Name: Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules initiatrices de tumeurs par tri cellulaire à fluorescence dans les xénogreffes de sarcome. Cette méthode utilise le marqueur HLA-I négatif pour identifier les cellules souches cancéreuses et leurs propriétés différenciatives.

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Cette recherche a été appuyée par NCI-P01-CA087497 (à C.C.-C. d.H.) et NIH-U 54-0OD020353 (à C.C.-C., D.H., et J.D.-D.), le Prix Agilent de chef de pensée (à C.C.-C.), et la Fondation Martel (à C.C.-C. et J.D.-D.).

Tous les protocoles pour les expériences de souris discutés ici étaient conformes aux directives institutionnelles et approuvés par le Mount Sinai Medical Center Institutional Human Research Ethics Committee et Animal Care and Use Committee.
1. Traitement de l'échantillon de tissu de sarcome, et formation de PDX
<ol><li>En vertu d'un protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel, demandez au personnel des services de pathologie de préparer des échantillons de sarcome à partir de échantillons de chirurgie et de mettre immédiatement chaque échantillon sur la glace dans un plat Petri de 100 mm.</li>
	<li>Placez l'échantillon dans un tube conique en polystyrène de 15 ml avec 6 ml de froid Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 milieu de culture complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine. Traiter l'échantillon de tissu immédiatement.</li>
	<li>
(Facultatif) Pour l'ostéosarcome seulement, suivez les étapes suivantes, qui peuvent être ignorées pour le sarcome des tissus mous.
	<ol>
<li>Couper le tissu en morceaux de 20 mm3 à l'aide d'un scalpel. Transférer les morceaux de tissu dans un tube de 15 ml contenant 3 ml de solution de collagène (RPMI 1640 avec 1 mg/mL de collagène).</li>
		<li>Mettre le tube dans un bain d'eau à 37 oC pendant 30 min.</li>
		<li>Vortex complètement le tube et, puis, ajouter 3 mL de RPMI 1640 complété par 10% FBS pour neutraliser l'activité de collagène.</li>
		<li>Centrifugeuse de 5 min à 350 x g à température ambiante. Retirez le supernatant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En travaillant dans une armoire de biosécurité stérile, placez l'échantillon de tissu dans un plat Petri de 100 mm. Ajouter 500 l de salline stérile 1x tamponné par le phosphate (PBS) au tissu. À l'approche d'un scalpel stérile, triturate mécaniquement le tissu en petits morceaux jusqu'à ce qu'aucun morceau de tissu visible ne soit supérieur à 0,1 mm.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire de 500 l à une passoire cellulaire de 35 m et récupérer la suspension filtrée à l'intérieur d'un tube en polystyrène de 50 ml. Mettez ce tube de polystyrène de 50 ml avec la suspension cellulaire sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 500 l'autre de PBS au tissu. Triturate pour la deuxième fois, transférer la suspension à travers la passoire cellulaire, et le recueillir dans le même tube de 50 ml.</li>
	<li>Répétez ces étapes (étapes 1.5-1.6) jusqu'à ce que la section de tissu soit complètement dissociée, habituellement 6x - 8x.</li>
	<li>Pelleter la suspension cellulaire par centrifugation à 350 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le supernatant, resuspendre le granule à l'aide de 5 ml de tampon d'hémolyse (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3et 0,1 mM EDTA), et incuber la solution pendant 5 min à température ambiante pour enlever les globules rouges.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 5 min à 350 x g à température ambiante et retirer le tampon d'hémolyse. Laver la pastille avec 5 ml de PBS. Centrifugeuse à nouveau pendant 5 min à 350 x g et retirer le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre le granule avec 1 ml de PBS et compter le numéro de cellule viable à l'aide d'un hémocytomètre ou de toute autre méthode alternative. Diluer les cellules à une concentration finale de 1 x 107 cellules dans 200 L de PBS. Laissez la suspension de la cellule sur la glace.</li>
	<li>Laissez la matrice de membrane du sous-sol sur la glace pour lui permettre de fondre. Ajouter 200 l de matrice de membrane de sous-sol à la suspension de cellules de 200 l. Mélanger délicatement et conserver sur la glace.</li>
