Name: Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Découvrez une méthode économique et accessible pour étudier l'adhésion des leucocytes aux cellules vasculaires et plaquettes en écoulement laminaire. Cette technique polyvalente permet d'explorer les mécanismes moléculaires du recrutement inflammatoire.

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Nous remercions les Drs Martin M. Schmitt et Fraemohs de la ligne. Ce travail a été soutenu par la Fondation néerlandaise pour la recherche scientifique (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Fondation pour la recherche sur la transfusion sanguine (LSBR Nr. 1638) et le Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) attribué à R.R.K.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’éthique médicale et Animal conseils éthiques d’Université de Maastricht.
1. flow-Based Test avec des cellules humaines
<ol><li>
Isolement des plaquettes du sang humain
	<ol>
<li>Prélever du sang veineux en anticoagulant citrate (3,2 %).</li>
		<li>Ajouter 1/15 volume d’acide Citrate Dextrose (ACD : citrate trisodique 80 mM, 52 mM d’acide citrique et 183 mM de glucose) dans le sang.</li>
		<li>Centrifuger à 350 g sans frein pendant 15 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).</li>
		<li>Transférer le surnageant dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1/20 volume d’ACD.</li>
		<li>Centrifuger à 1 110 g sans frein pendant 15 min obtenir plasma pauvre en plaquettes (PPP).</li>
		<li>Jeter le surnageant. Couper l’extrémité de l’embout de la pipette (1000 P), rendant grand alésage, quelles aides dans la prévention de l’activation plaquettaire et suspendre soigneusement le culot plaquettaire dans le même volume que la PRP en plaquettes tampon pH 6,6 (PB : 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % de glucose). Ajouter 1/20 volume de ACD et mélanger doucement.</li>
		<li>Pellet les plaquettes à 1 110 g sans frein pendant 15 min.</li>
		<li>Jeter le surnageant et suspendre soigneusement les plaquettes comme ci-dessus dans 1 mL de tampon de plaquettes (pH 7.5).</li>
		<li>Mesurer la concentration de plaquettes dans une dilution au 1/10 avec un analyseur de hématologie automatisé.</li>
		<li>Réglez le volume avec un tampon plaquettaire (pH 7.5) pour atteindre un nombre de 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolement des cellules polynucléaires du sang humain (adapté de Brinkmann et al. 11 )
	<ol>
<li>Dessiner 24 mL de sang dans l’héparine (10 U/mL) comme anticoagulant.</li>
		<li>Ajouter 6 mL de milieu de diatrizoate polysucrose-sodium 1,077 g/mL densité (voir Table des matières) à un tube conique de 15 mL et soigneusement la couche 5-6 mL sang sur le dessus.</li>
		<li>Centrifuger pendant 20 min à 800 x g sans frein.</li>
		<li>Aspirer et jetez la couche supérieure clair jaunâtre et transférer la phase inférieure de rougeâtre contenant des granulocytes dans frais tubes coniques 15 mL. Laver les cellules en ajoutant PBS contenant 2 mM EDTA pour un volume final de 14 mL et centrifugation pendant 10 min à 300 x g sans frein.</li>
		<li>Pendant ce temps, préparer un milieu de gradient de densité (p. ex.percoll, voir Table des matières) solution de travail en mélangeant 18 mL de milieu gradient de densité avec 2 mL 10 x solution stock de PBS. Diluer cette solution diluée avec du PBS (1 x) pour obtenir 4,25 mL chacune des solutions moyennes dégradées 85 %, 80 %, 75 %, 70 % et 65 %.</li>
		<li>Préparer 2 tubes coniques avec le gradient de densité en superposant 2 mL de chaque pourcentage moyen sur le dessus de l’autre. Commencez par la plus forte concentration et continuer dans l’ordre décroissant. Marquer les couches sur le tube avec un marqueur imperméable à l’eau.</li>
		<li>Soigneusement la couche 2 mL des suspensions cellulaires sur chacune des deux gradients préparés.</li>
		<li>Centrifuger pendant 20 min à 800 x g sans frein dans une centrifugeuse soigneusement équilibrée.</li>
		<li>Après centrifugation, enlever la couche supérieure et la plupart des 65 % (premier anneau) de couche avec PBMC et recueillir dans des tubes neufs le blanc restant interphases jusqu'à la couche de 85 % (second anneau, PMN).</li>
		<li>Laver les cellules en remplissant les tubes avec PBS 2 mM EDTA et centrifugation pendant 10 min à 300 x g sans frein.</li>
		<li>Retirez le surnageant et suspendre les cellules sédimentées (typiquement ≥ 95 % sont des PMN) dans 1 mL de tampon de Hank (pH 7,45), contenant 10 mM Hepes et 0,2 % de l’albumine humaine (tampon).</li>
		<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et suspendre des cellules à 1 x 106/ml.</li>
		<li>Continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des plaquettes adhérentes - et les monocouches de cellules vasculaires
	<ol>
<li>
Préparation de plat de culture cellulaire (cellules cultivées)
		<ol>
<li>Pré paration les récipients de culture de cellule 35 mm avec 1 mL de collagène de queue de rat diluée (30 µg/mL dilué dans du PBS filtré sur un filtre de 0,2 µm).</li>
			<li>Incuber 30 min à 37 ° C, jeter la solution de collagène et laver le plat une fois avec du PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Culture de cellules vasculaires en Pétri
		<ol>
