Name: Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Apprenez à quantifier la réparation membranaire dans les cellules de patients atteints de dystrophie musculaire en utilisant l'ablation laser biphotonique. Cette technique permet l'imagerie en temps réel des processus de rescellage.

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Ce travail a été soutenu par l’Université de l’Alberta Faculté de médecine et dentisterie, les amis de Garrett Cumming Président fonds de recherche, HM Toupin neurologiques Science Research Chair Fund, dystrophie musculaire Canada, Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), voyage de Jesse - la Fondation pour la génétique et thérapie cellulaire, les femmes et Health Research Institute enfants (WCHRI), et Alberta Innovates Health Solutions (AIHS ).
Nous tenons à remercier le Dr Steven Laval pour nous alimenter avec le plasmide dysferline pleine longueur. Nous tenons également à remercier le Dr Katsuya Miyake pour des conseils techniques.

Cellules fibroblastiques humaines utilisées dans cette étude ont été utilisés avec l’approbation de la Commission d’éthique humaine de la faculté de médecine et de dentisterie de l’Université de l’Alberta.
1. la transfection des cellules avec le plasmide DYSF pleine longueur
<ol>
	<li>Cellules fibroblastes en culture dans un flacon de T225 contenant 40 mL de milieux de culture - Eagle modifié (DMEM) de 36 mL Dulbecco, 4 mL de sérum fœtal (SVF) et 20 µL de pénicilline/streptomycine (P/S) - dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Remarque : Les cellules doivent être cultivés à environ 70-80 % confluence et ne puissent pas devenir complètement confluentes.</li>
	<li>Pour préparer des cellules pour l’amorçage, rincer les cellules avec 40 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois, puis ajouter 5 mL de 0.05 % trypsine pour détacher les cellules. Retourner les cellules à 37 ° C CO2 incubateur et incuber les cellules pendant 5 min.<ol>
		<li>Lorsque les cellules sont complètement détachés, ajouter 40 mL de milieux de culture pour arrêter la réaction de la trypsine.</li>
		<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou une autre cellule, dispositif de comptage.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Graine 2 mL de cellules à 1 x 105 cellules/mL en boîtes de fond en verre enduit de collagène de 35 mm. Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur à CO2 à 37 ° C. Remarque : Les cellules doivent être environ 50-60 % anastomosé le lendemain.</li>
	<li>Retirez le support de croissance et remplacez-le par 2 mL de médias privés de sérum (milieux de culture sans FBS).</li>
	<li>Transfecter les cellules avec le plasmide dysferline pleine longueur à l’aide de lipotransfection.<ol>
		<li>Préparer 150 µL des médias privés de sérum dans un tube de 1,5 mL (un tube pour chaque plat à transfecter).</li>
		<li>Ajouter 3 µL de réactif de transfection dans chaque tube de 1,5 mL contenant des médias privés de sérum. Incuber-il au moins 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajoutez 175 µL des médias privés de sérum et 3,5 µg d’ADN plasmidique. Remarque : Multipliez les montants ci-dessus pour chaque plat supplémentaire à transfecter.</li>
		<li>Mélanger 150 µL de milieux contenant l’ADN de plasmide dans un tube avec 150 µL de médias privés de sérum et réactif de transfection. Il incuber pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Répartir uniformément 300 µL des médias avec le réactif de plasmide et transfection dans le plat. Incuber les plats pendant 24 h dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remplacer les médias avec des milieux de culture fraîche contenant du sérum et il incuber pendant 24 h supplémentaires dans un incubateur à CO2 à 37 ° C.</li>
