Name: Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Apprenez à quantifier les cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë par cytométrie en flux. Cette méthode applicable en laboratoire clinique permet le diagnostic et le suivi thérapeutique.

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Ce travail a été soutenu en partie par le Français Association Laurette Fugain, LigueContre le Cancer (Centre Nord), Fondation de France (Comité de leucémie), SIRIC Oncolille et Français du National Cancer Institute.

Nous suivons les normes européennes pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique local (#3097-2015120414583482v3).
1. préparation de l’échantillon
<ol><li>Recueillir la moelle osseuse (2 mL) de novo de AML dans des tubes contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique anticoagulant (EDTA) à une concentration de 1,8 mg / mL de moelle osseuse.</li>
	<li>Effectuer la séparation de Ficoll, une séparation de gradient de densité à isoler des cellules mononucléaires de globules rouges et des granulocytes, comme suit. Diluer la moelle osseuse en 3 volumes de solution saline de tampon au phosphate (PBS : NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na2HPO4 , KH2PO4 1,8 mM). Le recouvrement soigneusement 1 volume de Ficoll et 1 volume de moelle diluée. Faire tourner 30 minutes à 300 x g sans frein. Transférer la couche blanc couche leuco-plaquettaire de cellules mononucléées dans un nouveau tube stérile.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois dans 10 mL de PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 5 min, afin de supprimer les composants de sérum contaminantes.</li>
</ol>2. la lyse des globules rouges (RBC)
<ol><li>Ajouter 2 mL de tampon de lyse (chlorure d’ammonium 0,8 %) à la cellule de granule, vortex doucement et incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Remarque : si nécessaire, répétez cette étape.</li>
	<li>Cellules de lavage en PBS comme décrit précédemment (1.3.).</li>
</ol>3. le patient dérivé des xénogreffes.
<ol><li>Obtenir les cellules blastiques de la moelle osseuse après la séparation de Ficoll et après épuisement de lymphocytes à l’aide d’immunomagnetic négatif sélection (CD3 pour T- et CD20 des lymphocytes B). Suivez les instructions du fabricant.</li>
	<li>Injecter 5 x 106 cellules blastiques d’AML dans la veine de queue de souris NSG inconditionnées. Utiliser un dispositif de retenue pour faciliter l’injection dans la veine queue. Garder des souris dans des conditions classiques et surtout dans des conditions spécifiques-exempts de micro-organismes pathogènes en tout temps, en utilisant des cages ventilées individuelles et en manipulation sous hotte à flux laminaire. Toutes les deux semaines, prenez 60 µL de sang par la méthode de collecte sous-maxillaire utilise un hématocrite capillaire. Place le capillaire dans un 5 mL rond tube inférieur. Arrêter le saignement en appliquant une légère pression à l’aide d’une petite compresse stérile. Expulser le sang avec une seringue propre.</li>
	<li>Ajouter 1ml de tampon de lyse et incuber pendant 5min. Puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min. laver avec PBS et centrifugre à 300 x g pendant 5 minutes. Retirer le surnageant, l’ajouter 100 µL PBS avec 10 % d’albumine sérique bovine (BSA) tache avec 3 anti-humain µL CD45-FITC et anti-murin 1 µL CD45-APC et incuber à 4 ° C pendant 30 minutes.</li>
	<li>Laver le culot cellulaire deux fois dans du PBS (2 mL) avec 10 % de BSA et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aliquote jusqu'à 1 x 106 cellules par 100 µL de PBS dans des tubes de cytométrie de flux.</li>
	<li>Enquête sur la prise de greffe toutes les deux semaines par l’analyse de chimérisme d’expression de CD45 (humain versus murin) utilisant l’écoulement cytometry (Figure 2 a et B).</li>
	<li>Au moment du sacrifice (comte de blast périphérique supérieure à 70 % ou de signes cliniques graves de la maladie), recueillir les cellules blastiques mononucléaires des rates concassées d’et de la moelle osseuse en rinçant les tibias et fémurs avec PBS comme décrit plus haut13. Euthanasier souris par dislocation cervicale après les lignes directrices internationales.</li>
	<li>Si le culot cellulaire contient RBC, effectuer la lyse des globules rouges avec le tampon de lyse (point 2.1).</li>
	<li>Laver les cellules granule deux fois dans du PBS (2 mL) avec 10 % de BSA et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.</li>
	<li>Recueillir des cellules et aliquote à 1 x 106 cellules par 100 µL de PBS dans des tubes de cytométrie de flux.</li>
</ol>4. coloration
<ol><li>Ajouter vortex et anticorps conjugués (voir point 4.2). Incuber les cellules pendant 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Utilisez le panneau suivant pour primaires humaines ou des échantillons PDX comprenant 10 µL d’anti-CD36-FITC, 5 µL d’anti-CD19-DCE, 5 µL d’anti-CD33-PC5.5, 5 µL d’anti-CD90-APC, 5 µL d’anti-CD34-AA700, 5 µL d’anti-CD45RA-APC-H7, 5 µL d’anti-CD38-Pacific Blue, 5 µL de anti-CD123-PC7 et 2,5 µL d’anti-CD45-KO.</li>
	<li>Ôter les anticorps non liés en lavant les cellules dans 2 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Remettre en suspension cellules dans 450 µL de PBS pour cytométrie final.</li>
</ol>5. gating stratégie pour analyse en cytométrie en flux
<ol><li>Acquisition de données (au moins 500 000 cellules) effectuer un cytomètre en flux équipée avec les lasers rouges, bleues et violettes. Vérifiez les paramètres de cytomètre chaque jour pour un alignement 1) optique, système 2) fluidique, sensibilité 3) optique et 4) normalisation à l’aide de LeukoSure</li>
	<li>Suivre la stratégie de déclenchement séquentielle pour définir l’expression de CD38 (Figure 1).<ol>
<li>Cellules à partir des échantillons de moelle osseuse normale permet de définir des hematogones ou des cellules de plasma qui servira de témoin positif pour l’expression de CD38. Remarque : cette porte est particulièrement importante d’évaluer les populations de LSC putatives ultérieures dépendent de sa définition.</li>
		<li>Définir les cellules précurseurs physiologique (les cellules blastiques normales) selon des critères de population faible CD45dim/SSC (diffusion latérale) (Figure 1 a). Au sein de cette population de blast, définir hematogones, qui affichent une CD38 ++ CD19 + phénotype (Figure 1 b) et enfin, utiliser CD36 et CD33 expression pour définir myeloblasts, monoblastes et érythroblastes (Figure 1). Déterminer CD34 expression sur hematogones comme illustré (Figure 1E). Évaluer plusieurs sous-populations de précurseurs dans les cellules blastiques définis comme P6-P10 (Figure 1). Séparer le compartiment CD34 de cellules blastiques dans P6, P7, P8 sous-populations de géniteur issues de préréglage CD38 gates. Veiller à ce que le compartiment P8 contienne les explosions qui ont la même intensité de CD38 comme le hematogones, que P6 contient des cellules qui sont CD38-basé sur la fluorescence CD38 moins un contrôle (FMO) et que les cellules P7 sont entre ces deux extrêmes en ce qui concerne CD38 expression (Figure 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le CD34 + 38-(P6) cellules fermées, séparer HSC de LSC putatif à l’aide de l’expression CD90 et CD45RA (Figure 1F). Remarque : le phénotype HSC est CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- et les cellules souches multipotentes (MPP) sont définis comme CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Le phénotype putatif de la LSC est CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + et la population en aval plus immature sont les progéniteurs lymphoïdes-amorcé (PPSP) définis comme CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.</li>
</ol>6. MRD suivi par RT-PCR
<ol><li>Surveille les niveaux MRD par RT-PCR comme décrit plus haut14.</li>
</ol>