<li>Détacher les primaires (p. ex., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) ou immortalisé les cellules vasculaires (p. ex., EA. Hy926, SVEC) cultivées au confluent dans une fiole de T75 avec 1,5 mL de solution de détachement cellulaire (par exemple, accutase). Ajouter 4,5 mL de milieu de culture approprié pour neutraliser la solution de détachement cellulaire et déterminer la concentration en cellules avec une cellule comptant chambre. Suspendre les cellules à 0,5 x 105 cellules/mL dans le milieu approprié (par exemple, milieu de culture de cellules endothéliales complet).</li>
			<li>Ajouter 2 mL de suspension cellulaire à chaque plat de 35 mm. Culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 à humidifié jusqu’au confluent (en 24 à 48 h, selon le type de cellule).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Préparation de lamelle de verre (plaquettes adhérentes)
		<ol>
<li>Immerger la lamelle de verre une fois dans HCl-EtOH (1,2 M / 50 % v/v).</li>
			<li>Rincer la lamelle 2 fois dans l’eau ultrapure.</li>
			<li>Sécher la lamelle sous N2.</li>
			<li>Pré-couche la lamelle de verre avec 100 µL, conformément à la position du canal de la chambre de perfusion de collagène de queue de rat diluée de type I (30 µg/mL dilué dans du PBS filtré sur un filtre de 0,2 µm).</li>
			<li>Incuber 30 min à ta, jeter la solution de collagène et laver la lamelle 3 x avec du PBS.</li>
			<li>Bloquer la lamelle de collagène enduit avec 1 % de BSA dans HEPES pendant 0,5 h à température ambiante.</li>
			<li>Laver et sécher la lamelle et monter dans la chambre de perfusion. Isoler les plaquettes d’être humain ou du sang de souris comme indiqué à l’étape 1.1 ou 2.1, respectivement.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immobilisation des plaquettes
		<ol>
<li>Ajouter 70 µL d’une suspension de plaquettes 2 x 107/ml par canal et incuber pendant 1,5 h à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
			<li>Soigneusement remplacer les plaquettes non adhérents avec solution de saturation (5 % de BSA dans HEPES) pendant au moins 30 min à RT. continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Stimulation de la monocouche cellulaire vasculaire
		<ol>
<li>Stimuler les cellules vasculaires en remplaçant les médias avec les supports neufs contenant 10 ng/mL facteur de nécrose tumorale α (TNFα) pendant 4 h à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. flow-based test avec cellules murines
<ol><li>
Isolement des plaquettes du sang de souris
	<ol>
<li>Tirage de sang par ponction cardiaque à l’aide d’une aiguille de 21 G (environ 1 mL) d’anesthésiés (kétamine 80 mg/kg et la médétomidine 0,3 mg/kg) 6 – 8 semaines-vieilles souris (C57Bl/6) dans le citrate (3,2 %) comme anticoagulant.</li>
		<li>Ajouter du volume 1/6 de l’ACD.</li>
		<li>Centrifuger à 220 x g, freinage moyen pendant 5 min obtenir le plasma riche en plaquettes (PRP).</li>
		<li>Transférer le surnageant (~ 600 µL) plus 1/3 des globules rouges dans un nouveau tube</li>
		<li>Centrifuger à 95 g sans frein pendant 6 min.</li>
		<li>Transférer le surnageant (PRP) et mesurer la concentration de plaquettes dans une dilution au 1/10 dans un tampon de Tyrode (tampon TH : 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % le glucose) avec un analyseur de hématologie automatisé.</li>
		<li>Lavez les plaquettes en augmentant le volume de 1/25 d’ACD + 0.1 apyrase U/mL et centrifuger à 2 870 g, freinage moyen pendant 2 min.</li>
		<li>Jeter le surnageant et ajouter 600 µL de tampon de TH, volume 1/10 de l’ACD et 0,1 apyrase U/mL. Couper l’embout de la pipette (1000 P), rendant grand alésage, qui contribue à la prévention de l’activation plaquettaire et Suspendez doucement le culot.</li>
		<li>Centrifuger à 2 870 g, freinage moyen pendant 2 min</li>
		<li>Jeter le surnageant et Suspendez doucement les plaquettes dans un tampon de TH.</li>
		<li>Régler le volume avec le tampon de TH pour atteindre un nombre de 2 x 107/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des monocouches de plaquettes adhérentes
	<ol>
<li>Préparer la lamelle de verre (plaquettes adhérentes) selon les 1.3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilisation des plaquettes
	<ol>
<li>Ajouter 100 µL d’une suspension de plaquettes 2 x 107/ml par canal et incuber pendant 1,5 h à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Soigneusement remplacer les plaquettes non adhérents avec solution de saturation (5 % de BSA dans HEPES) pendant au moins 30 min à RT. continuer avec marquage fluorescent et la perfusion des leucocytes (étape 3.3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stimulation de la monocouche de plaquettes de souris
	<ol>
<li>Avant la perfusion des leucocytes (étape 3.3), stimuler les plaquettes par perfusion de thrombine (0,5 nM) dans un tampon HHHSA pendant 3 min à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. marquage fluorescent et la Perfusion des leucocytes (PMN ou THP-1 pour homme et RAW264.7 ou les Monocytes de souris primaire pour Murine Flow-Based Test)
<ol><li>
Marquage fluorescent
	<ol>
<li>Étiqueter les leucocytes (1 x 106/ml) avec la tache de la cellule-perméants vert fluorescent d’acide nucléique (1 µM). Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C.</li>