	<li>Injecter sous-cutanée la suspension cellulaire : matrice membranaire du sous-sol (1:1) dans deux souris gamma cidées NOD (NSG) sur leurs flancs. Utilisez 200 l pour chaque injection.</li>
	<li>Surveillez la formation de PDX en vérifiant le site d'injection des souris 2x par semaine. Enlever la tumeur xénogreffe quand il atteint 1 cm de diamètre.</li>
</ol>2. Isolement des cellules initiatrices de tumeurs par FACS du PDX
<ol><li>Retirez chirurgicalement le PDX des souris comme décrit précédemment12.</li>
	<li>Coupez la tumeur en deux. Fixer la moitié du xénogreffe avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit. C'est pour l'analyse histologique. Traiter l'autre moitié du tissu tel que décrit ci-dessus (étapes 1.3-1.8) pour obtenir une suspension de cellules tumorales.</li>
	<li>Resuspendre le granule avec PBS et compter le numéro de cellule viable.</li>
	<li>Diluer la suspension cellulaire dans PBS complétée par 5% FBS à une concentration de 2 x 106 cellules/mL. Laisser la suspension cellulaire sur glace pendant 30 min. Diviser la suspension cellulaire sur deux tubes. Marquez les tubes avec le contrôle des isotopes et l'anticorps, respectivement. Notez le nombre de cellules dans chaque tube.</li>
	<li>Préparer 2x HLA-1-PE anticorps en diluant l'anticorps avec PBS complété par 5% FBS (1:250). Diluer l'anticorps négatif de contrôle d'isotype avec la même condition. Mélanger la suspension cellulaire du tube "anticorps" avec un anticorps dilué (1:1) pour faire la dilution finale de l'anticorps 1:500. Mélanger la suspension cellulaire du tube de « contrôle des isotopes » avec le contrôle des isotopes (1:1). Mettre les suspensions cellulaires sur la glace pendant 90 min.</li>
	<li>Centrifugeuse pendant 5 min à 350 x g à 4 oC et retirer le supernatant. Ajouter 10 ml de PBS pour laver la pastille 2x.</li>
	<li>Ajouter 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) à PBS à une concentration finale de 10 'g/mL. Ajoutez cette solution DAPI à la pastille cellulaire pour faire une suspension cellulaire de 107 cellules/mL (en utilisant les numéros cellulaires de l'étape 2.4).</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers des bouchons de passoire de 35 m dans des tubes en polystyrène de 12 mm x 75 mm.</li>
	<li>Utilisez un cytomètre de débit pour trier lasous-population hLA-1-négative de TIC 6. Portez les cellules viables (DAPI-négatif) et recueillez les sous-populations HLA-1-négatives et -positives dans deux tubes de collecte de 15 ml, chacun contenant 4 mL de milieu de culture RPMI 1640.</li>
</ol>3. Caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs
<ol><li>Formation de sarcosphère
	<ol>
<li>Faire moyen de croissance de la sarcosphère, en utilisant le milieu de culture cellulaire alpha-MEM. Ajouter des suppléments pour faire une concentration finale de suppléments B-27 (1x), n2 suppléments (1x), facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF) (20 ng/mL), et facteur de croissance épidermique (EGF) (20 ng/mL) et de pénicilline/streptomycine (100 UI/mL). Filtrer le milieu à l'utilisation d'un filtre de culture cellulaire de 0,2 m avant utilisation.</li>
		<li>Pelleter la sous-population HLA-1-négative triée à partir de l'étape 2.9 et compter le nombre de cellules de chaque sous-population.</li>
		<li>Diluer 1,5 x 106 cellules en 15 ml du milieu de croissance de la sarcosphère pour faire la dilution cellulaire de 1 x 105 cellules/mL.</li>
		<li>Diluer en série les cellules avec le milieu frais de croissance de sarcosphère pour faire 15 ml de chaque dilution de cellules de 104, 103, et 102 cellules/mL. Ensuite, préparez quatre plaques de culture de cellules d'attachement ultra-faible de 96 puits, chacune pour une dilution cellulaire.</li>
		<li>Transférer 100 l de suspension cellulaire de la dilution de 105 cellules/mL à chaque puits de la première plaque de culture de cellules d'attachement ultra-faible de 96 puits. Cette plaque a 104 cellules dans chaque puits.</li>
		<li>Utilisez les trois autres plaques de culture de cellules d'attachement ultra-faible de 96 puits pour les trois autres dilutions cellulaires : 104, 103et 102 cellules/mL. Transférer 100 l de suspension cellulaire à chaque puits des plaques de culture de cellules d'attachement ultra-faible de 96 puits. Ces trois plaques de culture ont 1.000 cellules/puits, 100 cellules/puits, et 10 cellules/puits, respectivement.</li>
