Name: Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez la quantification simultanée du superoxyde/eau oxygénée et du NADH par fluorimétrie en microplaque. Cette méthode permet d'évaluer directement le potentiel de production de ROS des déshydrogénases mitochondriales flaviniques purifiées.

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Ce travail a été financé par les Sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG). Production vidéo a été réalisée en collaboration avec le centre d’Innovation dans l’enseignement et l’apprentissage (CITL) à l’Université Memorial de Terre-Neuve.

1. produits chimiques et des Enzymes purifiées
<ol><li>Se procurer les matériaux suivants : CPD et KGDHC d’origine porcine de coeur (ou un autre flavoenzymes mitochondrial purifié) ; H2O2 (solution à 30 %), le pyruvate, α-cétoglutarate, NAD+, NADH, CoASH, pyrophosphate de thiamine (TPP), saccharose mannitol, HEPES, EGTA, 3-méthyl-2-oxo-valérique (KMV), superoxyde dismutase (SOD), la peroxydase de raifort (HRP), 10-acétyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine réactif (AUR) et CPI-613.</li>
</ol>2. planification de l’analyse et préparation du réactif
<ol><li>Mettre en place l’analyse selon le tableau 1 dans une plaque à 96 puits. Remarque : Le volume total de chaque réaction est 200 µL. concentrations de Stock sont ajustées de façon à 20 µL de réactif est ajouté à chaque puits. Cela garantit l’ajout rapide de cofacteurs et substrats à chaque réaction bien avant de commencer l’essai.</li>
	<li>Préparer le tampon de réaction contenant 220 mM de mannitol, sucrose de 70 mM, 1 mM EGTA et 20 mM HEPES (pH 7,4 avec HCl). Remarque : Cela pourrait changer en fonction des propriétés physiques des différentes enzymes purifiées.</li>
	<li>Examiner les KGDHC ou les CPD purifiée de la contamination à l’aide d’enzyme dosages d’activité14,16,17 ou par immunoblot ou tache de bleu de Coomassie5.</li>
	<li>Préparer tous les réactifs dans la mémoire tampon de réaction selon la concentration de solution de travail dans le tableau 1.</li>
	<li>Conserver tous les réactifs comme aliquotes de 1 mL à-20 ° C. Stocker le pyruvate et le α-cétoglutarate à-80 ° C dans des aliquotes de 100 µL à prévenir la dégradation spontanée due à l’auto-oxydation et de gel-dégel répété.</li>
	<li>Préparation du réactif AUR maître stock dans 1 mL de DMSO et diluer à 100 µM de tampon de réaction. Boutique abri de la lumière. NOTE : Ici, la solution de travail 100 µM est fait frais par 2 ou 3 semaines et l’abri de la lumière.</li>
</ol>3. mise en place du modèle d’essai
<ol><li>Configurer le mode opératoire sur un lecteur de microplaques monochrome avec des capacités de mesure double.</li>
	<li>Définissez la procédure de lecture en sélectionnant « Protocole ». Puis cliquez sur « Procédure ».</li>
	<li>« TEMPÉRATURE » de la valeur à 25 ° C (Figure 1 a).</li>
	<li>Cliquez sur « Démarrer KINETIC » pour définir les conditions de lecture (Figure 1 a). Régler l’heure et le nombre d’intervalles/expériences de lecture.</li>
	<li>Cliquez sur « lire » (Figure 1 b). Remarque : Les échantillons sont lues à partir en position supérieure avec un gain de 50. Durée : 5 min, lire à intervalles de 30 s. Canal 1 : Fluorescence résorufine - excitation/émission = 565 nm:600 nm, largeur de longueur d’onde de 13,5 nm. Canal 2 : NADH autofluorescence - excitation/émission = 376 nm:450 nm, largeur de longueur d’onde de 20 nm.</li>
	<li>Sous « Lecture », sélectionnez puits au moniteur (p. ex., A1-A4 et B1-B4).</li>
	<li>Sélectionnez « END cinétique ».</li>
</ol>4. courbes de niveau
<ol><li>Décongeler les réactifs et les stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.</li>
	<li>
Courbe d’étalonnage (Figure 2 a) de la NADH
	<ol>
<li>Préparer les solutions de travail pour le NADH dans des concentrations allant de 0,5 à 10 mM de tampon de réaction.</li>
		<li>Ajouter 20 µL d’extraits de chaque NADH travailler la concentration de la solution aux puits contenant 180 µL de tampon de réaction. La concentration finale de NADH dans chacune est bien 0.05-1 mM.</li>