		<li>Laver les cellules avec du PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min et suspendre les cellules à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL (5 mL / condition de test, selon la vitesse d’écoulement) dans du tampon d’essai.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Flux de préparation de dosage chambre
	<ol>
<li>Pour adhésion leucocytaire sur une monocouche de cellules, jetez le milieu de culture cellulaire du plat et le monter dans la chambre de flux. Raccordez le tuyau sur la seringue. Pour adhésion leucocytaire sur plaquettes immobilisées, connecter le micro slide à la seringue. Préchauffer un bain-marie à 37 ° C.</li>
		<li>Prenez une seringue de perfusion (50 mL), installation de seringue sur le support de la seringue et ensemble, retirer la pompe sur mode. Régler le débit de la pompe à 0 mL, puis affectez-lui le diamètre 26,70 mm pour la seringue de 50 mL.</li>
		<li>Brancher un connecteur luer de coudé à une extrémité de la tubulure. Placez un coupleur de verrouillage luer de la seringue et raccordez le tuyau avec le connecteur luer de coude au raccord luer lock. Branchez l’extrémité du tube gratuit à la chambre de flux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adhérence et la perfusion de leucocytes
	<ol>
<li>Pour adhésion leucocytaire sur une monocouche de cellules, jetez le milieu de culture cellulaire du plat et le monter dans la chambre de flux. Raccordez le tuyau sur la seringue. Pour adhésion leucocytaire sur plaquettes immobilisées, connecter le micro slide à la seringue.</li>
		<li>Pour la perfusion de leucocytes et l’adhérence sur un vasculaire- ou monocouche plaquettaire, déposer le deuxième tube dans un tube conique de 50 mL contenant du tampon et remplissage de tubes avec pipette de 1 mL, puis squeeze la tubulure et connectez-le à une chambre à flux.</li>
		<li>Avant la perfusion de leucocyte, ajouter 3 mM CaCl2 et 2 mM MgCl2 à la suspension cellulaire et incuber pendant 5 min à 37 ° C.</li>
		<li>Perfuse du tampon d’essai avant la perfusion de cellules pour chasser l’air possible de la chambre et le tube.</li>
		<li>Fermer les extrémités de tube en serrant leur serré et passer le tuyau du tampon au suspension cellulaire, empêchant l’enfermement de bulles d’air. Perfuse cellules avec contrainte de taux/cisaillement débit adéquat jusqu'à ce qu’arrivent les premières cellules.</li>
		<li>Perfuse cellules avec débit adéquat taux/cisaillement pendant 2 min et capturer au moins 6 photos entre 2 à 6 min de roulement et adhérentes des cellules avec un microscope à contraste/fluorescence phase inverse (par exemple, EVOS-FL) grossissement de 100 connectés pour une caméra CCD ou CMOS. NOTE : Taux/cisaillement de flux dépend de dimensions de chambre de flux et de la viscosité du perfusat. Chambre de perfusion utilisé ici (voir la Table des matières) : Τ =η* 97.1*Φ Τ : contrainte de cisaillement (1 dyn/cm2) Η : viscosité (0,015 dyn * s/cm2) Φ: débit (0,67 mL/min)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dé-adhésion leucocytaire
	<ol>
<li>Pour de-adhesion, passent le tuyau du suspension cellulaire au tampon en pressant sur le tube, empêchant les bulles d’air de devenir pris au piège.</li>
		<li>Détacher les cellules par perfusion avec du tampon avec un débit adéquat taux/cisaillement (cf. 3.3.7 Note).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmigration des leucocytes
	<ol>
<li>Pour la transmigration des leucocytes, perfuse leucocytes (étape 3) jusqu'à ce qu’une quantité suffisante de leucocytes adhèrent (~ 50-champ de cellules/affichage).</li>
		<li>Remplacer suspension leucocytes avec du tampon d’essai.</li>
		<li>Enregistrer les cellules transmigrer en time-lapse toutes les 10 à 15 s pendant 30 à 60 min à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li>
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<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immune+system+interactions+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+engagement+of+platelet+glycoprotein+Ibalpha+via+the+integrin+Mac-1+is+critical+for+the+biological+response+to+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury.</a> Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).</li>
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<li>Wang, Y., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrin+Mac-1+regulates+thrombosis+via+interaction+with+platelet+GPIb%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα.</a> Nature communications. 8, 15559(2017).</li>
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<li>Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386106013061">Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel.</a> Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724(2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586(2013).</li>
<li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce dosage in vitro est une méthode simple pour étudier les mécanismes sous-jacents de recrutement des leucocytes au cours de l’inflammation vasculaire, mais il y a certains points critiques à noter. La première condition pour réaliser avec succès ce test est la perfusion des leucocytes sur un intact et anastomosé vasculaires ou monocouche plaquettaire. Ceci peut être réalisé en enduisant préalable des surfaces avec du collagène de type I. En général, lorsque vous travaillez avec des cellules vasculaires primaire...