		<li>Mettre les plaques dans un incubateur de culture cellulaire CO2 de 37 oC et 5 %.</li>
		<li>Ajouter de nouveaux bFGF et EGF directement au milieu de culture cellulaire (concentration finale de 20 ng/mL) tous les trois jours sans changer le milieu pour éviter les cellules perdues dans la culture de suspension.</li>
		<li>À l'aide d'un microscope léger, surveillez la formation de sarcosphère tous les jours pendant trois semaines, comme le montre la figure 2A.</li>
		<li>Après trois semaines, comptez le nombre de puits sarcosphère-positifs et de puits sarcosphère-négatifs de chaque dilution de cellule pour les cellules HLA-1-négatives et HLA-1-positives.</li>
		<li>Calculer la fréquence des cellules de formation de sphère s'appuyant sur une distribution de probabilité Poisson13. Comparez les TIC HLA-1-négatifs avec les cellules en vrac HLA-1-positives.</li>
	</ol></li>
	<li>Assay de tumeur-formation de dilution en série
	<ol>
<li>Comptez les sous-populations HLA-1-négatives et -positives à partir de l'étape 2.9.</li>
		<li>Faire des dilutions en série des cellules avec PBS à des concentrations de 106, 105, 104, et 103 cellules/mL. Utilisez 1 ml de chaque dilution pour la formation tumorale chez 10 souris.</li>
		<li>Ajouter 1 ml de matrice membranaire du sous-sol à la suspension cellulaire de 1 ml de chaque dilution (1:1). Conserver les 2 ml de chaque mélange sur la glace.</li>
		<li>Injecter sous-cutanée 200 L du mélange de matrice de membrane de cellules:sous-sol dans les flancs des souris NGS, en utilisant des cellules HLA-1-négatives pour un flanc et des cellules HLA-1-positives pour l'autre flanc de la même souris. Pour chaque dilution, utiliser 10 souris. Utilisez des seringues 25G avec une aiguille pour les injections.</li>
		<li>Surveiller la formation tumorale chez les souris pendant quatre à huit semaines, selon le taux de croissance tumorale.</li>
		<li>Calculer la fréquence des cellules de tumeur-initiateur par le pourcentage de formation de tumeur à différents nombres de cellules d'entrée. Comparez les TIC HLA-1-négatifs avec les cellules en vrac HLA-1-positives.</li>
	</ol></li>
	<li>Différenciation induite le long des voies mésenchymales
	<ol>
<li>Utilisez les sarcosphères formées au cours des étapes précédentes (étape 3.1.9). Transférer les sarcosphères dans une nouvelle plaque de 6 puits. Culture de la sarcosphère avec 2,5 ml d'alpha-MEM complété par 10% FBS pour laisser les cellules se fixer à la surface de la plaque de culture.</li>
		<li>Après une pièce jointe pendant deux jours, commutez le milieu de culture de l'alpha-MEM complété avec 10% FBS au mélange 1:1 d'alpha-MEM complété avec 10% FBS et le milieu de croissance de cellules souches mésenchymales humaines (hMSC).</li>
		<li>Après deux jours, passez au milieu de croissance complet de hMSC.</li>
		<li>Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, aspirez le milieu hMSC et ajoutez le milieu de différenciation. Pour la différenciation ostéogénique, ajouter le milieu de différenciation ostéogénique (milieu de croissance hMSC complété par 10 nM dexaméthasone, 5 mM de glycérophosphate, 50 g/mL d'acide ascorbique L, et 10 mM de chlorure de lithium). Pour la différenciation lipogénique, ajouter le milieu de différenciation des adipocytes (milieu de croissance hMSC complété par 0,5 M dexaméthasone, 0,5 M isobutylmethylxanthine, et 50 M indométhacine).</li>
		<li>Changer le milieu de différenciation tous les trois jours.</li>
		<li>Après trois à quatre semaines, arrêter la différenciation et laver les cellules avec PBS. Ensuite, aspirer le PBS et ajouter 2 ml de formaline de 10% aux cellules pour la fixation. Laisser les cellules s'asseoir pendant 45 min à température ambiante. Lavez-les avec de l'eau déionisée. Les cellules sont maintenant prêtes pour la coloration Alizarin Red S (étape 3.3.6.1) ou la coloration Oil Red O (étape 3.3.6.2).<ol>
<li>Pour détecter la différenciation ostéogénique, effectuer Alizarin Rouge S coloration. Aspirez l'eau et ajoutez 2 ml de solution de travail Alizarin Red S (2% Alizarin Red S, pH 6.0) aux cellules, et laissez-les s'asseoir pendant 5 min pour la coloration. Laver les cellules avec de l'eau déionisée et observer la réaction au microscope.</li>
