Mesure simultanée de superoxyde/eau oxygénée et NADH Production de Flavin-contenant des déshydrogénases mitochondriales

L’objectif global de cette procédure est de quantifier le taux de production de superoxyde/peroxyde d’hydrogène et de NADH des mitochondriases déshydrogénases purifiées contenant des flavines à l’aide de la fluorométrie sur microplaques. Les mitrochondries peuvent contenir jusqu’à 12 sites différents de formation de superoxydes/peroxydes d’hydrogène qui ont été identifiés à l’aide de différentes combinaisons de substrats et d’inhibiteurs avec des mitochondries isolées. Cependant, certaines difficultés subsistent en ce qui concerne la quantification précise de la capacité de libération des différents sites de production dans les mitochondries isolées.

Et cela est associé à des réactions secondaires indésirables qui produisent également des espèces réactives de l’oxygène, mais aussi à la présence d’antioxydants et à l’utilisation d’inhibiteurs qui manquent de spécificité en plus de l’utilisation d’additifs qui peuvent interférer avec les mesures. Nous présentons ici la méthode de mesure simultanée de la production de superoxyde/peroxyde d’hydrogène et de NADH par des déshydrogénases mitochondriales purifiées dépendantes de la flavine. Cette méthode est avantageuse car elle permet de quantifier directement et précisément le potentiel de production de ROS de sites de production individuels en éliminant les réactions secondaires indésirables et tout système d’extinction des espèces réactives de l’oxygène.

La mesure simultanée de la production de ROS et de NADH permet également de comparer directement le potentiel de formation de superoxydes/peroxydes d’hydrogène et l’activité d’enzymes individuelles, ce qui peut être précieux pour le dépistage des inhibiteurs de la production de ROS avant d’effectuer des tests avec des mitochondries. Pour nos besoins ici, nous utiliserons le complexe pyruvate déshydrogénase et le complexe alpha-cétoglutarate déshydrogénase d’origine porcine à titre d’exemples. Les deux sont des enzymes contenant des flavines et des sources connues d’espèces réactives de l’oxygène.

De plus, ces deux enzymes peuvent être facilement purifiées. La mesure simultanée du superoxyde/peroxyde d’hydrogène et du NADH est réalisée en suivant les changements de florescence. Le NADH a ses propres propriétés intrinsèques de fluorescence, ce qui permet de mesurer facilement sa production.

Les modifications du superoxyde/peroxyde d’hydrogène, quant à elles, nécessitent la superoxyde dismutatase, la peroxydase de raifort et le réactif ultra-rouge amplex. En présence de peroxydase de raifort et de peroxyde d’hydrogène, l’ultrarouge amplex est converti d’une molécule non fluorescente en résorufine fluorescente. La superoxyde dismutase garantit que tout superoxyde formé par la déshydrogénase étudiée est converti en peroxyde d’hydrogène.

Avant la mise en place du test, des solutions fonctionnelles sont préparées. Pour rationaliser le test, tous les réactifs sont ajoutés dans les puits d’une plaque noire de 96 puits dans des aliquotes de 20 microlitres. Le volume de chaque réaction dans le puits est de 200 microlitres, donc les solutions de travail sont 10 fois la concentration trouvée dans le puits de réaction.

Ensuite, programmez le lecteur de microplaques pour qu’il exécute un test cinétique pour la double mesure de l’autoflorescence du NADH et de la florescence de la résorufine. Pour ce faire, il suffit de sélectionner d’abord Procédure et de la régler sur 25 degrés Celsius. Ensuite, cliquez sur Démarrer kinetic.

Réglez la durée pour qu’elle s’exécute pendant environ cinq minutes, suivie de la sélection d’un intervalle de lecture fluorescente de 30 secondes. Ensuite, cliquez sur Lire et définissez les paramètres de mesure de la fluorescence pour votre test. Ici, la position de la sonde, les longueurs d’onde utilisées pour suivre les changements de fluorescence et les puits qui seront lus sont saisis dans le logiciel.

Les différents canaux pour les lectures fluorescentes sont également sélectionnés, l’un d’entre eux étant dédié à l’autoflorescence du NADH, qui est réglé sur une excitation de 376 nanomètres et des longueurs d’onde d’émission de 450 nanomètres. Les changements dans la florescence de la résorupine sont suivis à 565 nanomètres et 600 nanomètres. Une fois les conditions d’analyse établies, les puits individuels sont remplis d’un tampon et de différents réactifs nécessaires pour mesurer à la fois la production de NADH et de superoxyde/peroxyde d’hydrogène.

L’ordre de chargement des puits avec différents réactifs est le suivant. Tout d’abord, la quantité requise de tampon est ajoutée au puits, suivie de l’ajout de 20 microlitres de solution enzymatique purifiée. L’enzyme est équilibrée dans le tampon pendant quelques minutes à l’intérieur de l’instrument.

Ensuite, les réactifs restants sont ajoutés dans l’ordre suivant. Une fois le substrat ajouté, appuyez sur Démarrer. Le support de plaque entrera dans le lecteur et le protocole sera lancé.

Au cours de l’essai, les sorties en temps réel des unités fluorescentes relatives brutes, ou RFU, peuvent être suivies à l’aide du logiciel. L’utilisateur peut basculer entre les différentes lectures fluorescentes à l’aide de l’onglet Données au-dessus de la disposition du puits. Notez que les courbes des différentes lectures fluorescentes peuvent être sélectionnées.

De plus, en maintenant la touche Ctrl du clavier enfoncée et en cliquant avec le bouton gauche sur les puits, on peut obtenir un graphique composite permettant de comparer en temps réel les différentes réactions. À la fin de l’expérience, le porteur de microplaques sortira de l’instrument. À ce stade, les résultats du graphique représentatif des modifications dans RFU sont exportés vers Excel.

Les valeurs brutes des RFU sont exportées en cliquant d’abord sur Données sur le graphique RFU représentatif. Cela produira un tableau des valeurs RFU brutes pour la fluorescence du NADH et de la résorufine. Non pas que les numéros RFU bruts correspondant aux changements de NADH ou de florescence de la résorupine ne puissent pas être exportés simultanément.

Une fois exportés, les résultats sont organisés pour l’analyse. À l’aide de courbes standard pour la fluorescence du NADH et de la résorupine générées avant la réalisation de l’essai, la quantité de NADH dans la micromole et de superoxyde/peroxyde d’hydrogène dans le picomole formée au fil du temps peut être calculée. Cela peut être suivi par le calcul du taux de production de NADH et de superoxyde/peroxyde d’hydrogène.

Pour cette procédure, il est essentiel de vérifier la pureté de votre déshydrogénase isolée contenant des flavines avant d’effectuer des tests. Cela peut être réalisé en effectuant une simple coloration de Coomassie pour les protéines ou en dosant l’activité de l’enzyme en présence de différents substrats. Notez qu’il est conseillé d’omettre les agents réducteurs comme le DTT du test car ils peuvent servir de substrat pour la production de superoxydes/peroxyde d’hydrogène par les déshydrogénases liées à la flavine.

Dans l’ensemble, cette méthode est très flexible en ce sens qu’elle peut être utilisée pour cribler les inhibiteurs de la production de superoxyde/peroxyde d’hydrogène et permet également une comparaison directe de la capacité de formation de ROS de différentes déshydrogénases mitochondriales liées aux flavines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension intime de la façon de mesurer la production de ROS et de NADH par les déshydrogénases purifiées. Ce test peut servir de tremplin pour des expériences plus sophistiquées avec des mitochondries isolées.