		<li>Cliquez sur « Lire » et définissez excitation/émission = 376 nm:450 nm, largeur de longueur d’onde de 20 nm. Remarque : Il s’agit d’un point de terminaison en lecture seule - les paramètres cinétiques ne sont pas nécessaires.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Courbe d’étalonnage AUR (Figure 2 b)
	<ol>
<li>Préparer les stocks de travail du peroxyde d’hydrogène dans le tampon de réaction ; concentrations de stock varient de 200-4 000 nM.</li>
		<li>Ajouter 120 µL de tampon de la réaction dans chaque puits.</li>
		<li>Ajouter 20 µL de HRP (concentration stock de travail = 30 U/mL, la concentration finale dans le puits = 3 U/mL), 20 µL de SOD (travail stock concentration = 250 U/mL, la concentration finale dans le puits = 25 U/mL) et 20 µL d’AUR (travail stock concentration = 100 µM la concentration finale dans le puits = 10 µM) pour chaque tampon bien contenant de la réaction.</li>
		<li>Ajouter 20 µL de chaque H2O2 solution stock à chaque cupule contenant le tampon et le dosage des réactifs de travail. Le volume réactionnel final est 200 µL et la concentration finale de H2O2 dans chaque puits est de 20 à 400 nM.</li>
		<li>Incuber les boîtes pendant 1 min dans le lecteur de plaque à 25 ° C.</li>
		<li>Cliquez sur « Lire » et définissez excitation/émission = 565 nm/600 nm, largeur de longueur d’onde de 13,5 nm. Notez qu’il s’agit d’un point de terminaison en lecture seule - paramètres cinétiques ne sont pas nécessaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. mesure O●- / h2 O2 version2et la Production de NADH par KGDHC et CPD
<ol><li>Voir le tableau 1 de l’ordre d’ajout des différents réactifs, la concentration de chaque solution de travail et le volume ajouté à chaque puits.</li>
	<li>Ajouter 40 µL de tampon de réaction dans chaque puits. Pour les tests à l’aide de KMV ou CPI-613, ajouter 20 µL de tampon dans chaque puits.</li>
	<li>Ajouter 20 µL de CPD ou KGDHC (stock de travail de 1 U/mL, la concentration finale / puits = 0,1 U/mL) dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber les CPD et KGDHC à 25 ° C pendant 2 min.</li>
	<li>Ajouter 20 µL de KMV (stock de travail = 100 mM, concentration finale = 10 mM) ou 20 µL du CPI-613 (travail de concentration stock = 1,5 mM, concentration finale = 150 µM) (tableau 2). Remarque : Cette étape peut être exclue si les inhibiteurs ne sont pas utilisés pour les essais.</li>
	<li>Incuber pendant 1 min à 25 ° C. Remarque : Cette étape peut être exclue si les inhibiteurs ne sont pas utilisés pour les essais.</li>
	<li>Ajouter 20 µL de HRP (concentration stock de travail = 30 unités/mL, la concentration finale dans le puits = 3 unités/mL) et 20 µL de SOD (travail de concentration stock = 250 unités/mL, la concentration finale dans le puits = 25 unités/mL) dans chaque puits.</li>
	<li>Ajouter 20 µL du coenzyme A (concentration stock de travail = 1 mM, concentration finale = 0,1 mM), 20 µL de biens meubles corporels (concentration stock de travail = 3 mM, concentration finale = 0,3 mM) et 20 µL de NAD+ (travail concentration stock = 10 mM, concentration finale = 1 mM) à chaque w Ell.</li>
	<li>Retirer le réactif AUR du revêtement de papier d’aluminium protectrice et ajouter 20 µL à chaque puits.</li>
	<li>Ajouter 20 µL du pyruvate (stock concentration allant de 1 à 100 mM, concentration finale pour des dosages de travail = 0,1 à 10 mM) à puits contenant des CPD et le α-cétoglutarate (stock concentration allant de 1 à 100 mM, concentration finale pour des dosages de travail = 0,1 à 10 mM) à puits contenant des KGDHC.</li>
	<li>Cliquez sur « Lecture » pour démarrer la mesure cinétique.</li>
</ol>6. analyse de données
<ol><li>Maintenez enfoncée la touche « CTRL » du clavier et cliquez sur puits pour générer un graphique contenant toutes les mesures cinétiques correspondant à la chaîne 1 (Figure 3 a).</li>
	<li>Cliquez sur « données » dans l’icône à afficher dans le coin supérieur droit pour les valeurs brutes pour les unités de la fluorescence relative (RFU) mesurées aux points différents temps (Figure 3 b).</li>
	<li>Exporter les valeurs pour l’analyse (tableau 3).</li>
	<li>Cliquez sur la « Graph » liste déroulante en haut à gauche (Figure 3 b) pour accéder aux valeurs de la RFU associées au canal de fluorescence 2.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.1 à 6.3 pour canal 2.</li>
</ol>