			<li>Pour détecter la différenciation adipogénique, effectuez la coloration oil Red O.<ol>
<li>Faire une solution Oil Red O. Préparer une solution de stock en ajoutant 300 mg de poudre d'huile rouge O à 100 ml d'isopropanol.</li>
				<li>Dans un délai de 2 h avant de l'utiliser, mélanger trois parties (30 ml) de la solution de stock Oil Red O avec deux parties (20 ml) d'eau déionisée. Laisser reposer le mélange pendant 10 min à température ambiante.</li>
				<li>Filtrer la solution de travail à l'aide avant utilisation.</li>
				<li>Retirez l'eau des cellules préparées selon l'étape 3.3.6. Ajouter 2 ml d'isopropanol de 60 % pour couvrir la monocouche cellulaire et les cellules s'assoient pendant 2 min.</li>
				<li>Retirer l'isopropanol et ajouter 2 ml de solution de travail Oil Red O. Laisser reposer les cellules 5 min à température ambiante.</li>
				<li>Rincer les cellules avec de l'eau déionisée et observer la réaction au microscope léger.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li>
<li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li>
<li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+controversial+or+just+misunderstood%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li>
<li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li>
<li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Il y a plusieurs étapes critiques qui limitent le succès de ce protocole pour isoler et caractériser les cellules tumeur-initiatrices des PDX sorcées humaines. Le sarcome humain inclut beaucoup de différents sous-types. Nous avons observé que la formation de PDX est fortement dépendante des sous-types de sarcome. Sarcomes cliniques agressifs avec un phénotype histologiquement indifférencié (p. ex., sarcomes indifférenciés pléomorphes [taux de réussite 100%, n - 2], liposarcomes dédifférenciés [taux de réussite 100%, n - 2], et sarcomes synovials [ taux de réussite 100 %, n ' 3]) ont un taux de réussite élevé de la formation de PDX. Pendant ce temps, les sarcomes avec des phénotypes différenciés (p. ex., liposarcomes bien différenciés [taux de réussite de 0 %, n - 3]) montrent des taux de formation de PDX plus faibles. Il est possible que les cellules initiatrices de tumeurs soient présentes dans plus de sous-types malins à un pourcentage plus élevé que dans les sous-types moins malins et différenciés. En outre, nous recommandons de finir la procédure d'isolement cellulaire tumeur-initiateur dans un jour sans aucun arrêt pour réduire au minimum n'importe quelle perte de viabilité de cellules.
Nous avons identifié que les cellules HLA-1-négatives existent largement dans les sarcomes humains. Mais le pourcentage de cellules HLA-1-négatives peut varier entre les échantillons de différents patients. Par cette méthode, nous avons avec succès isolé les cellules tumeur-initiatrices des échantillons qui ont des cellules HLA-1-négatives s'étendant de moins de 0.5% à plus de 30%12. Il est important de caractériser les cellules HLA-1-négatives fonctionnellement par la formation de sphère et les essais de formation de tumeur pour confirmer l'identité de cellule tumeur-initiateur des cellules HLA-1-négatives isolées.
Cependant, le protocole présenté ici a aussi des limites. Les données précédentes ont prouvé que l'expression de HLA-1 est épigénétiquement réglée, qui est compatible avec l'observation de l'hétérogénéité cellulaire de l'expression de HLA-1 dans la même tumeur12. Des mutations génomiques de HLA-1 ont été détectées dans les sarcomes et d'autres types de cancer. Les mutations dans les gènes HLA-1 peuvent conduire à la perte complète de HLA-1 sur la surface cellulaire dans la tumeur entière ou à exprimer non fonctionnel s'est muté HLA-1. Dans les deux cas, la négativité HLA-1 ne peut pas être utilisée pour identifier les TIC dans la tumeur.
En utilisant HLA-1 comme marqueur négatif, nous avons réussi à isoler les TIC d'une variété de sous-types de sarcome humain et validé nos résultats par analyse fonctionnelle. Ainsi, nous avons pu effectuer des études moléculaires, y compris l'analyse de l'expression génique sur les TIC, afin de développer un traitement spécifique ciblant ces TIC.