</ol>
2. préparation des cellules pour dosage blessant deux photons
<ol>
	<li>Retirez le support de pipetage et rincer les cellules une fois avec 1 mL d’une solution de Tyrode, puis ajouter 1 mL de solution de Tyrode frais contenant 1 µL de 2,5 mM FM 4-64 colorant. Remarque : La concentration finale de colorant 4-64 FM est de 2,5 µM.</li>
	<li>Si l’évaluation de la réparation de la membrane dans un milieu appauvri en calcium est souhaitée, rincer les cellules avec 1 mL de PBS et puis ajouter 1 mL de PBS contenant 1 mM EGTA. Remarque : PBS qui provoquerait les cellules à se détacher au fil du temps, le blessant dosage doit être établie dès que possible.</li>
</ol>
3. deux photons laser blessant dosage
<ol>
	<li>À l’aide d’un microscope confocal inversé et le programme associé logiciels, créer une cible de 0,2 µm x 2 µm et placez-le au bord de la membrane cellulaire, afin que la ligne cible chevauche et se trouve perpendiculaire à la direction de la membrane cellulaire (Figure 2).</li>
	<li>Utiliser par un laser HeNe 543 nm pour exciter le signal FM colorant et définir la plage de détection pour 600-760 nm. Utiliser un laser à Argon 488 nm pour exciter signal GFP (Figure 4) et définir la plage de détection de 500 à 550 nm.<ol>
		<li>Créer une série de temps de 5 min d’analyses séquentielles image, imagerie de cellules toutes les 5 s.</li>
		<li>Pour générer une lésion de la membrane, les cellules d’eau de Javel à l’aide d’un laser à deux photons 820 nm, à l’aide de 15 % la valeur laser puissance avec 10 itérations et cellules 25 s d’eau de Javel après le début de la série temporelle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Afin de quantifier FM fluorescence colorant 4-64, utilisez le logiciel pour dessiner un 6 µm x 6 µm région d’intérêt (ROI) et placez-le adjacent à l’emplacement des blessure et au sein de la cellule (Figure 3). Remarque : Éviter les zones d’échantillonnage de sursaturation de pixel en utilisant la fonction « Indicateur de gamme » dans le logiciel - dans la présente demande, pixels rouges représentent les pixels sursaturées. Exporter les valeurs brutes de fluorescence dans un chiffrier électronique pour l’analyse statistique.</li>
	<li>Calculer les valeurs de la fluorescence relative pour chaque point dans le temps en soustrayant la valeur background (fluorescence moyenne valeur de points avant la membrane blessant) et en divisant l’augmentation nette de la fluorescence de valeur à t = 0 (Figure 5, 6) .</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Repair%3A+Mechanisms+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li>
<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li>
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<li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li>
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<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
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<li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Deux photons laser blessant de la membrane cellulaire est une technique précise et polyvalente pour évaluer la dynamique de la membrane rescellage in vitro. Dans cet article, nous avons décrit un protocole pour déterminer la membrane de la cellule rescellement de capacité dans les cellules de patients dysferlinopathy en utilisant le deux photons laser blessant dosage. Nos résultats montrent que les patients cellules dysferlinopathy sont défectueuses dans la membrane cellulaire de réapposition de sceau, qui est c...