<ol><li>Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+the+fundamentals+of+electron+transfer+reactions+in+mitochondria+and+the+production+and+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species.</a> Redox Biol. 4, 381-398 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+years+of+Mitchell%27s+proton+circuit%3A+From+little+grey+books+to+little+grey+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Forty years of Mitchell's proton circuit: From little grey books to little grey cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).</li>
<li>Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+generation+of+superoxide+and+hydrogen+peroxide+as+the+source+of+mitochondrial+redox+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling.</a> Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).</li>
<li>Massey, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+molecular+oxygen+by+flavins+and+flavoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins.</a> J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
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<li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+reactive+oxygen+species+in+the+reaction+catalyzed+by+alpha-ketoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase.</a> J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).</li>
<li>Slade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+forming+and+quenching+potential+of+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).</li>
<li>O'Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-glutathionylation+alters+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+emission+from+pyruvate+dehydrogenase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex.</a> Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).</li>
<li>Quinlan, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2-oxoacid+dehydrogenase+complexes+in+mitochondria+can+produce+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+at+much+higher+rates+than+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I.</a> J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).</li>
<li>Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+production+by+GSH+mediated+S-glutathionylation+of+2-oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase.</a> Redox Biol. 8, 285-297 (2016).</li>
<li>Mailloux, R. J., Gardiner, D., O'Brien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Oxoglutarate+dehydrogenase+is+a+more+significant+source+of+O2%28.-%29%2FH2O2+than+pyruvate+dehydrogenase+in+cardiac+and+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue.</a> Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).</li>
<li>Ambrus, A., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dihydrolipoamide+dehydrogenase+%28E3%29+deficiency%3A+Novel+insights+into+the+structural+basis+and+molecular+pathomechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism.</a> Neurochem Int. , (2017).</li>
<li>Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+levels+of+formate+activate+mitochondrial+superoxide%2Fhydrogen+peroxide+release+from+mouse+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria.</a> FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).</li>
<li>Fisher-Wellman, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+glutathione+depletion+reveals+a+novel+role+for+the+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+a+key+H2O2-emitting+source+under+conditions+of+nutrient+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).</li>
<li>Kussmaul, L., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+superoxide+production+by+NADH%3Aubiquinone+oxidoreductase+%28complex+I%29+from+bovine+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).</li>
<li>Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+mitochondrial+respiratory+complex+II+from+chicken+heart%3A+a+membrane-protein+complex+diffracting+to+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0.</a> A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).</li>
<li>Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+glycerol-3-phosphate+dehydrogenase%2C+an+essential+monotopic+membrane+enzyme+involved+in+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).</li>
</ol>

Il n’y a rien à divulguer.

Ce protocole est avantageux depuis, 1) il élimine toute réactions concurrentes qui peuvent interférer avec la détection de2 H2O (p. ex., systèmes antioxydants ou autres sources de ROS), 2) fournit une évaluation directe de la vitesse native de ROS de sortie par une déshydrogénase mitochondriale flavine, 3) permet la comparaison de l’indigène ROS libérer les taux de deux ou plus purifiée axée sur la flavine déshydrogénases, 4) peut permettre une comparaison directe du taux d’activité de libé...