<ol><li>Shlush, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origins+of+relapse+in+acute+myeloid+leukaemia+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Terwijn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+stem+cell+frequency%3A+a+strong+biomarker+for+clinical+outcome+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia.</a> PLoS One. 9 (9), e107587(2014).</li>
<li>Jordan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interleukin-3+receptor+alpha+chain+is+a+unique+marker+for+human+acute+myelogenous+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells.</a> Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).</li>
<li>van Rhenen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+AML+stem+cell+associated+antigen+CLL-1+aids+in+discrimination+between+normal+and+leukemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells.</a> Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).</li>
<li>Bonardi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+and+transcriptomics+approach+to+identify+leukemic+stem+cell+%28LSC%29+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).</li>
<li>Kikushige, Y., Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TIM-3+as+a+Leukemic+Stem+Cell+Surface+Molecule+in+Primary+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia.</a> Oncology. 89, Suppl 1. 28-32 (2015).</li>
<li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Kersten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45RA%2C+a+specific+marker+for+leukaemia+stem+cell+sub-populations+in+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia.</a> Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).</li>
<li>Goardon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+LMPP-like+and+GMP-like+leukemia+stem+cells+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).</li>
<li>Ng, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+17-gene+stemness+score+for+rapid+determination+of+risk+in+acute+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia.</a> Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Advances+in+the+Measurement+of+Residual+Disease+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia.</a> J Clin Med. 6 (9), (2017).</li>
<li>Swamydas, S., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586(2013).</li>
<li>Gabert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+and+quality+control+studies+of+%27real-time%27+quantitative+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+of+fusion+gene+transcripts+for+residual+disease+detection+in+leukemia+-+a+Europe+Against+Cancer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program.</a> Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une évaluation précise et reproductible de membrane ou de marqueurs cytoplasmiques par cytométrie nécessite que les paramètres de l’instrument sont vérifiés tous les jours pour un alignement optique, bon fonctionnement du systeme fluidique, sensibilité optique et normalisation à l’aide de perles de calibration.
Détection des populations cellulaires blast AML utilisant CD90 et CD45RA par analyse en cytométrie en flux multi paramétrique est une méthode relativement simple et fiable. Une étape cr...

