Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

Nous avons découvert que HLA-I est épigénétiquement vers le bas réglé dans une sous-population de cellules cancéreuses qui présentent des propriétés de cellules souches et la capacité tumorale-initiation. La downregulation HLA-I est directement liée à l’évasion immunitaire, offrant des avantages de survie pour les cellules souches cancéreuses, faisant ainsi de la négativité HLA-I un marqueur fonctionnel précis pour ces cellules. Sudeh Izadmehr, postdoc de notre laboratoire, démontrera la procédure.

Lors de l’acquisition de l’échantillon, placer le tissu dans une boîte petri de 100 millimètres dans un armoire de biosécurité stérilisée, et ajouter 500 microlitres de PBS stérile au plat. Utilisez un scalpel stérile pour triturer mécaniquement le tissu en petits morceaux jusqu’à ce qu’aucun fragment ne soit plus grand que 0,1 millimètre. Transférer l’ensemble du volume de 500 microlitres de PBS à travers une passoire à cellules pores de 35 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

Ajouter encore 500 microlitres de PBS aux fragments de tissu, et hacher les tissus à nouveau. Filtrez ensuite le supernatant à travers la passoire cellulaire dans le même tube de collecte, et continuez à hacher les morceaux de tissu jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement dissocié. Lorsque le dernier volume de cellules a été recueilli, faites tourner les cellules tumorales par centrifugation, et suspendez la pastille en cinq millilitres de tampon d’hémolyse.

Après cinq minutes à température ambiante, recueillir les cellules avec une autre centrifugation, et laver la pastille avec un autre cinq millilitres de PBS. Suspendez à nouveau la pastille en un millilitre de PBS et comptez les cellules viables. Diluer les cellules à une fois 10 à la septième cellule par 200 microlitres de concentration de PBS sur la glace, et ajouter 200 microlitres de matrice membranaire sous-sol aux cellules avec un mélange doux.

Injectez ensuite la matrice membranaire de suspension-sous-sol cellulaire sous-cutanée dans le flanc d’une souris gamma scid nod, et vérifiez la croissance de la tumeur au site d’injection deux fois par semaine. Quand la tumeur atteint un centimètre de diamètre, coupez la tumeur en deux, et fixez la moitié de la xénogreffe avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’analyse histologique. Traiter la deuxième moitié de la tumeur comme vient de démontrer pour atteindre une suspension cellulaire unique, et diluer les cellules à deux fois 10 aux six cellules par millilitre de PBS complété avec 5% de concentration de FBS.

Maintenir les cellules sur la glace pendant 30 minutes avant de diviser la suspension cellulaire entre un contrôle de l’isotype et un tube d’anticorps. Notez le nombre de cellules dans chaque tube, et mélangez les cellules dans le tube d’anticorps avec l’anticorps anti-HLA et les cellules dans le tube de commande d’isotype avec un anticorps approprié de contrôle d’anti-isotype pour une incubation de 90 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, recueillir les deux populations cellulaires par centrifugation, suivie de deux lavages PBS de 10 millilitres par centrifugation.

Après le deuxième lavage, suspendre à nouveau les granulés dans 10 microgrammes par millilitre de DAPI à une concentration une fois 10 à sept cellules par millilitre de concentration. Filtrez ensuite chaque suspension cellulaire à travers une passoire pore de 35 micromètres en tubes individuels de polystyrène de 12 par 75 millimètres. Après le tri cellulaire activé par fluorescence, diluer les populations de cellules négatives et positives HLA-I à des concentrations individuelles de 10 à 5 cellules dans 15 millilitres du milieu de croissance de la sarcoosphère par sous-ensemble.

Diluer périodiquement les cellules à une fois 10 à la quatrième, 10 à la troisième, et 10 à la deuxième concentrations dans 15 millilitres de moyenne de croissance de la sarcoosphère fraîche par dilution, et ajouter 100 microlitres de cellules de chaque dilution à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire d’attachement ultra-faible de 96 puits par dilution. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius et de dioxyde de carbone, surveillez quotidiennement la formation de la sarcoosphère par microscopie légère et ajoutez à chaque puits un facteur de croissance fibroblaste de base frais et un facteur de croissance épidermique sans changer le milieu tous les trois jours. Après trois semaines, comptez le nombre de puits sarcosphère-positifs et sarcosphère-négatifs pour chaque dilution cellulaire des cellules HLA-I-négatives et HLA-I-positives pour permettre le calcul de la fréquence cellulaire de formation de sphère basée sur une distribution de probabilité de Poisson.

Typiquement, les xénogreffes humaines patient-dérivées de sarcome se composent de deux populations hLA-I-positives et négatives distinctes, avec une histologie semblable à celle démontrée par la tumeur primaire parentale. Le tri cellulaire activé par fluorescence des cellules tumorales xénogreffes dérivées du sarcome, tel que démontré, facilite l’enrichissement d’un grand nombre de cellules négatives HLA-I de la population de cellules parentales. Les cellules HLA-I-négatives sont capables de former des sphères avec une entrée initiale d’aussi peu que 10 cellules et présentent une capacité de formation tumorale plus élevée que le patient de sarcome HLA-I-positif est arrivé xenograft cellules tumorales-initiation.

L’injection du même nombre de cellules négatives et positives HLA-I sous-cutanées dans les flancs opposés de la même souris démontre que les cellules négatives HLA-I possèdent une capacité de formation tumorale significativement plus élevée. Tandis que les xénogreffes formées par les sous-populations négatives et positives de HLA-I sont des tumeurs cellulairement hétérogènes. En outre, l’analyse d’expression génique des cellules tumorales révèle que les cellules HLA-I-négatives expriment des marqueurs de différenciation des cellules souches et peuvent être induites à se différencier le long des voies lipogènes et ostéogéniques, démontrant une forte coloration et une culture oil-red-o et alizarin-rouge-s.

Cette méthode peut être utilisée pour isoler les cellules souches cancéreuses dans divers cancers humains. La carbonisation moléculaire, par exemple, par séquençage de prochaine génération peut révéler des marqueurs communs pour cibler les cellules thérapeutiquement. Notre découverte démontre que la restauration de HLA-I est une étape critique pour le succès des stratégies fonctionnelles d’augmentation des cellules immunitaires.