Le but ultime du métabolisme des éléments nutritifs est de faire de l’adénosine triphosphate (ATP). Dans les cellules de mammifères, cela se produit dans les mitochondries, organites membrane double qui convertissent l’énergie stockée en carbone en ATP. La production d’ATP commence lorsque le carbone est brûlé par les mitochondries formant deux transporteurs d’électrons, NADH et la flavine adénine dinucléotide (FADH2)1. NADH et FADH2 sont ensuite oxydé par sous-unité multiples complexes respiratoires I et II, respectivement, et les électrons libérés sont transportés à la terminal d’électron accepteur moléculaire l’oxygène (O2) au complexe IV1. Le thermodynamiquement favorable « descente » transfert d’électrons à O2 à la fin de la chaîne est couplé à l’exportation des protons dans l’intermembranaire espace par les complexes I, III et IV. Cela crée un gradient électrochimique transmembranaire de protons (force proton-motrice), une forme temporaire d’énergie libre de Gibbs qui est exploité par complexe V faire ATP2. Réactions de transfert d’électrons dans les mitochondries ne sont pas parfaitement couplées à la production de l’ATP. À divers moments durant le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, les électrons peuvent interagir prématurément avec O2 pour former ROS3. Les ROS plus biologiquement pertinentes générées par les mitochondries sont O2● - et H2O2. O2● - est considéré souvent comme le ROS proximale formées par les mitochondries, il est maintenant évident que les sites de production de forment un mélange de O2● - et H2O2, qui est associé à la libre chimie radicalaire de flavin prothétique regroupe4,5. Des niveaux élevés, ROS peuvent être dangereux, endommageant des constituants biologiques requis pour la fonction cellulaire résultant en détresse oxydante6. Toutefois, à de faibles quantités, ROS mitochondriales remplissent les fonctions vitales de signalisation. Par exemple, H2O2 libération des mitochondries a été impliquée en contrôlant l’activation des lymphocytes T, la contrainte de signalisation (par exemple, l’induction des voies de signalisation Nrf2), l’induction de la prolifération cellulaire et la différenciation, signalisation de l’insuline et libération et alimentation comportement7. Des progrès considérables accomplis dans la compréhension de la fonction de signalisation de ROS. Cependant, importantes questions demeurent au sujet desquels enzymes dans les mitochondries servent de sources les plus importantes et la façon dont la production est contrôlée.
Communiqué de ROS par un site de production dépend de plusieurs facteurs : 1) la concentration de l’électrodonneur site, 2) l’état d’oxydoréduction du site Don électron, 3) l’accès à l’oxygène et 4) la concentration et le type d’oxydation substrat3, 8 , 9. dans les mitochondries, d’autres facteurs comme la concentration de NADH et membrane force potentielle aussi influer sur la production de ROS8,10. Par exemple, le taux de O2●-/ h2O2 production de purifiée CPD ou KGDHC augmente avec l’augmentation NADH disponibilité5,11. Dans ce scénario, les électrons sont refluer de NADH vers le centre de la FAD dans la sous-unité de3 E du CPD ou KGDHC, le site d’O2●-/ h2O2 production12. De même, la fourniture de NAD+ a l’effet inverse, en diminuant la libération ROS du KGDHC12. Ainsi, contrôle entrée ou sortie des électrons provenant de sites de production de ROS peut altérer combien O2●-/ h2O2 est formé. Par exemple, blocage de la sous-unité de2 E de la CPD ou KGDHC avec un acide lipoïque analogique, diminuent des résultats dans un presque 90 % O2●-/ h2O2 production13, CPI-613. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec le chimique S-glutathionylation catalyseurs, diamide et disulfiram, qui abolir presque O2●/h2O2 production de CPD ou KGDHC par l’intermédiaire de la conjugaison du glutathion au E 2 sous-unités14. Le compromis pour bloquer le flux d’électrons par l’intermédiaire de la sous-unité de2 E de la CPD et KGDHC y a une diminution dans la production de NADH qui diminue la formation de ROS par la chaîne de transport d’électrons (p. ex., complexe III). Cela peut également diminuer la production d’ATP par la chaîne de transport d’électrons. Dans l’ensemble, le fait de bloquer l’entrée des électrons à des sites de production de ROS peut être un moyen très efficace de contrôle de la O2●-/ h2O2 production.
Les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 potentiels O2●-/ h2O2 sources6. La plupart de ces sites sont flavin-contenant des enzymes qui génèrent un mélange d’O2● - et H2O2. Utilisation de différents substrats et carboxypénicillines ont permis l’identification dont complexes respiratoires et déshydrogénases mitochondriales servent de haute capacité O2●-/ h2O2 formant des sites en 3de différents tissus. CPD et KGDHC ont démontré pour servir de grande capacité O2●-/ h2O2 sites émettant dans le muscle et les mitochondries du foie13,15. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne l’examen de l’O2●-/ h2O2 formant des potentiels des sites individuels dans les mitochondries et l’impact ayant différents substrats et carboxypénicillines sur les activités des enzymes. Cela est dû à la présence de réactions secondaires indésirables (p. ex., formation de O2●-/ h2O2 par des sites autres que l’enzyme d’intérêt), contaminant nutriments endogènes (p. ex.,gras les acides) ou organites (p. ex., peroxysomes qui font également O2●-/ h2O2) et l’utilisation d’inhibiteurs que le manque de sélectivité, ou l’utilisation de composés qui n’inhibent pas complètement la production de ROS. Certains inhibiteurs peuvent également altérer la bioénergétique mitochondriale et la direction du flux d’électrons, et cela modifie ROS communiqué provenant d’autres sites de production et confond les résultats. Les taux absolus de O2●/h2O2 libération de sites individuels dans les mitochondries sont également difficiles à quantifier en raison de la forte concentration d’O2● - et H2O2 éliminer les enzymes dans l’espace intermembranaire et de matrice. Par conséquent, élimination de toute réaction concurrente qui peuvent interférer avec l’O2●-/ h2O2 communiqué de mesures peut être utile lorsqu’on veut identifier haute capacité O2●-/ h2O2 formant des sites.
Nous présentons ici une méthode simple qui permet l’examen simultané de O2●-/ h2O2 production et de la formation de NADH par purifiée déshydrogénases flavin-dépendante. À l’aide d’enzymes purifiées, indésirables ROS formant des réactions secondaires et ROS enzymes dégradant peut être éliminé permettant une mesure plus précise des indigènes O2●-/ h2O2 taux de production pour chaque flavoenzymes. Cette méthode peut être utilisée pour comparer directement l’O2●-/ h2O2 formant la capacité des différents déshydrogénases purifiées ou aux inhibiteurs spécifiques au site potentiel écran pour O2●-/ h2O version 2 . Enfin, mesurant O2●-/ h2O2 et la production de NADH en même temps permet une évaluation en temps réel de la relation entre l’activité enzymatique et la capacité de sortie ROS.