Sur blessure, inflammation ou infection, leucocytes répondent rapidement à pathogène ou dommages associés à - molecular patterns (PAMPs, DAMPs), transformer un état activé et sortir de la circulation sanguine aux sites d’inflammation et tissus des dommages. La capacité des leucocytes d’interagir avec leur environnement cellulaire et moléculaire est essentielle pour leur bon fonctionnement comme des cellules immunitaires, mise en évidence par des maladies génétiques comme le déficit d’adhésion leucocytaire1. Adhésion leucocytaire a fait l’objet d’une enquête intense durant les dernières décennies, et il en est résulté dans le concept de la cascade d’adhérence de leucocyte dans le début des années 19902,3. Adhésion leucocytaire est initiée par la capture de sélectine médiée par des leucocytes à l’endothélium, provoquant les cellules à rouler sur la surface vasculaire. Ce roulement permet de leucocytes d’analyse pour l’endothélium lié aux indices migrateurs, par exemple, chimiokines, qui induisent l’activation des intégrines. Par la suite, les intégrines activés médient la liaison aux ligands endothéliales, entrainant l’arrestation de leucocyte ferme. Leucocytes puissent se préparer par la suite à extravasate en rampant et la diffusion, avant de pénétrer la monocouche endothéliale et transmigrant dans le tissu sous-jacent. Le concept de base de la cascade de leucocyte canonique a est restée pratiquement inchangée depuis son introduction, avec quelques étapes intermédiaires supplémentaire4. Néanmoins, les mécanismes moléculaires exacts et les rôles des nombreux joueurs impliqués dans le recrutement des leucocytes n’ont pas été clarifiées jusqu'à présent, et le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et (auto-) système immunitaire recherche.
Par exemple, au cours des maladies inflammatoires vasculaires telles que l’athérosclérose, augmenté le recrutement des leucocytes dans le développement de plaque bateau mur lecteurs. Les plaques d’athérome instables pourraient se rompre, menant à l’activation massive des plaquettes et du système de coagulation et par la suite à l’occlusion du vaisseau5. Cela peut entraîner des complications cardiovasculaires graves tels que l’infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral. En outre, dénudation endothéliale telle qu’elle se produit sur le plan clinique, par exemple après la pose d’un stent d’une artère coronaire, mène à une multitude d’interactions des leucocytes et des plaquettes à l’intérieur de mur de navire exposés (p. ex., constituants de la matrice et lisse cellules musculaires) et des leucocytes avec plaquettes couvrant les lésions vasculaires. Ces interactions sont importantes pour le développement ultérieur de la maladie, car les interactions monocyte-plaquettes pourraient conduire néo-intimale formation6,7. En outre, les interactions leucocyte-plaquettaire médiée par les leucocytes intégrine Mac-1 (Mde α β (2) et plaquettes GPIbα ont récemment été identifiées comme les nouveaux pilotes de thrombose chez les souris8.
Compte tenu de la grande disponibilité de sang humain et des animaux comme une source de leucocytes et de plaquettes pour la recherche et le large éventail des molécules de la matrice isolés et lignées cellulaires immortalisées de leucocytes et d’origine vasculaire, il est possible de simuler des leucocytes interactions dans un écoulement dans un laboratoire, en utilisant spécialement conçu chambres de perfusion de flux. De nombreuses variantes ont été conçus au cours des dernières décennies, allant d’une situation de vide aux chambres de perfusion auto-adhésives. Toutes les variantes ont en commun que la partie immobile (par exemple, des cellules vasculaires ou protéines de la matrice) est Assemblée dans une plus grande chambre étanche équipée d’un canal prédéfini permettant une perfusion de liquides sur la partie immobile. En outre, avances en technologie de moulage a permis le développement de solutions sur mesure basées sur silice polymères9. La viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal principalement déterminent les caractéristiques de contrainte de cisaillement des flux perfusion périphérique10. Dans cet article, nous présentons une méthode in vitro pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence et la transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’avantage des méthodes présentées ici est qu’elles peuvent être effectuées à l’aide d’un microscope à fluorescence caméra connectée commune et ne nécessitent pas un expérimentateur de posséder des compétences techniques élevées. L’essai in vitro peut être manipulée à bien des égards (par exemple, en ajoutant des inhibiteurs ou en bloquant les anticorps) et n’est donc applicable dans différents modèles d’inflammation vasculaire et permet l’enquête d’adhérence fonctions protéiques ou le évaluation de composés spécifiques.

