Name: Visualisation des Modules corticales dans cortex mammifère aplatie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez la technique d'aplatissement et de coloration du cortex mammalien pour visualiser les modules cellulaires corticaux par couche. Cette méthode permet d'étudier l'architecture cérébrale et ses variations évolutives chez différentes espèces.

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Ce travail a été soutenu par Humboldt Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, le Centre allemand pour les maladies neurodégénératives (DZNE), le ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure et la Gottfried Wilhelm Leibniz prize de la DFG. Nous remercions Shimpei Ishiyama d’excellent graphisme et Juliane Diederichs excellente assistance technique.

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Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.

Modularité dans le cortex cérébral a été identifiée à l’aide d’une variété de techniques. Les premiers modules corticale études généralement identifiés en soit visualisant cellulaires denses régions, ou l’absence de fibres1. Les méthodes suivantes ont utilisé la présence de faisceaux dendritiques24, afférences d’une région donnée25ou enrichissement des neurotransmetteurs26. Nous démontrons ici deux techniques, cytochrome oxyda...

Certains des changements plus importants dans la structure du cerveau dans la phylogénie peuvent être observée dans le cortex cérébral. Malgré les différences significatives, le cortex des animaux suit un modèle commun et peut être largement divisé de deux manières distinctes, par couches et domaines1. Les couches corticales se positionner parallèles à la surface du cerveau et varient en nombre de 3 couches en cortex Reptilien2 à 6 couches de mammifère cortex1. Aires corticales sont quant à eux des régions distinctes du cortex qui correspondent en grande partie aux fonctionnalités distinctes, par exemple, le cortex somatosensoriel est impliqué dans la sensation de toucher ou le cortex visuel dans le traitement des entrées visuelles. Ces aires corticales peuvent souvent être subdivisés en3modules ou correctifs, qui répètent régulièrement les structures anatomiques, trouves essentiellement parallèles à la surface pial du cerveau. Modules corticales peuvent être limités à un calque particulier4ou étendent à travers plusieurs couches5.
Méthodes standard de sectionnement du cerveau impliquent sections perpendiculaires à la surface du cerveau, comme coronale ou sagittal. Alors que ces méthodes peuvent être utilisées pour visualiser les modules corticales, une multitude de fonctionnalités intéressantes peut être révélée lorsque les modules corticales sont visualisées tangentiellement, dans un plan parallèle à la surface du cerveau. Par exemple, modules somatosensoriels dans le cerveau de rongeur qui représentent les moustaches, apparaissent comme des barils quand visualisé perpendiculairement à la surface du cerveau, et donc les régions tirent le cortex de baril de nom. Cependant, sur la visualisation des barriques dans une orientation tangentielle, ils révèlent une moustache-carte, avec les barils étant disposées dans une orientation topographique la disposition exacte des moustaches à la surface externe de la mise en miroir. Dans certains cas, arrangement modulaire a même échappé de détection pendant une longue période, lorsque visualisé de manière non-tangentielle. Le cortex entorhinal médial, est connu pour la présence de cellules de la grille, les neurones qui se déclenchent selon un arrangement hexagonal régulier lorsqu’un animal parcourt un environnement. Même si c’est une zone fortement étudiée, jusqu'à récemment, la présence de plaques ou de modules de cellules dans le cortex entorhinal médial, qui sont physiquement disposées dans un arrangement hexagonal6, avait échappé à détection. La présence et l’arrangement de ces modules, dans le cerveau de rat, a été facilitée par des sections tangentielles du cortex entorhinal médial et étudie la cytoarchitecture de manière layer-wise.
À la suite de sectionnement, l’aspect particulier de la visualisation des modules corticales aussi peut être réalisé que de multiples façons. Classiquement, des études ont délimité des modules basés sur des cellules densité ou fibre mise en page1. Une autre méthode populaire est l’utilisation de la cytochrome oxydase histochimie, qui révèle des zones d’activité supérieur8. Des approches plus récentes incluent regardant des types de cellules génétiquement déterminée, distinguées sur la base de leur protéine expression profils6,8.
Dans cette étude, nous mettons en évidence les méthodes pour isoler le cortex du cerveau chez les mammifères, obtenir des sections tangentielles aplaties et visualiser les corticales modules basés sur la cytochrome oxydase histochimie et immunohistochimie de protéines spécifiques de type cellulaire.