Leucémie myéloïde aiguë (LMA) est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie. Initialement, AML est une maladie clonale de cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. Récemment, clonale hétérogénéité de la population cellulaire blast a été établie essentiellement à l’aide de stratégies de séquençage (NGS) prochaines génération et montrant l’existence d’une évolution intra-clonale de cellules de tumeur1.
L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches leucémiques (LSC). Il est possible que ce compartiment cellulaire dynamique évolue pour surmonter les diverses pressions de sélection imposées pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. C’est pourquoi LSC sont censés être résistante aux traitements chimiothérapeutiques actuels et agir comme médiateur de la rechute de la maladie, avec de profondes implications cliniques2. Différents marqueurs ont été décrites pour caractériser la LSC comme CD1233, CLL-14, CD975 ou TIM-3,6. Le CD34 + CD38-compartiment de cellules blastiques est censé être enrichie pour LSC7 mais inclut également des HSC normal. CD90 et CD45RA expression appliquée à la CD34 + CD38-compartiment (P6) (Figure 1) permet de séparer plusieurs étapes de précurseurs hématopoïétiques normales et malignes8. Plus précisément, normaux CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-CSH, multipotentes progéniteurs (MPP) comme CD90dimCD45RA-cellules CD34 + CD38 et CD34 + CD38-CD90-CD45RA + cellules souches multipotentes lymphoïdes-amorcé (PPSP) peuvent être déterminées dans la plupart des AML cas8 ,,9. L’intensité de la fluorescence moyenne (IFM) de CD38 est particulièrement importante à considérer dans le compartiment de cellules CD34 +. Parce que l’intensité CD38 définit trois nouveaux compartiments cellulaires celle-ci : CD38 négatif (P6), CD38 dim (P7) et CD38 lumineux (P8) (Figure 1). L’IFM de CD38 peut être déterminée à l’aide de hematogones ou plasmocytes comme contrôle positif interne que ces cellules expriment fortement CD38.
Le modèle de sourisnull (NSG) immunodéficientes NOD/SCID/IL2Rγc est employé couramment pour greffe de normal et les cellules hématopoïétiques malignes humaines10,11. Série de xénotransplantation dosages sont utilisés pour valider expérimentalement fonction LSC ou HSC. Ces études ont été longuement analysés par les approches de séquençage à grande échelle. Néanmoins, on connaît moins le LSC et HSC lymphoblastiques de population de blast AML implantée chez des souris NSG par rapport à ses principaux AML (Figure 2).
Les numéros de LSC sont donc intrinsèquement faibles, identification et quantification de LSC sont difficiles et la méthode décrite ici peut être épuisée comme un essai de cytométrie en flux au diagnostic et au suivi clinique pour évaluer la réponse de la chimiothérapie (comme résiduel LSC peut provoquer une récidive AML). La présence de LSC peut indiquer la maladie résiduelle positive (MRD). À ce jour, MRD surveillance principalement dans AML s’appuient sur des méthodes moléculaires (c.-à-d., RT-PCR, NGS)10,12. Toutefois, dans ce protocole nous détectons expression de la protéine simultanée de plusieurs marqueurs HSC/LSC (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par multiparamétriques écoulement cytometry2,8,9. Cette combinaison d’anticorps peut être appliquée dans n’importe quel laboratoire de cytométrie de flux standard et ce dosage MRD de débit est particulièrement intéressant lorsque MRD par PCR en temps réel (RT-PCR) n’est pas possible, c'est-à-diresi spécifique de la leucémie moléculaire marqueurs ne sont pas détectables dans l’échantillon diagnostic d’AML. En outre, le présent protocole, est complémentaire aux techniques plus sensibles MRD moléculaires, puisqu’il vise à détecter et à quantifier les cellules progénitrices hématopoïétiques anormales qui représente une caractéristique fonctionnelle cellulaire (Figure 3).
Nous montrons comment quantifier les trois populations de cellules souches hématopoïétiques et du compartiment de LSC putatif avec le degré de maturation par cytométrie de flux avec des anticorps disponibles dans la plupart des laboratoires cliniques. En outre, nous a confirmé la présence de ces compartiments cellulaires en correspondants patient-dérivés-xénogreffes (PDX) et au traitement suivi.