<table><tbody><tr><td>Microscope à fluorescence inversée, par exemple EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump par ex. modèle : 210-CE</td><td>&nbsp ; world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 50 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Tube en silicone&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Coude Luer Connecteur Mâle</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Femelle Luer Lock Coupler</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’écoulement</td><td>Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle</td><td></td><td>Brevet DE10328277A1 : Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&ouml ; mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&auml ; ngen an Zelloberfl&auml ; Chen. 2005.</td></tr><tr><td>Ibidi sticky slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles pour sticky slides&nbsp ;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type I, queue de rat</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant TNF-&alpha ;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Activateur du récepteur de la thrombine pour le peptide 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 coloration d’acide nucléique fluorescente verte</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' solution saline équilibrée 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution tampon 1M, liquid</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albumine, 25 %&nbsp ;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Eau injectable</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des cellules endothéliales endothéliales (prêt à l’emploi)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Cellules endothéliales primaires de l’aorte humaine (HAoEC)</td><td>ATCC&</td><td>nbsp ; PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Milieu basal des cellules vasculaires&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de croissance des cellules endothéliales-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Cellules musculaires lisses de l’aorte humaine primaires (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Kit de croissance des cellules musculaires lisses vasculaires</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Lignée de cellules endothéliales humaines, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Milieu d’Eagle modifié (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire endothéliale de souris, SV 40 transformée (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire monocytaire humaine, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec ultra-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Monocyte/macrophage de souris RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), teneur élevée en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp ; Vacutainer Tubes de prélèvement sanguin en plastique avec héparine de sodium</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Citrate de sodium de coagulation 3,2 %&nbsp ;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>mélange HCl/EtOH (1,2 mol/L de HCl et 50 % d’éthanol) dans de l’eau</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Préparez en mélangeant 0,3 L de HCl (4 mol/L) avec 0,7 L d’éthanol à 70 % v/v dans une hotte</td><td></td></tr></tbody></table>

analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

Le recrutement des leucocytes à la blessure ou inflammation aux sites de blessures ou de dommages aux tissus a été étudié au cours de ces dernières décennies et a abouti à la notion de la cascade d’adhérence de leucocyte. Toutefois, l’exactes mécanismes moléculaires impliqués dans le recrutement des leucocytes n'ont pas encore été pleinement identifiés. Étant donné que le recrutement des leucocytes reste un sujet important dans le domaine de l’infection, l’inflammation et immunitaire recherche (auto-), nous présentons un simple test à flux laminaire pour étudier les mécanismes sous-jacents de l’adhérence, dé-adhérence, et transmigration des leucocytes en vertu des régimes d’écoulement veineux et artériels. L’essai in vitro peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires dans différents modèles d’inflammation vasculaire. Ce protocole décrit une analyse axée sur les hottes à flux laminaire à l’aide d’une chambre à flux parallèle et un microscope à contraste de phase inversé relié à une caméra pour étudier les interactions des leucocytes et des cellules endothéliales ou les plaquettes, qui peuvent être visualisés et enregistrées puis analysés en mode hors connexion. Les cellules endothéliales, les plaquettes ou les leucocytes peuvent être prétraités avec inhibiteurs ou des anticorps afin de déterminer le rôle des molécules spécifiques au cours de ce processus. Conditions de cisaillement, contrainte de cisaillement c.-à-d. artériel ou veineux, peuvent être facilement adaptées par la viscosité et la vitesse d’écoulement des fluides perfusés et la hauteur du canal.

Pour étudier l’adhésion endothéliale-leucocytaire, fluorescent étiquetés cellules THP-1 ont été perfusés pendant une monocouche endothéliale TNFα - ou non-stimulés pendant 2 min à 3 dyne/cm2. Le nombre total de cellules adhérentes de monocytaire a été déterminé après 2 min de perfusion en capturant 6 champs indépendants sur une période de 2 à 6 min. Les cellules adhérentes ont été quantifiés dans au moins 6 photos prises avec un microscope à contraste/fluorescence phase inverse...

Leucocytes avidement interagissent avec les cellules vasculaires et plaquettes après blessure de mur de navire ou lors d’une inflammation. Nous décrivons ici un simple test à flux laminaire pour caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les leucocytes et leurs partenaires cellulaires.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