L'hétérogénéité cellulaire intratumorale des cancers humains a été soutenue par des preuves croissantes au cours de la dernière décennie1. Semblable au tissu normal, le tissu cancéreux se compose d'une petite sous-population de TIC (également appelés cellules souches cancéreuses), qui montrent la capacité de tumeur-formation ; pendant ce temps, la majeure partie des cellules cancéreuses présentent des phénotypes différenciés2. Ces TIC montrent des propriétés de cellules souches, y compris l'expression d'un marqueur de cellules souches et la capacité de l'auto-renouvellement et la division des cellules asymétriques, et donc, peut initier la formation d'une tumeur hétérogène cellulaire3. Des études récentes ont révélé que les TIC ne sont pas seulement responsables de l'initiation tumorale, mais sont également associés à l'agressivité tumorale4, métastasie5, et la résistance aux médicaments6. Par conséquent, il est important de comprendre la biologie des TIC et, par conséquent, d'élaborer une stratégie de traitement spécifique ciblant ces TIC.
Des méthodes basées sur les FACS ont été utilisées pour identifier les TIC à l'aide de marqueurs TIC, y compris CD133, CD24 et CD441. La plupart de ces marqueurs sont également exprimés dans les cellules souches normales7. Cependant, aucun de ces marqueurs ne marque uniquement les TIC. Les rôles que ces molécules jouent dans la malignité des TIC ne sont pas encore clairs. Par exemple, CD133 peut être fréquemment inactivé par la méthylation de l'ADN, et donc, cette hétérogénéité intertumorale peut rendre la précision de ces marqueurs8. ALDH1 est un marqueur qui fonctionne également pour maintenir la tige des TICs9. Il semble être plus efficace dans l'identification des TICde cancer du sein mais est toujours discutable dans d'autres types de tumeur 9. Certaines voies de signalisation jouent un rôle important dans la biologie des cellules souches, y compris Wnt (site d'intégration sans ailes), TGF-MD (transformation du facteur de croissance bêta) et Hérisson1. Mais il est difficile de prouver que ces voies sont spécifiques aux TIC et d'utiliser l'activité de ces voies pour isoler les TIC des tumeurs primaires. Ainsi, un nouveau marqueur TIC fiable est nécessaire de toute urgence.
La classe humaine de MHC I, également appelée HLA-1, est une protéine de surface cellulaire exprimée dans presque toutes les cellules nucléées10. HLA-1 fonctionne comme un antigène présentant une molécule qui est spécifiquement reconnue par les lymphocytes T CD810. L'effet cytotoxique des lymphocytes T CD8 peut être activé lorsque les cellules cancéreuses présentent un antigène tumoral par HLA-1. Par conséquent, le manque de HLA-1 sur la surface cellulaire des cellules cancéreuses peut conduire à une évasion immunitaire des cellules T Cytotoxiques CD8. La déréglementation de HLA-1 a été décrite dans différents types de cancer humain et est corrélée avec le pronostic pauvre, la métastes, et la résistance de drogue11. Nous avons montré que la perte de l'expression HLA-1 sur la surface cellulaire peut être utilisée pour identifier les TIC dans les sarcomes, ainsi que dans le cancer de la prostate6,12.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler des TIC des PDX de sarcome humain par FACS, utilisant HLA-1 comme marqueur négatif, et pour valider et caractériser davantage ces TIC HLA-1-négatifs.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu ; m filtre de culture cellulaire</td><td>ThermoFisher</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube conique</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu ; Filtre à cellules m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polystyrène de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à fixation ultra-faible à 96 puits</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Rouge d’alizarine S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGF Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps HLA-1-PE</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>hMSC milieu de croissance</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>indométacine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>isobutylméthylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des isotypes Anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab103534</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de lithium Sigma-Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrice de membrane basale</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Alpha Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Souris NSG</td><td>The Jackson Lab</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Seringue avec aiguille</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&bêta ;-glycérophosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

L'existence et l'importance des cellules tumeur-initiatrices (TICs) ont été soutenues par l'évidence croissante au cours de la dernière décennie. Ces TIC s'est avéré être responsable de l'initiation de tumeur, de la métastasie, et de la résistance de drogue. Par conséquent, il est important de développer un traitement spécifique de ciblage des TIC en plus des stratégies de chimiothérapie actuelles, qui se concentrent principalement sur la majeure partie des non-TIC. Afin de mieux comprendre le mécanisme derrière la malignité des TIC, nous décrivons une méthode pour isoler et caractériser les TIC dans les sarcomes humains. Ici, nous montrons un protocole détaillé pour générer des xénogreffes dérivées du patient (PDX) des sarcomes humains et pour isoler les TIC par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant la classe I d'antigène de leucocyte humain (HLA-1) comme marqueur négatif. En outre, nous décrivons comment caractériser fonctionnellement ces TICs, y compris un analyse de formation de sphère et un analyse de formation de tumeur, et pour induire la différenciation le long des voies mésenchymales. L'isolement et la caractérisation des CTI PDX fournissent des indices pour la découverte de réactifs thérapeutiques de ciblage potentiels. En outre, l'évidence croissante suggère que ce protocole puisse être davantage étendu pour isoler et caractériser des TIC d'autres types de cancers humains.

