinon, une autre journée de coquillage est nécessaire. Lors de cette procédure, il est important de se déplacer uniquement de la zone pré-PCR à la zone post-PCR pour éviter toute contamination.

Il est également essentiel de changer fréquemment de gants pour éviter toute contamination croisée. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons humains peut être dangereux et que des précautions, telles qu’un équipement de protection approprié et des enceintes de sécurité biologique, doivent toujours être utilisées.