La membrane cellulaire des cellules eucaryotes est constitué d’une double couche de phospholipides parsemées de protéine qui définit l’environnement intra/extracellulaire de la cellule et est essentielle pour maintenir la survie cellulaire de l’homéostasie et de la cellule. Membrane cellulaire blessures dus aux insultes mécaniques ou chimiques sont monnaie courante dans les divers types de cellules de mammifères, y compris squelettique et muscle cardiaque, estomac et poumon cellules1,2,3,4. En plus des blessures consécutives à une fonction physiologique quotidienne, membranes cellulaires peuvent également être endommagés par insultes environnementales, des toxines bactériennes et ischémie reperfusion5. Défaut de refermer les ruptures dans la membrane cellulaire conduit à un afflux non réglementé d’extracellulaire Ca2 +- ainsi que d’autres composants extracellulaires potentiellement toxiques - dans la cellule, cascades de signal en aval qui peuvent se traduire rapidement par cellule de déclenchement mort1,4,5,6.
A ce jour, il y a eu plusieurs modèles proposés pour la réparation de membrane de cellules. Les mécanismes de réparation différents peuvent être activés selon la taille et la nature de la rupture des membranes. Par exemple, il est suggéré que les membranes cellulaires peut utiliser écoulement latéral ou protéine colmatage pour réparer les petites perturbations (&#60; 1 nm). Le modèle de fusion latérale propose que les ruptures de la membrane sont rapidement mandés par le biais de recrutement latéral dysferline contenant de la membrane7, tandis que la protéine colmatage modèle suggère que les petites perforations sont mandées par agrégations de protéine (surtout ANNEXINES) 8. à l’inverse, déclenchent des lésions plus grandes de membrane Ca2 +-la fusion des vésicules dépendants, dysferline médiation et formation d’un patch de réparation. Dans le modèle de patch de réparation, un influx de Ca2 + rapid dans la cellule déclenche le recrutement de plusieurs protéines (dysferline, ANNEXINES, mitsugumin-53 et protéines EDH) qui forment un complexe ou la « tache », ainsi qu’une fusion des vésicules intracellulaires ou lysosomes sur le site de membrane endommagent4,9,10,11,12. Il est important de noter que ces modèles ne sont pas nécessairement mutuellement exclusifs et peuvent travailler de concert afin de faciliter la réparation de la membrane. Défaut de resceller correctement les dommages de la membrane cellulaire est associée à plusieurs états pathologiques, y compris la dystrophie musculaire (dysferlinopathy - y compris la myopathie Miyoshi, ceintures dystrophie musculaire type IIB et myopathie distale avec apparition tibiale antérieure) 13,14de la cardiomyopathie et syndrome de Chediak-Higashi syndrome (CHS)15.
Compte tenu de cette intégrité de la membrane de la cellule appropriée et rescellage fois un rôle si important dans la santé et la maladie, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la membrane cellulaire de réparation serait bénéfique à la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il est, par conséquent, nécessaire de posséder des techniques expérimentales appropriées pour suivre la cinétique et d’évaluer la capacité de réparation de la membrane cellulaire. Plusieurs méthodes in vitro pour la modélisation de réparation de membrane ont été conçus. Une stratégie implique une lésion mécanique, qui peut être facilitée par la cellule gratter avec un lame pipette/chirurgie/rasoir ou en faisant rouler les billes de verre sur les cellules16. Toutefois, ce type de lésion mécanique génère des lésions plus grandes et crée un haut degré de variation dans les lésions des cellules, aussi bien au sein et entre les cultures.
Une autre méthode de génération des plaies de la membrane est ablation laser par microscopie biphotonique. Contrairement à la microscopie confocal laser traditionnel qui emploie l’excitation monophotonique, le deux photons laser utilise simultanément deux photons de longueur d’onde, faible consommation d’énergie pour faciliter l’excitation d’un électron à haute énergie17. Ce processus non linéaire aboutit à excitation exclusivement dans le plan focal et non pas suivant le trajet de la lumière toute17 (Figure 1). Cela réduit l’excitation volume contribue à réduire le photovieillissement lors de l’imagerie de cellules vivantes18,19. Les chercheurs sont donc en mesure de générer des lésions précises dans la membrane cellulaire et moniteur membrane rescellage en temps réel en utilisant des colorants fluorescents et en observant les changements dans l’intensité de fluorescence, les ruptures de la membrane cellulaire, puis rescellages.
Cette approche a été utilisée à plusieurs reprises pour étudier la membrane blessant in vitro et in vivo et dans la cellule plusieurs types20,21. Par exemple, membrane réparer les défauts de fibroblastes et de myotubes, dérivés de dysferlinopathy, les patients ont été évalués à l’aide de cette technique22,23. Également, les fibres musculaires simples isolés de souris ont été utilisées pour contrôler réparation patch formation13,24,25. La circulation des protéines fluorescent étiquetées peut également être observée lors de la réparation de la membrane en fibres musculaires simples9. En outre, le processus de réparation du sarcolemme, suite à deux photons laser blessant dans des embryons de poisson-zèbre s’observe en temps réel en vivo26.
Dans cet article, nous décrivons une méthode d’évaluation dynamique de réparation de membrane cellulaire dans les fibroblastes en utilisant deux photons laser blessant, bien que cette méthodologie peut être appliquée à différents types de cellules dans le but de quantifier la membrane plasmique rescellage capacité in vitro. Dans cette méthode, les cellules sont incubées avec FM4-64, un colorant lipophile, cellule-imperméable qui rapidement produit une fluorescence tel qu’il se lie à négativement chargé des phospholipides dans le cytoplasme en entrant dans la cellule par l’intermédiaire de la lésion de la membrane (Figure 2&#38; 3). quantification de la fluorescence de colorant adjacente à la lésion de la membrane permet de contrôler le temps qu’il faut pour la membrane de la cellule à se refermer. Pour illustrer l’utilité de cette méthode, nous utilisons dysferlinopathy patient fibroblastes transfectées avec les plasmides de conjugaison GFP pleine longueur dysferline (DYSF) pour évaluer le sauvetage de réparation de la membrane cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm Plats à fond en verre recouverts de collagène</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Milieu privé de sérum</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Colorant</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s Salts Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Laser à deux photons</td><td>Coherent</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