<table><tbody><tr><td>Pancoll</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges (10x)</td><td>Ozyme</td><td>BLE420301</td><td>solution de lyse des globules rouges A : 8,29 g de NH4Cl + 0,037 g de Na2EDTA dans 100 mL de solution stérile de H2O et de lyse des globules rouges B : 1 g de KHCO3 dans 100 mL de H2O</td></tr><tr><td>NOD/SCID/IL2R&gamma stériles ; cnull&nbsp ; (NSG)&nbsp ; souris</td><td>JACKSON LABORATORY</td><td>N° de commande : 005557</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco par life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer &ndash ; Tampon de séparation MACS</td><td>Tampon MACS Miltenybiotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN IM0766U</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90-APC (clone 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)&nbsp ;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B92396</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD123-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13647</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Set</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63492</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td></td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-14644A</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CST BD</td><td>BD Biosciences</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>FacsFlow&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>336911</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>BLE304006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>BLE103112</td><td></td></tr><tr><td>EasySep kit de sélection PE humain</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&nbsp ; aimant&nbsp ;</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>18551</td><td></td></tr></tbody></table>

cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

La leucémie myéloïde aiguë (AML) est un hétérogène et si ne pas traitée, la maladie mortelle. C’est la cause la plus fréquente de mortalité associée à la leucémie chez l’adulte. Au départ, AML est une maladie des cellules souches hématopoïétiques (CSH) caractérisée par l’arrestation de différenciation, accumulation subséquente de cellules blastiques de leucémie et réduit la production d’éléments hématopoïétiques fonctionnelles. L’hétérogénéité s’étend à la présence de cellules souches de la leucémie (LSC), avec cette cellule dynamique compartiment évoluer pour surmonter les diverses pressions de sélection imposée pendant le traitement et l’évolution de la leucémie. Pour définir plus précisément la population de la LSC, l’ajout de CD90 et CD45RA permet la discrimination de la GPX normales et de cellules souches multipotentes dans le compartiment de cellules CD34 + CD38. Ici, nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée de plusieurs marqueurs LSC putatifs (CD34, CD38, CD45RA CD90) sur primaire les cellules blastiques AML humaine par cytométrie en flux multiparamétrique. De plus, nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes. Cette méthode de détection et de quantification de LSC putatif sont utilisables pour suivi clinique de la réponse de la chimiothérapie (i.e., maladie résiduelle), comme le LSC résiduelle peut provoquer une récidive AML.

Nous présentons ici une méthode pour déterminer les populations de souches dans des échantillons de la moelle osseuse humaine normaux et malins. Nous prélevé un PDX réussie de la moelle osseuse et la rate et cytométrie multiparamétriques comme décrit ci-dessus. Nous avons comparé plusieurs sous-populations de cellules blastiques entre le sérum du patient diagnostique et le PDX correspondante et en particulier, le compartiment de CD34 + CD38-géniteur, notamment enrichis en LSC putatif. Nous avons trouvé que la fraction de...

Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

L’objectif global de cette procédure est d’estimer les cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë et dans les xénogreffes dérivées du patient par cytométrie en flux lors du diagnostic et du suivi du traitement. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de l’hématologie/oncologie, telles que la pertinence clinique de l’évaluation quantitative des cellules souches de leucémie par cytométrie en flux dans la leucémie myéloïde aiguë. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est applicable à la plupart des laboratoires d’hématologie/oncologie avec des anticorps couramment utilisés.Cette procédure sera démontrée par Thomas, post-doc, Fanny, étudiante diplômée, et Adeline, ingénieure de mon laboratoire. Pour commencer, prélevez deux millilitres de moelle osseuse à partir d’une LAM de novo dans des tubes contenant 1,8 milligramme par millilitre d’EDTA, un anticoagulant. Isolez les cellules mononucléées des globules rouges et des granulocytes en diluant d’abord la moelle osseuse dans trois volumes de PBS.Ensuite, superposez soigneusement un volume de ficol avec un volume de moelle osseuse diluée. Faites tourner le gradient de densité à 300 g pendant 30 minutes sans pause. Ensuite, transférez la couche de couche blanche de cellules mononucléées dans un nouveau tube stérile.Pour éliminer les surnageants contaminant les composants sériques, ajoutez 10 millilitres de PBS et centrifugez les cellules à 300 g pendant cinq minutes avant de répéter le lavage. Lysez les globules rouges en ajoutant deux millilitres de tampon de lyse à la cuiller cellulaire et vortex doucement. Ensuite, incubez les cellules à température ambiante pendant cinq minutes.Centrifugez les cellules à 300 g pendant cinq minutes et retirez le surnageant. Ensuite, utilisez du PBS pour laver les cellules. Après avoir isolé les cellules blastiques de la moelle osseuse conformément au protocole textuel, sous une hotte à flux laminaire, insérez une souris NSG non conditionnée dans un dispositif de contention et injectez cinq fois 10 à la sixième cellule blastique AML dans la veine de la queue.Remettez la souris dans une cage individuelle ventilée dans des conditions conventionnelles et exemptes d’agents pathogènes spécifiques. Toutes les deux semaines, utilisez une méthode de prélèvement sous-mandibulaire avec un capillaire d’hématocrite pour prélever 60 microlitres de sang. Transférez le capillaire dans un tube de cinq millilitres puis, à l’aide d’un tampon de gaze stérile, appliquez une légère pression pour arrêter le saignement.Ajoutez un millilitre de tampon de lyse dans le tube et tourbillonnez doucement. Ensuite, incubez les cellules à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugez les cellules à 300 g pendant cinq minutes.Ensuite, après avoir retiré le surnageant, ajoutez 100 microlitres de PBS avec 10 % de BSA, trois microlitres de CD45 FITC anti-humain, incubez pendant 30 minutes. Ensuite, lavez la pastille cellulaire deux fois dans du PBS, deux millilitres, avec 10 % BSA et centrifugez-la à 300g pendant cinq minutes. Toutes les deux semaines, utilisez la cytométrie en flux pour analyser la greffe par analyse chimériste de l’expression humaine par rapport à la souris CD45.Lorsque le nombre de blastes est supérieur à 70 % ou que des signes cliniques graves de maladie sont observés, sacrifiez l’animal et prélevez des cellules blastiques mononucléaires d’une rate écrasée et de la moelle osseuse en utilisant le PBS pour rincer les tibias et les fémurs, comme décrit précédemment. Pour effectuer une coloration par panneau, combinez des anticorps conjugués avec des échantillons de xénogreffe primaire humaine ou dérivée du patient, ou des échantillons PDX, et vortex les tubes. Ensuite, incubez les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 à 30 minutes.Éliminez les anticorps non liés en utilisant deux millilitres de PBS pour laver les cellules. Remettre les cellules en suspension dans 450 microlitres de PBS, puis procéder à l’analyse par cytométrie en flux et au suivi MRM. Pour évaluer avec précision et reproductibilité la membrane des marqueurs cytoplasmiques par cytométrie en flux, vérifiez l’alignement optique.Le bon réglage du système 3D, la sensibilité optique et la stomatisation à l’aide de l’étalonnage de la stomazine battent tous les jours. Utilisez de la moelle osseuse normale pour régler les portes pour CD38. Un minimum de 500 000 événements est requis et il est vérifié que chaque exécution d’écoulement est régulière et homogène.De plus, les doublets, ainsi que les cellules mortes et les débris cellulaires sont éliminés. Les cellules hématopoïétiques immatures sont définies par le fait qu’elles sont CD45 intermédiaires, SSC faibles. Et le contrôle positif CD38 ou hématogones, sont CD19/CD38 double positif.Ensuite, P8 ou CD38 positif, P7 ou CD38 intermédiaire et P6 ou CD38 négatif sont définis. Les cellules P6 peuvent être subdivisées en HSC, MPP et LSC. Comme il s’agit d’une moelle osseuse normale, elle est LSC négative.À l’aide de la cytométrie en flux multiparamétrique, il a été constaté que la fraction blastique CD34 positive et CD38 négative était plus élevée dans la PDX par rapport à l’échantillon de patient diagnostiqué. Il est intéressant de noter qu’un pourcentage plus élevé de CSL présumée a été trouvé dans le PDX par rapport à l’échantillon primaire du patient, ce qui suggère un enrichissement possible des cellules progénitrices malignes dans les tissus hématologiques dans ce modèle murin. En comparant les populations de progéniteurs blastiques dans deux échantillons de patients différents, la fraction CD34 positive et CD38 négative est passée de 0,06 % au moment du diagnostic à 3,33 % lors du premier suivi de traitement chez le premier patient.En revanche, la fraction CD34 positive et CD38 négative a diminué chez le deuxième patient, passant de 7,8 % au moment du diagnostic à 2,27 % lors du premier suivi du traitement. En conséquence, la fraction présumée de LSC a augmenté chez le premier patient de 0 % au diagnostic à 0,65 % et a diminué chez le deuxième patient de 6,57 % au moment du diagnostic à 1,44 % lors du suivi du traitement. La surveillance minimale de la maladie résiduelle ou de la MRM, en utilisant comme marqueurs moléculaires la mutation NPM1 chez le premier patient et la fusion du gène CBF-bêta MYH11 pour le deuxième patient, a montré que la MRM moléculaire diminuait moins chez le premier patient que chez le deuxième patient pour le premier point de suivi du traitement.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement. Pendant que vous tentez cette procédure, il est important de vérifier les paramètres de cytométrie en flux et la jauge de CD38. À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires peuvent être effectuées, comme le tri des cellules par cytométrie en flux, afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’évaluation fonctionnelle des cellules souches de leucémie.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter et de quantifier les cellules souches de leucémie dans des échantillons de patients dans des xénogreffes dérivées de patients. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de patients peut être dangereux et que des précautions telles que les directives GOP et les procédures de sécurité institutionnelles doivent toujours être prises pendant que vous effectuez cette procédure.

