Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

L’objectif global de cette procédure est de démontrer un moyen réalisable d’obtenir des cellules d’épithélium pigmentaire rétinien à partir d’yeux de souris, et de les cultiver in vitro tout en conservant leurs propriétés d’origine. Cette méthode aidera les chercheurs de l’EPR à acquérir les compétences de dissection nécessaires à l’établissement de cultures de cellules EPR de souris, et à démontrer comment le faire facilement. Le principal avantage de cette procédure est qu’elle est simple et réalisable.

La seule chose requise est la pratique, et la démonstration visuelle de l’isolation RPE et de la microscopie démontre littéralement comment obtenir les compétences requises. Pour isoler les globes oculaires de la souris, euthanasiez d’abord deux souris en utilisant n’importe quelle méthode approuvée et, avec des gants, placez-les sur un tampon absorbant. Placez le pouce et l’index autour de l’œil et poussez doucement la peau pour faire sortir le globe oculaire.

Une fois que le globe oculaire est saillant, rentrez la pointe d’une paire de ciseaux inclinés entre la peau et le globe oculaire et coupez soigneusement le tissu autour de l’œil jusqu’à ce qu’il soit libéré. Ensuite, trempez brièvement l’œil isolé dans l’éthanol à 70 % et immergez-le dans du PBS dans une boîte de Pétri. Après avoir prélevé les deux yeux de chacune des souris, procédez à la dissection.

Sous le microscope à dissection, retirez soigneusement la majorité du tissu conjonctif autour de l’œil. Il n’est pas nécessaire de garder l’œil immergé pendant cette étape. Pour ce faire, utilisez une pince à suture pour soulever les tissus conjonctifs du globe oculaire et coupez-les à l’aide de ciseaux Vannas.

Ne coupez pas la sclérotique car il est pratiquement impossible d’obtenir les œilletons postérieurs intacts si la sclérotique est coupée. Après avoir nettoyé le tissu conjonctif, immergez les globes oculaires dans du PBS et passez au travail dans une armoire à flux laminaire dans des conditions stériles. Maintenant, utilisez des pinces pour transférer les yeux dans un plat de DMEM chaud contenant une forte concentration de glucose.

Après 20 à 30 secondes, remplacez la solution de lavage par aspiration pour un deuxième lavage. Transférez les globes oculaires dans la solution de travail réchauffée à 2 % de Dispase II dans des tubes de 15 ml et laissez les yeux incuber à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes pour se dissocier. Après l’incubation, les globes oculaires doivent être mous.

Ensuite, lavez les yeux deux fois dans le même récipient avec un milieu de croissance réchauffé. Après le deuxième lavage, remplacez le milieu de croissance par un milieu frais et transférez les globes oculaires et le milieu dans un nouveau plat pour continuer la dissection. Continuez à travailler sur une paillasse propre à l’aide d’un microscope de dissection.

Commencez la dissection en fixant l’œil avec une pince et faites une incision autour de l’ora serrata à l’aide de ciseaux Vannas. En gardant le globe oculaire dans la solution, retirez soigneusement la cornée antérieure en étendant la coupe autour de la circonférence de l’ora serrata. Une fois la coupe terminée, retirez la cornée antérieure.

Ensuite, retirez la capsule du cristallin et l’épithélium pigmenté de l’iris associé en le retirant doucement de l’œilleton à l’aide d’une pince dentée. Ensuite, répétez la dissection sur les yeux restants et incubez les œilletons postérieurs dans un milieu de croissance pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour faciliter la séparation de la rétine neurale de l’EPR. Au bout de 20 minutes, coupez les œilletons postérieurs en quatre pétales.

Faites les coupes assez longues pour aplatir l’œilleton, mais assez courtes pour garder les pétales connectés. Ensuite, aplatissez l’œilleton pour retirer la rétine neurale. Fixez le complexe de sclérotique choroïde RPE restant avec la main non dominante et tirez très doucement sur la rétine des bords.

Une fois la rétine neurale retirée, transférez le complexe de la sclérotique choroïde RPE en quartiers dans une nouvelle boîte de culture stérile remplie de milieu de croissance chaud. Dans la boîte de Pétri, fixez un pétale du complexe de la sclérotique choroïde RPE en quartiers avec des pinces super fines et, à l’aide d’un couteau en croissant microchirurgical, décollez doucement les feuilles intactes d’EPR de la membrane basale sous-jacente. L’EPR brunâtre doit être clairement distinguée de la choroïde sombre, collante et duveteuse.

Ensuite, mouillez une pointe de micropipette p200 avec du milieu de croissance et utilisez la pointe pour transférer les feuilles d’EPR dans la nouvelle boîte contenant du milieu de croissance chauffé. Maintenant, lavez les feuilles RPE trois fois dans un milieu de croissance réchauffé. Après chaque étape de lavage, récupérez soigneusement les feuilles RPE tout en évitant les autres tissus, tels que les débris de la rétine ou de la choroïde.

Après le dernier lavage, transférez les feuilles d’EPR dans un tube de 1,5 mL et laissez-les sédimenter par gravité. Ensuite, dans l’armoire à flux laminaire, retirez le milieu de croissance supplémentaire et remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance chaud fraîchement préparé. Maintenant, triturez doucement le tissu à l’aide d’une micropipette p200 sans faire de bulles.

Triturez entre 40 et 50 fois, juste assez pour fabriquer une suspension unicellulaire. Soyez prudent car trop de trituration peut être mortelle. Maintenant, mettez en plaque les cellules EPR recueillies sur les deux souris dans un insert de membrane en polyester de 12 ml dans le puits d’une plaque de culture de 12 puits.

Une densité cellulaire élevée est souhaitée afin que les cellules EPR conservent leur forme hexagonale et leur pigmentation. Une culture primaire d’EPR de souris établie à partir de deux souris dans un insert de membrane en polyester de 12 mm a atteint une confluence de 90 à 95 % après une semaine de culture. Après deux semaines de culture, les cellules étaient confluentes à 100 % et ont commencé à former une mosaïque de cellules hexagonales pigmentées et binucléées.

À la troisième semaine, les cellules ont continué à changer de forme et de pigmentation. Cependant, après quatre semaines, une partie des cellules est devenue hyperpigmentée. La pureté de la culture cellulaire primaire de l’EPR a été évaluée à l’aide de l’anticorps RPE65, qui marque la rétinoïde isomérohydrolase, une enzyme essentielle au cycle visuel des vertébrés.

L’intégrité des jonctions cellulaires et de la forme hexagonale de la cellule a été démontrée par coloration à la phalloïdine. Les jonctions serrées ont été visualisées par l’analyse de l’expression de la protéine ZO-1, qui a pu être visualisée à l’aide d’une coloration aminée et validée par western blot. Dans l’ensemble, les cultures sont capables de proliférer, de conserver la pigmentation et leur forme hexagonale tout en formant des jonctions serrées et en exprimant des marqueurs fonctionnels, tels que le RPE65.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules EPR des yeux de souris et de les cultiver correctement in vitro. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est correctement exécutée. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de toujours garder les yeux humides et d’essayer d’opérer aussi vite que possible.