Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

L’objectif global de cette procédure est de réussir une micro-injection dans des embryons de nasonia vitripennis afin de faciliter la manipulation génomique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à la biologie de nasonia vitripennis, telles que la production de venin et la détermination du sexe. Le principal avantage de l’utilisation de cette technique est qu’elle permet une manipulation directe dans le génome de la guêpe et offre une grande variété de modifications génomiques avancées.

La démonstration de la procédure sera faite par Ming Li, un post-doctorant de notre laboratoire. Pour commencer, mettez en place plusieurs colonies de N. vitripennis en plaçant de 200 à 500 adultes avec un rapport de trois femelles pour un mâle dans des cages de dortoir d’insectes. Maintenez les guêpes à plus ou moins un degré Celsius avec 30 % d’humidité relative et un cycle lumière/obscurité de 12 à 12

Pendant deux jours, laissez les femelles accouplées se nourrir de pupes fraîches de S. bullata, ainsi que de petites gouttelettes d’une à dix volumes d’une solution d’eau de saccharose volume à volume. Pendant les deux jours suivants, retirez les pupes de mouches à viande pour priver les guêpes femelles d’un site de ponte, ce qui les rend très gravides. Pour conserver la fraîcheur des hôtes des pupes de S. bullota, conservez-les à 4 degrés Celsius immédiatement après les avoir obtenues, et ne les retirez qu’au besoin.

Faites la différence entre les jeunes hôtes qui ont un pupadium de couleur rouge et les hôtes plus âgés qui ont un pupadium de couleur plus foncée. Laissez les guêpes femelles se parasiter dans le jeune hôte en plaçant des pupes fraîches de S. bullata dans un bouchon en mousse avec un trou de la taille d’une pupe découpé au centre. Pour une concentration maximale de parasitation et une collecte plus facile des embryons, n’exposez qu’environ 0,2 centimètre de l’extrémité antérieure de l’hôte, qui est arrondie, par rapport à l’extrémité postérieure, qui est plus épaisse et contient une ouverture en forme de cratère.

Placez les pupes hôtes dans cet arrangement dans la cage et attendez environ 45 minutes pour permettre aux guêpes de les parasiter. Éliminez les hôtes parasités en les récupérant à la main et en tapotant ou en soufflant doucement pour enlever les guêpes résiduelles. Remplacez-les par des hôtes frais environ toutes les 15 minutes pour continuer à recueillir les œufs à un stade précoce pendant les injections.

À l’aide d’un microscope à dissection, à l’aide d’une pince, retirez soigneusement l’extrémité postérieure du puparium externe d’un hôte fraîchement parasité afin d’exposer les œufs de N. vitripennis. Ensuite, préparez une lame d’alignement d’embryon en utilisant un adhésif liquide pour coller une lamelle de couverture sur une lame de verre propre. À l’aide d’un pinceau humide à pointe fine, brossez soigneusement les embryons de l’hôte, en veillant à ne pas endommager la peau douce et nymphale de l’hôte.

Ensuite, à l’aide du pinceau humide, transférez environ 20 embryons un par un sur la lame, immédiatement adjacente au côté de la lamelle. Orientez l’extrémité antérieure de l’embryon contre le bord de la lame de couverture, de sorte que les extrémités postérieures de l’embryon soient pointées dans la même direction. Cela permettra une plus grande précision d’injection dans la même position parmi tous les embryons.

Après avoir tiré les aiguilles d’injection conformément au protocole de texte, biseautez la pointe de l’aiguille en touchant légèrement la pointe à une plaque abrasive diamantée à 25 degrés Celsius pendant environ 10 secondes. Préparez le mélange d’injection composé de réactifs de modification du génome et conservez-le sur de la glace. À l’aide d’une pointe de microchargeur, chargez l’aiguille d’injection avec deux microlitres de mélange d’injection.

Ensuite, placez la lame de verre avec les embryons tapissés sur la platine d’un microscope composé. Insérez soigneusement l’aiguille dans l’extrémité postérieure de l’embryon avec un angle vertical de 25 à 35 degrés. Ensuite, injectez un à cinq picolitres de mélange d’injection et assurez-vous que l’embyro gonfle légèrement avec l’injection.

En cas de colmatage, essayez de biseauter à nouveau les aiguilles. Le cytoplasme des embryons de N. vitripennis est anormalement visqueux et collant, ce qui entraîne un colmatage fréquent des aiguilles. Injectez environ 20 à 40 œufs à la fois, puis arrêtez.

Transférez les œufs injectés avec un pinceau humide en touchant légèrement les œufs injectés et placez-les dans un hôte. Ensuite, continuez l’injection en utilisant un lot d’œufs frais et fraîchement pondus. Idéalement, cette étape est plus efficace lorsqu’une personne collecte et aligne des ovules, tandis qu’une autre personne injecte des composants de modification du génome et transplante des embryons injectés dans des pupes hôtes.

Après la micro-injection, à l’aide d’un pinceau humide, placez soigneusement jusqu’à 40 embryons G zéro injectés, un à la fois, sur une chrysalide de S. bullata précédemment piquée. Placez les pupes hôtes dans une boîte de Pétri avec du papier filtre humide et des boules de coton et incubez-les à 25 degrés Celsius avec environ 70 % d’humidité jusqu’à ce que les embryons injectés éclosent dans environ un à deux jours. Il est important de noter que les hôtes peuvent se retrouver avec un pubarium pelé, et les œufs de N. vitripennis se développeront normalement, à condition qu’ils soient incubés dans une chambre humidifiée pour éviter la dessiccation.

Après l’éclosion des embryons G zéro, transférez les pupes hôtes dans une nouvelle boîte de Pétri et incuberez-les à 25 degrés Celsius et 70 % d’humidité. Surveillez quotidiennement les pupes de l’hôte et les larves de G zéro injectées. Si les pupes de l’hôte ont une odeur nauséabonde, transférez les larves injectées dans de nouvelles pupes hôtes saines.

Pour une pénétration efficace de l’aiguille et une micro-injection dans les embryons de N. vitripennis, différents extracteurs de micropipettes ont été testés avec plusieurs types d’aiguilles en verre capillaire avec des filaments, y compris le quartz, l’aluminosilicate et le borosilicate, afin d’avoir une longue pointe de type hypodermique souhaitée, efficace pour la micro-injection d’embryons de N. vitripennis. Les composants de modification du génome utilisés ici étaient des ARN guides mixtes et la protéine cas9 pour une édition du génome médiée par plus de netteté. Dans cette expérience, un ARNsg ciblant le gène du cinabre a été injecté à des quantités variables, avec la protéine cas9, dans N. vitripennis.

Ce tableau montre que les taux de survie dépendaient de la dose, car une concentration accrue d’ARNsg et de protéine cas9 a entraîné une diminution des taux de survie. Lors de cette procédure, il est important de veiller à ne pas perforer ou dessécher les embryons de guêpes lors de la manipulation ou du transfert en utilisant soigneusement un pinceau à pointe fine humidifié ou un pic à embryons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de récupérer, de micro-injecter et de transplanter efficacement des embryons de guêpes afin d’effectuer avec succès des modifications génomiques avancées.