Un sarcome humain PDX a été généré et taché. L'hétérogénéité intratumorale a été montrée par immunohistochimie utilisant l'anticorps de HLA-1. Le xénogreffe se composait de deux sous-populations distinctes, à savoir HLA-1 positive et négative (figure 1A)12. Le sarcome PDX a montré des similitudes histologiques avec la tumeur primaire parentale (Figure 1A). Sarcoma PDX TICs ont été isolés par FACS. À l'aide d'une méthode de tri double, les cellules HLA-1-négatives ont été fortement enrichies de la population cellulaire parentale (figure 1B)12.
Les gènes exprimés dans les cellules souches (p. ex., Oct4, Nanog et Myc) se sont avérés très exprimés dans des cellules isolées HLA-1-négatives par rapport à leur homologue HLA-1-positif (figure 1C). Sox-9, un gène du développement qui joue un rôle important dans d'autres cellules souches cancéreuses, comme dans le carcinome du sein, a été spécifiquement exprimé dans les cellules HLA-1-négatives (Figure 1D).
Pour valider la sous-population isolée HLA-1-négative, un test de formation de sarcosphère a été effectué pour examiner la capacité d'auto-renouvellement des cellules. Les cellules HLA-1-négatives ont pu former des sphères avec une entrée initiale d'aussi peu que 10 cellules (Figure 1E)12. Afin d'examiner la capacité de tumeur-formation, un assay de tumeur-formation de serial-dilution a été exécuté. Les mêmes nombres de cellules HLA-1-négatives et -positives ont été injectées sous-cutanéedans chaque flanc de la même souris. Les cellules HLA-1-négatives ont montré une capacité significativement plus élevée de formation de tumeur (Figure 1F) 12, tandis que les xénogreffes formées par les sous-populations HLA-1-négatives et -positives étaient des tumeurs hétérogènes cellulaires (Figure 1H).
Nous avons effectué une analyse d'expression génique des TIC sénérnégatifs isolés HLA-112. Les gènes associés à la différenciation normale descellules mésenchymales ont été élevés dans les TIC1. Ainsi, nous avons également examiné si Les TIC hLA-1 peuvent être induits à la différenciation terminale et ont comme conséquence une capacité diminuée de formation de tumeur. Les résultats ont montré que les cellules HLA-1-négatives peuvent être induites pour se différencier le long des voies lipogéniques et ostéogéniques et montrent forte huile rouge O et Alizarin Rouge S coloration (Figure 1G). En revanche, les cellules HLA-1-positives ne se différencient pas dans les mêmes conditions. Ainsi, ces résultats indiquent une stratégie thérapeutique différenciée prometteuse qui peut être utilisée pour cibler les TIC de sarcome.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> Figure 1 : Isolement des cellules HLA-1-négatives des PDX stératifs hétérogènes intratumoraux. (A) HLA-1-négatifs cellules (flèches) ont été trouvés dans différents sous-types de sarcomes humains par immunohistochimie (IHC). (a et b) Sarcome cellulaire clair. (c et d) Liposarcome pléomorphe. (e et f) Leiomyosarcoma. (g et h) Tumeur périphérique maligne de gaine de nerf. (i et j) Liposarcome, non spécifié autrement. (k et l) Liposarcome dédifférencié. La barre d'échelle de 100 m. (B) Les PDX de sarcome étaient histologiquement semblables à la tumeur parentale (hematoxylin et eosin [H et E] tache) et ont montré l'hétérogénéité cellulaire dans l'expression hLA-1 par IHC. Voici des images représentatives de sarcome PDXs, y compris un sarcome cellulaire clair (CCS), un chondrosarcome dédifférencié (DCS), et un liposarcome dédifférencié (DDL). Barre d'échelle de 100 m . (C) La sous-population de cellules HLA-1-négatives a été isolée par cytométrie d'écoulement avec une méthode à double tri. De haut en bas : première tri, deuxième tri et vérification de la pureté. Des cellules HLA-1-négatives et HLA-1-positives d'isolement ont été soumises à une analyse fonctionnelle suivante, y compris un test de formation de tumeur. Les résultats de ce chiffre proviennent d'une publication précédente12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> Figure 2 : Caractérisation des TIC HLA-1-négatifs par essais fonctionnels. (A) Un test de formation de sphère a montré que seulement 10 cellules HLA-1-négatives étaient capables de former des sphères de sarcome. Gauche : photos représentatives des sphères de