L’objectif général de cette expérience est d’étudier les mécanismes à l’origine des interactions des leucocytes avec les cellules vasculaires adhérentes ou les plaquettes dans des conditions d’écoulement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que la façon dont les leucocytes sont recrutés sur les sites d’inflammation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est rentable, conviviale et permet d’étudier une grande variété de conditions expérimentales.Cette méthode peut donner un aperçu de l’adhésion des leucocytes. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que l’adhésion de cellules tumorales à des cellules ou des substrats immobilisés dans des conditions d’écoulement. Annemiek Dickhout, ingénieure et doctorante travaillant dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Après avoir obtenu des échantillons de sang, ajoutez 1/15e de volume de citrate acide dextrose au sang. Ensuite, centrifugez l’échantillon de sang en desserrant les freins à 350 fois g pendant 15 minutes pour obtenir un plasma riche en plaquettes. Transférez ensuite le surnageant obtenu dans un tube conique de 15 milli

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La cascade adhésion des plaquettes a lieu en présence du cisaillement, un facteur non pris en compte dans conventionnelle (statique) du bien-plaque de tests. Cet article rend compte d'un test d'agrégation plaquettaire en utilisant une plaque de microfluidique bien le format d'émuler les conditions physiologiques de flux de cisaillement.

L&#39;adhésion des plaquettes et l&#39;agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

Nous décrivons une méthode pour objet des cellules adhérentes à la contrainte de cisaillement à flux laminaire dans un circuit à débit continu stérile. L'adhérence des cellules, la morphologie peut être étudiée à travers la chambre transparente, des échantillons obtenus à partir du circuit pour l'analyse de métabolites et cellules récoltées après une exposition de cisaillement pour les expériences futures ou la culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Cette vidéo présente un test basé sur le flux laminaire pour caractériser l’interaction des leucocytes et des partenaires cellulaires tels que les cellules endothéliales. Cette méthode fournit des informations dynamiques sur l’adhésion, la deadhesion et la transmigration des leucocytes lorsqu’ils sont perfusés sur une couche intacte et confluente de cellules vasculaires.

Un test basé sur le flux laminaire pour étudier les interactions entre les leucocytes et les cellules endothéliales

La vidéo présente une méthode d’étude de l’impact des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes. Dans un modèle de chambre d’écoulement de plaques parallèles, les cytokines pro-inflammatoires induisent l’expression des récepteurs d’adhésion par les cellules endothéliales, facilitant le recrutement et la migration des neutrophiles. La diaphonie entre les cellules stromales et les cellules endothéliales diminue le recrutement des neutrophiles dans les cellules endothéliales.

Une étude in vitro de l’effet des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes

le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l'endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Ici, nous présentons un protocole qui permet à l'enquêteur d'évaluer la dynamique du recrutement de leucocytes ex vivo en connectant une chambre revêtue d'adhérence des molécules dérivées de l'endothélium dans le système circulatoire d'une souris. Cette méthode offre des avantages importants, car il permet l'évaluation de leucocytes dans des conditions biologiques relatives.

Évaluer les interactions de leucocytes-endothélial dans des conditions d'écoulement dans un Ex Vivo Autoperfused Microflow Chambre Assay

La capacité de l'endothélium enflammé de recruter leucocytes du débit est régulé par les cellules stromales mésenchymateuses. Nous décrivons deux modèles in vitro incorporant cellules humaines primaires qui peuvent être utilisés pour évaluer le recrutement des neutrophiles de flux et d'examiner le rôle que les cellules stromales mésenchymateuses jouent dans la régulation de ce processus.

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l'étude de l'adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l'écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l'étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l'hémostase.

Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Nous présentons ici un protocole intégré qui mesure la sous-population de monocyte traite sous flux in vitro par l’utilisation de marqueurs de surface spécifiques et la microscopie confocal fluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour explorer les étapes séquentielles de recrutement aussi bien quant à profil autres sous-types de leucocytes à l’aide d’autres marqueurs de surface spécifiques.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

Ce protocole étape par étape fournit une description détaillée du montage expérimental et analyse des données pour l’évaluation des réponses inflammatoires hiPSC-ECs et l’analyse de l’adhérence des leucocytes dans un écoulement physiologique.

Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

Découvrez une méthode économique et accessible pour étudier l'adhésion des leucocytes aux cellules vasculaires et plaquettes en écoulement laminaire. Cette technique polyvalente permet d'explorer les mécanismes moléculaires du recrutement inflammatoire.

Analyses d’enquêter sur le recrutement des leucocytes sur les cellules vasculaires et plaquettes adhérentes à flux laminaire

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