<table><tbody><tr><td><Coloration à >la cytochrome oxydase forte</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c du cœur équin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>3,3'Diaminobenzidine tétrachlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium nickel(II) hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1827</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Antigen retrieval</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tampon phosphate/Phosphate salin/préfixe/PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate disodique dihydraté</td><td>Carl Roth</td><td>4984.3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>TRITON-X 100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Immunohistochimie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k puriefié à partir d’intestin de poulet, Souris monoclonale</td><td>Swant</td><td>RRID : AB_10000347</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin D-28k à partir de calbindine de rat recombinant D-28k, Rabbit polyclonal</td><td>Swant</td><td>RRID : AB_10000340</td><td></td></tr><tr><td>Albumine Fraction V, sans biotine</td><td>Carl Roth</td><td>0163.4</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supports de montage ou de congélation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (immunofluorescence)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt ( histochimie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03989</td><td></td></tr><tr><td>Médium de congélation de tissus</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0696746</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Déshydratation de l’alcool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 100 %</td><td>Carl Roth</td><td>9065.3</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 96 %</td><td>Carl Roth</td><td>P075.3</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752.4</td><td></td></tr><tr><td>Substitut de xylène</td><td>Fluka</td><td>78475</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Appareils/outils</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 650V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jung RM2035</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps - Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip Fine</td><td>Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Pince #5SF Dumont - Inox Super Fine Tip Fine Science</td><td>Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Cisailles à os - 24 cm</td><td>Outils de science fine</td><td>16150-24</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux émoussés</td><td>Outils de science fine</td><td>14000-18</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux - Grandes boucles</td><td>Outils de science fine</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux - Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris fins</td><td>Outils de science fine</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des modules corticales dans cortex mammifère aplatie

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

Le cortex du cerveau chez les mammifères est parcellated en sous-structures distinctes ou modules. Corticales modules généralement se positionner parallèles à la fiche corticale et peuvent être délimités par certaines méthodes histochimiques et immunohistochimiques. Dans cette étude, nous mettons en évidence une méthode pour isoler le cortex du cerveau chez les mammifères et aplatir pour obtenir parallèle de sections à la fiche corticale. Nous avons en outre point culminant choisi histochimiques et méthodes immunohistochimiques pour traiter ces aplati sections tangentielles pour visualiser les modules corticales. Dans le cortex somatosensoriel de divers mammifères, nous effectuons l’histochimie cytochrome oxydase pour révéler des cartes de corps ou corticales modules représentant les différentes parties du corps de l’animal. Dans le cortex entorhinal médial, une zone où les cellules de la grille sont générés, nous utilisons des méthodes immunohistochimiques pour mettre en évidence des modules de neurones génétiquement déterminés qui sont disposées en forme de grille dans la fiche corticale chez plusieurs espèces. Dans l’ensemble, nous fournissons un cadre pour isoler et préparer schichtweisen aplati sections corticales et visualiser les modules corticales en utilisant histochimiques et méthodes immunohistochimiques dans une grande variété de mammifères cerveaux.

Nous avons obtenu aplaties sections corticales du cortex somatosensoriel dans une variété de cerveaux et eux pour histochimie cytochrome oxydase de visualiser les modules somatotopique représentant les différentes parties du corps traitées. Cette approche comparative permet d’étudier les forces évolutives que cortex de la forme, par exemple, indiquer la répartition hautement conservée des vibrissae mystacial chez les rongeurs et lagomorpha barils21 (<stron...

Cet article décrit une méthodologie détaillée pour obtenir aplaties sections tangentielles des cortex mammifère et visualiser les modules corticales en utilisant histochimiques et méthodes immunohistochimiques.

