Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la réparabilité de la membrane plasmique dans les cellules des patients atteints de dystrophie musculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la dystrophie musculaire, telles que la relation entre une mutation donnée et la cinétique de refermeture membranaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier en temps réel la cinétique de refermeture membranaire dans les cellules vivantes.

Commencez par cultiver des cellules de fibroblastes dans un flacon T225 contenant 40 millilitres de milieu de croissance dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Lorsque la culture atteint 70 à 80 % de confluence, rincez les cellules deux fois avec 40 millilitres de PBS par lavage, puis ajoutez cinq millilitres de 0,05 % de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec 40 millilitres de milieu de croissance frais et ensemencez deux millilitres de cellules à une concentration de 100 000 cellules par millilitre dans des plaques à fond de verre recouvertes de collagène de 35 millimètres pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ajouter 150 microlitres de milieu frais privé de sérum à un tube de 1,5 millilitre par culture de transfection. Ajoutez ensuite trois microlitres de réactif de transfection dans chaque tube et incubez les tubes pendant au moins cinq minutes à température ambiante. Pendant l’incubation des tubes, ajoutez 175 microlitres de milieu dérivé du sérum et 3,5 microgrammes d’ADN plasmidique de dysferline dans un tube supplémentaire de 1,5 millilitre par plaque.

Combinez ensuite 150 microlitres de la solution d’ADN plasmidique avec 150 microlitres de réactif de transfection dans un nouveau tube par plaque pour une incubation de 20 minutes à température ambiante. Le lendemain matin, remplacez le milieu de croissance par deux millilitres de milieu dérivé du sérum. À la fin de l’incubation, répartissez uniformément les 300 microlitres de solution plasmidique sur chaque plaque et incubez les plaques pendant 24 heures dans l’incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, remplacez le surnageant plasmidique par un milieu de croissance frais et remettez les plaques dans l’incubateur pendant encore 24 heures. Pour préparer les cellules à un test de blessure à deux photons, rincez une fois les cultures transfectées avec un millilitre de solution de Tyrode. Ajoutez ensuite un millilitre de solution fraîche de Tyrode complété par un microlitre de colorant FM4-64 de 2,5 millimolaires dans les cellules.

Ensuite, à l’aide d’un microscope confocal inversé, créez une cible de 0,2 par deux microns dans le logiciel du microscope et placez la cible au bord de la membrane cellulaire de sorte que la ligne cible se chevauche et se trouve perpendiculairement à la membrane cellulaire. Sélectionnez un laser à néon à hélium de 543 nanomètres pour exciter le signal de colorant FM, et un laser à argon de 488 nanomètres pour exciter le signal GFP, et réglez la plage de détection de 600 à 760 nanomètres et de 500 à 550 nanomètres respectivement. Créez ensuite une série chronologique de cinq minutes de balayages d’images séquentiels.

Pour générer une lésion membranaire, utilisez un laser à deux photons à 820 nanomètres à 15 % de puissance laser avec 10 itérations pour blanchir les cellules 25 secondes après le début de la série chronologique. Pour quantifier la fluorescence du colorant FM4-64, utilisez le logiciel pour dessiner une région d’intérêt de six par six microns et placez la région d’intérêt adjacente à l’emplacement de la blessure dans la cellule. Soustrayez ensuite la valeur de fond et divisez l’augmentation nette par la valeur de fluorescence au temps zéro pour calculer les valeurs de fluorescence relatives pour chaque point temporel.

Les cellules de fibroblastes humains sains présentent de faibles niveaux d’activation de la fluorescence FM4-64 après une blessure au laser, tandis que les fibroblastes de patients non traités présentent un degré élevé d’intensité de fluorescence relative après une blessure. Les cellules de patients qui ont été transfectées avec un plasmide de dysferline pleine longueur présentent une intensité de fluorescence relative FM4-64 réduite par rapport aux témoins de patients non traités, mais similaire aux valeurs de fluorescence observées chez les témoins sains. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les cellules mourront lentement dans la solution tampon, alors travaillez rapidement et passez à de nouvelles cellules à intervalles réguliers.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de régénérer les lésions membranaires à l’aide d’un microscope à deux photons et de quantifier le rebouchage de la membrane en temps réel.