essai de réparation membrane cellulaire à l’aide d’un microscope biphotonique laser

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Nombreuses insultes physiopathologiques peuvent causer des dommages aux membranes cellulaires et, lorsqu’il est couplé avec des défauts innées dans la réparation de la membrane cellulaire ou l’intégrité, peuvent entraîner la maladie. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents qui entourent la réparation de la membrane cellulaire est donc un objectif important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies liées à la dynamique de la membrane de cellules dysfonctionnelles. De nombreuses études in vitro et in vivo , afin de comprendre la membrane cellulaire rescellage dans divers contextes de maladie utilisent ablation laser deux photons comme une norme pour la détermination des résultats fonctionnels après des traitements expérimentaux. Dans cet essai, membranes cellulaires subissent coups et blessures avec un laser à deux photons, qui provoque la membrane cellulaire se rompre et colorant fluorescent s’infiltrer dans la cellule. L’intensité de la fluorescence au sein de la cellule peut être ensuite surveillée afin de quantifier la capacité de la cellule à se refermer. Il existe plusieurs autres méthodes pour évaluer la réponse de membrane cellulaire à des blessures, ainsi que grande variation dans le deux photons laser blessant approche lui-même, par conséquent, un modèle unifié de cellule blessant servirait avantageusement pour diminuer la variation entre ces méthodes. Dans cet article, nous décrivons un laser à deux photons simple blessant protocole pour évaluer la membrane cellulaire réparation in vitro à la fois sain et dysferlinopathy patients fibroblastes cellules transfectées avec ou sans un plasmide dysferline pleine longueur.

Les fibroblastes humains en bonne santé, fibroblastes de patients non traités dysferlinopathy et patients fibroblastes transfectées avec un plasmide contenant la séquence de la dysferline pleine longueur ont été soumis à deux photons laser blessant pour évaluer la membrane rescellage capacité en temps réel. Cellules de fibroblaste humain sain affichent faibles niveaux d’activation de fluorescence FM 4-64 après laser blessant et de fibroblastes de patients non traités présentaient un haut ...

Membrane cellulaire blessant par deux photons laser est une méthode largement utilisée pour évaluer la capacité de fermeture membrane et peut être appliquée à plusieurs types de cellules. Nous décrivons ici un protocole pour in vitro en direct-imagerie de membrane réapposition de sceau sur dysferlinopathy patients cellules après l’ablation de deux photons laser.

Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la réparabilité de la membrane plasmique dans les cellules des patients atteints de dystrophie musculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la dystrophie musculaire, telles que la relation entre une mutation donnée et la cinétique de refermeture membranaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier en temps réel la cinétique de refermeture membranaire dans les cellules vivantes.Commencez par cultiver des cellules de fibroblastes dans un flacon T225 contenant 40 millilitres de milieu de croissance dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Lorsque la culture atteint 70 à 80 % de confluence, rincez les cellules deux fois avec 40 millilitres de PBS par lavage, puis ajoutez cinq millilitres de 0,05 % de trypsine pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec 40 millilitres de milieu de croissance frais et ensemencez deux millilitres de cellules à une concentration de 100 000 cellules par millilitre dans des plaques à fond de verre recouvertes de collagène de 35 millimètres pour une incubation

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Décrites ici sont des protocoles utilisés pour visualiser le processus dynamique de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire chez les animaux entiers et au niveau cellulaire. Ces méthodes peuvent être appliquées pour étudier la biologie cellulaire de refermeture membrane plasmique et la médecine régénérative.

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Cette vidéo décrit l’ablation laser à deux photons des axones chez une larve de Drosophila melanogaster et un exemple de protocole pour induire une lésion et imager le site de la lésion.

Lésion neuronale induite par un laser à deux photons : une méthode pour observer la dégénérescence et la régénération des axones chez les larves de drosophile

Cette vidéo présente un test pour étudier l’efficacité de la refermeture de la membrane plasmique dans des cellules de mammifères. Les cellules sont exposées à une toxine bactérienne formant des pores, qui forme des pores dans la membrane cellulaire. En présence d’ions calcium extracellulaires, le pore provoque un afflux de calcium, induisant des événements de refermeture de la membrane. L’efficacité de refermeture est évaluée à l’aide d’un colorant à l’iodure de propidium se liant à l’ADN, qui...

Un test in vitro basé sur la fluorescence pour mesurer l’efficacité de l’étanchéité de la membrane plasmique

Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s'agit d'un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca 2 +, la sphingomyélinase, et d'autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique.

Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Le processus de guérison des cellules blessées implique trafic des protéines spécifiques et des compartiments subcellulaires au site de la lésion de la membrane cellulaire. Ce protocole décrit les essais de surveiller ces processus.

Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

La méthode de ponction thermoplasmonique intègre la microscopie confocale, la pince optique et les nanoparticules d’or pour étudier les réponses des protéines lors de la réparation de la membrane plasmique dans les cellules et les vésicules unilamellaires géantes. Cette technique permet une ponction membranaire rapide et localisée, permettant l’identification de protéines clés et de leurs rôles fonctionnels dans la machinerie complexe de réparation de la membrane plasmique.

Une approche thermoplasmonique pour étudier la réparation de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et les membranes modèles

Apprenez à quantifier la réparation membranaire dans les cellules de patients atteints de dystrophie musculaire en utilisant l'ablation laser biphotonique. Cette technique permet l'imagerie en temps réel des processus de rescellage.

Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

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