<table><tbody><tr><td>Complexe pyruvate déshydrogénase</td><td>SIGMA</td><td>P7032-10UN</td> Complexe <td>flavoenzyme</td></tr><tr><td>alpha-cétoglutarate déshydrogénase</td><td>purifié SIGMA</td><td>K1502-20UN</td><td>Flavoenzyme purifiée</td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène à 30 %</td><td>SIGMA</td><td>HX0640-5</td><td>réactif, courbes standard</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>SIGMA</td><td>N0632-1G</td><td>réactif, test de</td></tr> <tr><td>libération d’activité/ROSRéactif NADH</td><td>SIGMA</td><td>N4505-100MG</td><td>, courbes standard</td></tr><tr><td>pyruvate</td><td>SIGMA</td><td>P2256-5G</td><td>réactif, test d’activité/libération de ROS</td></tr><tr><td>alpha-cétoglutarate</td><td>SIGMA</td><td>75892-25G</td><td>réactif, test d’activité/libération de ROS</td></tr><tr><td>Réactif CoASH</td><td>SIGMA</td><td>C3019-25MG</td><td>, test de libération de ROS pyrophosphate</td></tr> de <tr><td>thiamine</td><td>SIGMA</td><td>C8754-1G</td><td>réactif, activité/dosage de libération de ROS</td></tr><tr><td>mannitol</td><td>SIGMA</td><td>M4125-100G</td><td>composant tampon</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SIGMA</td><td>H3375-25G</td><td>composant tampon</td></tr><tr><td>saccharose</td><td>SIGMA</td><td>S7903-250G</td><td>composant tampon</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SIGMA</td><td>E3889-10G</td><td>composant tampon</td></tr><tr><td>KMV</td><td>SIGMA</td><td>198978-5G</td><td>réactif, inhibiteur de libération de ROS</td></tr><tr><td>CPI-613</td><td>Santa Cruz</td><td>réactif sc-482709</td><td>, réactif inhibiteur de libération de ROS</td></tr><tr><td>SOD</td><td>SIGMA</td><td>S9697-15KU</td><td>, réactif de détection de libération de</td></tr><tr><td>raifort peroxydase</td><td>SIGMA</td><td>P8375-1KU</td><td>, réactif de détection de libération de ROS</td></tr><tr><td>Amplex Ultra Red</td><td>Thermofisher</td><td>A36006</td><td>, détection de libération de ROS</td></tr><tr><td>Biotech Synergy 2 lecteur de microplaques</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>lecteur de microplaques pour dosages</td></tr><tr><td>Logiciel Gen5 Logiciel</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>, utilisé pour la collecte de RFU bruts</td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Logiciel Graphpad</td><td></td><td>, analyse de données</td></tr><tr><td>Microsoft EXCEL</td><td>Logiciel Microsoft</td><td></td><td>, analyse de données</td></tr></tbody></table>

mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et nadh production de flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

Il a été signalé que les mitochondries peuvent contenir jusqu'à 12 sources enzymatiques des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Une majorité de ces sites sont complexes respiratoires flavin-dépendante et déshydrogénases qui produisent un mélange de superoxyde (O2● -) et de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Une quantification précise du potentiel ROS-produisant des sites individuels dans les mitochondries isolées peut être difficile en raison de la présence de systèmes de défense antioxydants et les réactions secondaires qui forment aussi O2●-/ h2O2. Utilisation d’inhibiteurs non spécifiques qui peuvent perturber la bioénergétique mitochondriale peut aussi compromettre Mensurations en altérant la libération ROS provenant d’autres sites de production. Nous présentons ici une méthode simple pour la mesure simultanée de la libération de H2O2 et de la production de la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) par purifiée déshydrogénases lié à flavin. Pour nos besoins ici, nous avons utilisé purifiée pyruvate déshydrogénase complexe (CPD) et α-cétoglutarate déshydrogénase complexe (KGDHC) d’origine porcine coeur comme exemples. Cette méthode permet une mesure précise native H2O2 taux de lixiviation par différents sites de production en éliminant les autres sources potentielles des systèmes ROS et antioxydant. En outre, cette méthode permet une comparaison directe de la relation entre la libération de H2O2 et de l’activité enzymatique et de la projection de l’efficacité et la sélectivité des inhibiteurs de la production de ROS. Dans l’ensemble, cette approche peut permettre l’évaluation approfondie des taux natifs de ROS libération d’enzymes individuelles avant d’effectuer des expériences plus sophistiqués avec des mitochondries isolées ou perméabilisée fibre musculaire.

Figure 3 a prévoit une trace représentante la RFU recueillie pendant la mesure simultanée de la production de NADH et de H2O2 KGDHC purifiée. Les données brutes de RFU pour chaque intervalle de temps sont représentées dans la Figure 3 b. Les données brutes de la RFU sont ensuite exportées pour analyse. En extrapolant à partir des courbes standard présentés dans la Figure 2, la q...

Les mitochondries contiennent plusieurs enzymes de flavin-dépendante qui peuvent produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS). ROS de surveillance communiqué de sites individuels dans les mitochondries est difficile en raison de réactions secondaires indésirables. Nous présentons une méthode simple et peu coûteuse pour une évaluation directe des tarifs natives pour libération ROS en utilisant flavoenzymes purifiée et microplaque fluorométrie.

Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

L’objectif global de cette procédure est de quantifier le taux de production de superoxyde/peroxyde d’hydrogène et de NADH des mitochondriases déshydrogénases purifiées contenant des flavines à l’aide de la fluorométrie sur microplaques. Les mitrochondries peuvent contenir jusqu’à 12 sites différents de formation de superoxydes/peroxydes d’hydrogène qui ont été identifiés à l’aide de différentes combinaisons de substrats et d’inhibiteurs avec des mitochondries isolées. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne la quantification précise de la capacité de libération des différents sites de production dans les mitochondries isolées.Et cela est associé à des réactions secondaires indésirables qui produisent également des espèces réactives de l’oxygène, mais aussi à la présence d’antioxydants et à l’utilisation d’inhibiteurs qui manquent de spécificité en plus de l’utilisation d’additifs qui peuvent interférer avec les mesures. Nous présentons ici la méthode de mesure simultanée de la production de superoxyde/peroxyde d’hydrogène et de NADH par des déshydrogénases mitochondriales purifiées dépendantes de la flavine. Cette méthode est avantageuse car elle permet de q

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