Visualisation des Modules corticales dans cortex mammifère aplatie

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

L’objectif global de cette procédure d’aplatissement et de coloration du cortex est de visualiser les modules cellulaires dans les régions corticales de manière couche. Cette méthode peut répondre à des questions clés en neurosciences, comme la façon dont la structure corticale se propage dans le cerveau et comment elle pourrait être liée à la fonction. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez comparer l’architecture corticale de manière laminaire et comparer divers aspects de celle-ci, comme la façon dont elle a conservé l’évolution de la classe ou comment elle varie en fonction.Simon Lauer et Undine Schneeweib, étudiante et technicienne du laboratoire de la professeure Michelle Black, feront la démonstration de la technique. Pour commencer, perfuser l’animal par voie transcardiale afin d’obtenir un cerveau fixé de manière homogène et exempt de sang. Après avoir retiré le cerveau, immergez-le dans un tampon de phosphate de 0,1 molaire.Si des sections avec de grandes zones corticales sont souhaitées, aplatissez le cerveau avant de poursuivre la postfixation. Cependant, pour obtenir des sections de zones plus difficiles à atteindre, comme le cortex entorhinal médial, postfixez le cerveau dans 4 % PFA pendant 24 heures avant de l’aplatir. Préparez-vous à garder le cerveau humide avec un tampon pendant toute la dissection.Pour commencer, séparez les hémisphères à l’aide d’un scalpel. Si le cerveau n’a pas été postfixé, soyez prudent lorsque vous le manipulez. Ensuite, tout en sécurisant le cerveau par le cervelet, insérez doucement la spatule pour ouvrir un plan de dissection dans le corps calleux.La pointe ronde de la spatule doit pointer à l’opposé du cortex. Ensuite, manipulez la spatule pour diviser le thalamus et le cortex. Ensuite, séparez les structures sous-corticales à l’aide d’une lame de rasoir.Ensuite, séparez les structures sous-corticales à l’aide d’un scalpel ou du bord de la spatule. Pour améliorer l’aplatissement, faites une coupe nette à travers le striatum, le noyau accumbens et le cortex frontal orbitaire, car ils augmentent l’épaisseur du cortex dans la région latérale. Ajoutez ensuite une coupe de soulagement à la base de la région interne du cortex préfrontal.Cela permettra le déploiement des parties médianes du cortex. Maintenant, placez un cortex hémisphérique sur une lame de verre. Ensuite, placez deux cylindres d’argile de chaque côté du tissu.L’argile doit être de 10 à 20 % plus mince que le tissu cérébral, car l’argile définit l’étendue de l’aplatissement. Ensuite, placez un côté en verre tangentiellement sur le cortex, en contactant d’abord la partie latérale. Ensuite, placez un poids sur le verre, avec la masse centrée sur la partie latérale.Maintenant, laissez l’ensemble reposer pendant trois à cinq heures dans un tampon de phosphate à quatre degrés Celsius. La vraie clé de cette préparation est d’aplatir le cerveau autant que possible, car cela a le plus grand impact sur la visualisation de la carte corticale. Enfin, si nécessaire, postfixez le cerveau.Transférez l’hémisphère aplati à 1 % de PFA, ou à 2 % de PFA s’il n’a pas été prélevé sur un animal perfusé. Ensuite, laissez-le fixer pendant 24 heures à 4 degrés Celsius, avec une légère agitation. Tout d’abord, lavez l’hémisphère aplati dans un tampon de phosphate pendant 15 minutes.Ensuite, coupez l’hémisphère tangentiellement sur un Vibratome. Fixez le tissu en position à l’aide d’un petit volume de cyanoacrylate et d’une légère pression. Soyez prudent, car trop de colle peut entraîner la découpe d’artefacts.Maintenant, coupez l’hémisphère de l’extrémité la plus épaisse et la plus stable vers l’extrémité la plus mince à l’épaisseur requise. Si de faibles concentrations fixatrices ont été utilisées, coupez le tissu lentement avec une amplitude élevée. Ensuite, lavez le tissu sectionné dans un tampon hepes pendant 15 minutes en agitant doucement.Pendant le lavage, préparez une solution fraîche de coloration à la cytochrome oxydase. Et ajoutez le composant DAB juste avant de l’utiliser. Maintenant, incubez les sections dans la solution de coloration fraîchement préparée à température ambiante avec un agitateur et surveillez.Selon la quantité de fixation, la coloration peut être observable en 10 minutes ou prendre plusieurs heures. Si la réaction est trop lente, augmentez la température à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction, transférez les sections dans un bain à 4 % de PFA et laissez-les incuber pendant 15 minutes en agitant doucement.Ensuite, lavez les sections trois fois, avec un tampon hepes pendant 10 minutes par lavage. Maintenant, montez et séchez les sections sur des lames de verre. Et déshydratez-les à l’aide de bains d’éthanol de plus en plus forts.Ensuite, lavez les lames avec de l’isopropanol pendant cinq minutes, puis du xylène pendant cinq minutes. Après le bain de xylène, ajoutez immédiatement un produit de montage à durcissement rapide, non à base d’eau. Les médiums à base d’eau dégraderont la tache.Après avoir ajouté une lamelle, conservez les lames à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient imagées. Des coupes corticales du cortex somatosensoriel dans une variété de cerveaux ont été traitées en utilisant les procédures décrites. Cette approche comparative permet d’étudier les forces évolutives qui façonnent le cortex, telles que la représentation très conservée du vibrisse mistacial chez les rongeurs et des lagomorphes sous forme de tonneaux.L’architecture du cortex entorhinal médian a été observée en sections parallèles à la surface de la peau, en utilisant une section tangentielle du cortex entorhinal médical chez des souris, des rats et des chauves-souris frugivores égyptiennes. De plus, les cerveaux humains ont été traités à l’aide d’un aplatissement doux du cortex et de tranches tangentielles. Tous les cerveaux ont été cryoconservés et sectionnés sur un cryostat à 60 microns.L’immunocoloration a été utilisée pour marquer les modules de cellules paraméales positifs à la calbindine. Dans le cortex entorhinal, les modules de calbindine présentent une périodicité remarquable chez chaque espèce et ne varient en taille que d’un facteur 10, sur une variation de 20 000 fois de la taille du cerveau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des sections tangentielles pour l’analyse.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’aplatir correctement le cerveau, au lieu de la taille, de la qualité ou des résultats finaux. N’oubliez pas que travailler avec des agents tels que le PFA et le DAB peut être extrêmement dangereux, et vous devez toujours porter des vêtements de protection et travailler sous la lumière du terrain.

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