sarcome. Droite : fréquence de formation de sphère ; moyenne - Barre d'échelle DeD. 100 m. (B) Les cellules HLA-1-négatives isolées du sarcome PDX étaient fortement tumorigènes. Voici montré sont des images représentatives de la tumeur formée par HLA-1-négatif et -cellules positives de DDL. Un millier de cellules de cellules HLA-1-négatives et HLA-1-positives d'DDL ont été injectées dans les flancs séparés de la même souris. (C) Les niveaux d'ARNm des gènes de cellules souches Oct4, Nanog, et Myc ont été exprimés à des niveaux plus élevés dans les cellules HLA-1-négatives par rapport aux cellules HLA-1-positives. Les données représentent la moyenne de La DD (n '5). (D) Forte coloration positive de l'huile rouge O et Alizarin Red S montre une différenciation terminale le long des voies lipogéniques et ostéogéniques qui sont induites par le sarcome TICs. (E) HLA-1 immunostaining of PDXs formed by HLA-1-positive (left) and -negative (right) subpopulations. Barre d'échelle de 100 m. Les résultats de ce chiffre proviennent d'une publication précédente12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Nous décrivons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules tumeur-initiatrices des xénogreffes patient-dérivées humaines par le tri de cellules fluorescence-activé, utilisant l'antigène humain de leucocyte-1 (HLA-1) comme marqueur négatif, et pour la validation plus loin et caractérisation de ces cellules HLA-1-négatives de tumeur-initiateur.

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Nous avons découvert que HLA-I est épigénétiquement vers le bas réglé dans une sous-population de cellules cancéreuses qui présentent des propriétés de cellules souches et la capacité tumorale-initiation. La downregulation HLA-I est directement liée à l’évasion immunitaire, offrant des avantages de survie pour les cellules souches cancéreuses, faisant ainsi de la négativité HLA-I un marqueur fonctionnel précis pour ces cellules. Sudeh Izadmehr, postdoc de notre laboratoire, démontrera la procédure.Lors de l’acquisition de l’échantillon, placer le tissu dans une boîte petri de 100 millimètres dans un armoire de biosécurité stérilisée, et ajouter 500 microlitres de PBS stérile au plat. Utilisez un scalpel stérile pour triturer mécaniquement le tissu en petits morceaux jusqu’à ce qu’aucun fragment ne soit plus grand que 0,1 millimètre. Transférer l’ensemble du volume de 500 microlitres de PBS à travers une passoire à cellules pores de 35 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.Ajouter encore 500 microlitres de PBS aux fragments de tissu, et hacher les tissus à nouveau. Filtrez ensuite le supernatant à travers la passoire cellulaire dans le même tube de collecte, et continuez à hacher les morceaux de tissu jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement dissocié. Lorsque le dernier volume de cellules a été recueilli, faites tourner les cellules tumorales par centrifugation, et suspendez la pastille en cinq millilitres de tampon d’hémolyse.Après cinq minutes à température ambiante, recueillir les cellules avec une autre centrifugation, et laver la pastille avec un autre cinq millilitres de PBS. Suspendez à nouveau la pastille en un millilitre de PBS et comptez les cellules viables. Diluer les cellules à une fois 10 à la septième cellule par 200 microlitres de concentration de PBS sur la glace, et ajouter 200 microlitres de matrice membranaire sous-sol aux cellules avec un mélange doux.Injectez ensuite la matrice membranaire de suspension-sous-sol cellulaire sous-cutanée dans le flanc d’une souris gamma scid nod, et vérifiez la croissance de la tumeur au site d’injection deux fois par semaine. Quand la tumeur atteint un centimètre de diamètre, coupez la tumeur en deux, et fixez la moitié de la xénogreffe avec 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’analyse histologique. Traiter la deuxième moitié de la tumeur comme vient de démontrer pour atteindre une suspension cellulaire unique, et diluer les cellules à deux fois 10 aux six cellules par millilitre de PBS complété avec 5% de concentration de FBS.Maintenir les cellules sur la glace pendant 30 minutes avant de diviser la suspension cellulaire entre un contrôle de l’isotype et un tube d’anticorps. Notez