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Détection de la maladie résiduelle minime ou mesurable (MRD) est un biomarqueur pronostique important pour affiner l’évaluation des risques et de prédire les rechutes dans la leucémie myéloïde aiguë (AML). Ces lignes directrices exhaustives et recommandations avec les meilleures pratiques d’identification cohérente et précise et de détection du MRD, peut aider à prendre des décisions de traitement efficaces AML.

Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

Les auteurs décrivent l’utilisation de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour évaluer le potentiel maligne de cellules hématopoïétiques génétiquement. TCSH est utile pour évaluer les diverses cellules hématopoïétiques malignes in vivo comme générant une grande cohorte de souris atteintes de leucémie ou de syndromes myélodysplasiques (SMD) afin d’évaluer de nouveaux traitements.

Utilisation de la greffe de cellules souches hématopoïétiques pour évaluer l’origine du Syndrome myélodysplasique

Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d'oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d'un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.

Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë

Ici, une méthode basée sur la cytométrie phosphoflow est décrite pour analyser la signalisation en aval des voies mTORC1, JAK/STAT5 et MAPK dans des cellules de leucémie myéloïde humaine aiguë xénogreffées chez la souris et obtenues à partir d’aspirations de moelle osseuse. Les niveaux de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 et p-ERK1/2 sont mesurés simultanément à l’aide d’un cytomètre en flux spectral de nouvelle génération à haute sensibilité.

Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

Ce protocole décrit la xénogreffe in ovo de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) B et T dérivées de patients, qui se produit 4 jours après l’injection.

À Ovo Xénogreffe de cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) dérivées de patients (PDX-LAL)

Le protocole vise à décrire un modèle murin permettant de générer des rechutes de leucémie lymphoblastique aiguë, en se basant sur la dynamique de la réponse à la chimiothérapie d’induction.

Modèle murin de rechute de la leucémie à la chimiothérapie d’induction pour la leucémie lymphoblastique aiguë

Ce protocole décrit l’utilisation d’élutriation centrifuge pour séparer les cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en phases de cycle de cellules différentes.

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

Apprenez à quantifier les cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë par cytométrie en flux. Cette méthode applicable en laboratoire clinique permet le diagnostic et le suivi thérapeutique.

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut (Vidéo) | JoVE Journal

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

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