le nombre de cellules dans chaque tube, et mélangez les cellules dans le tube d’anticorps avec l’anticorps anti-HLA et les cellules dans le tube de commande d’isotype avec un anticorps approprié de contrôle d’anti-isotype pour une incubation de 90 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, recueillir les deux populations cellulaires par centrifugation, suivie de deux lavages PBS de 10 millilitres par centrifugation.Après le deuxième lavage, suspendre à nouveau les granulés dans 10 microgrammes par millilitre de DAPI à une concentration une fois 10 à sept cellules par millilitre de concentration. Filtrez ensuite chaque suspension cellulaire à travers une passoire pore de 35 micromètres en tubes individuels de polystyrène de 12 par 75 millimètres. Après le tri cellulaire activé par fluorescence, diluer les populations de cellules négatives et positives HLA-I à des concentrations individuelles de 10 à 5 cellules dans 15 millilitres du milieu de croissance de la sarcoosphère par sous-ensemble.Diluer périodiquement les cellules à une fois 10 à la quatrième, 10 à la troisième, et 10 à la deuxième concentrations dans 15 millilitres de moyenne de croissance de la sarcoosphère fraîche par dilution, et ajouter 100 microlitres de cellules de chaque dilution à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire d’attachement ultra-faible de 96 puits par dilution. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius et de dioxyde de carbone, surveillez quotidiennement la formation de la sarcoosphère par microscopie légère et ajoutez à chaque puits un facteur de croissance fibroblaste de base frais et un facteur de croissance épidermique sans changer le milieu tous les trois jours. Après trois semaines, comptez le nombre de puits sarcosphère-positifs et sarcosphère-négatifs pour chaque dilution cellulaire des cellules HLA-I-négatives et HLA-I-positives pour permettre le calcul de la fréquence cellulaire de formation de sphère basée sur une distribution de probabilité de Poisson.Typiquement, les xénogreffes humaines patient-dérivées de sarcome se composent de deux populations hLA-I-positives et négatives distinctes, avec une histologie semblable à celle démontrée par la tumeur primaire parentale. Le tri cellulaire activé par fluorescence des cellules tumorales xénogreffes dérivées du sarcome, tel que démontré, facilite l’enrichissement d’un grand nombre de cellules négatives HLA-I de la population de cellules parentales. Les cellules HLA-I-négatives sont capables de former des sphères avec une entrée initiale d’aussi peu que 10 cellules et présentent une capacité de formation tumorale plus élevée que le patient de sarcome HLA-I-positif est arrivé xenograft cellules tumorales-initiation.L’injection du même nombre de cellules négatives et positives HLA-I sous-cutanées dans les flancs opposés de la même souris démontre que les cellules négatives HLA-I possèdent une capacité de formation tumorale significativement plus élevée. Tandis que les xénogreffes formées par les sous-populations négatives et positives de HLA-I sont des tumeurs cellulairement hétérogènes. En outre, l’analyse d’expression génique des cellules tumorales révèle que les cellules HLA-I-négatives expriment des marqueurs de différenciation des cellules souches et peuvent être induites à se différencier le long des voies lipogènes et ostéogéniques, démontrant une forte coloration et une culture oil-red-o et alizarin-rouge-s.Cette méthode peut être utilisée pour isoler les cellules souches cancéreuses dans divers cancers humains. La carbonisation moléculaire, par exemple, par séquençage de prochaine génération peut révéler des marqueurs communs pour cibler les cellules thérapeutiquement. Notre découverte démontre que la restauration de HLA-I est une étape critique pour le succès des stratégies fonctionnelles d’augmentation des cellules immunitaires.

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Découvrez l'isolement des cellules initiatrices de tumeurs par tri cellulaire à fluorescence dans les xénogreffes de sarcome. Cette méthode utilise le marqueur HLA-I négatif pour identifier les cellules souches cancéreuses et leurs propriétés différenciatives.

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