Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

L’objectif global de cette procédure est de cultiver des cerveaux de larves de drosophile pour la microscopie à fluorescence de plusieurs jours. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogénétique de la drosophile, telles que les changements d’expression génique qui se produisent dans des populations neuronales spécifiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’imager des sondes fluorescentes à une résolution de cellule unique dans le cerveau vivant pendant des heures ou des jours.

Lors de la préparation des réactifs pour cette procédure, travaillez sous une hotte de culture. Une aliquote de milieu SAM et de thrombine doit être décongelée pour commencer. Mettez de côté la thrombine.

Prenez une aliquote de 2,5 millilitres de SAM, mettez le reste de SAM sur de la glace et mettez-le de côté. Ensuite, mettez la pénicilline streptomycine dans le SAM aliquote et conservez-le à température ambiante. Pour les expériences d’imagerie à long terme, préparez une chambre d’imagination, appliquez de la graisse sous vide autoclavée sur les zones plastiques autour du puits d’une parabole à fond de verre.

Stérilisez ensuite le plat graissé avec de la lumière UV sous la hotte. Maintenant, mélangez une aliquote de SAM dans le fibrinogène et transférez le mélange à 37 degrés Celsius, où il ne polymérisera pas pendant deux heures. Pour la dissection, nettoyez la pince dans deux boîtes de dissection en verre à trois puits avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, chargez quatre puits avec 400 microlitres de DSS et un puits avec 400 microlitres de SAM. Conservez les plats de dissection sur une plaque réfrigérée. À partir d’une fiole de mouches en propagation, prélevez un milieu contenant des larves non errantes du troisième stade et transférez-en jusqu’à sept avec des pinces dans un puits de DSS froid.

Ensuite, faites passer les larves dans trois des quatre puits chargés de DSS pour les nettoyer. Laissez-les dans le dernier puits jusqu’à ce qu’elles soient disséquées. Utilisez le quatrième puits de DSS pour disséquer les cerveaux larvaires à l’aide d’une paire de pinces fines et propres.

Utilisez la méthode bien établie de l’intérieur vers l’extérieur. Avec de l’habileté, chaque larve peut être traitée en 30 secondes environ. Après chaque dissection, utilisez une pointe de pipette de 20 microlitres pré-rincée avec du DSS pour transférer le cerveau dans environ trois microlitres de DSS dans le puits rempli de SAM.

Préparez jusqu’à sept cerveaux pour la procédure d’intégration. Après avoir transféré le cerveau dans une solution de travail, distribuez le cerveau et le milieu sur le couvercle d’une boîte de Pétri stérile. Ensuite, ajoutez 3,5 microlitres de SAM avec des antibiotiques et ajoutez 3,5 microlitres de SAM chaude avec du fibrinogène.

Il est important de maintenir le milieu SAM avec du fibrinogène à 37 degrés tout au long de la procédure. Ensuite, mélangez la solution autour du cerveau en pipetant doucement avec la même pointe de pipette et aspirez deux microlitres de la solution à déposer sur une lamelle pour un plat à fond de verre. Ajoutez ensuite 0,8 microlitre de thrombine à la gouttelette et mélangez très rapidement pour initialiser la polymérisation qui apparaîtra blanche.

Ensuite, à l’aide d’une pince, vous pouvez saisir doucement le cerveau et le placer sur la matrice de fibrine en polymérisation. Je pense que la thrombine, après que le cerveau a été transféré à la gouttelette, n’est pas recommandée, car elle complique une grande partie de la procédure. Orientez le cerveau au besoin et poussez-le très doucement aussi près que possible de la lamelle.

Ensuite, prélevez une couche de fibrine polymérisée et pliez-la sur le cerveau en utilisant de petits mouvements doux qui ne détachent pas la matrice. Continuez à replier des couches de fibrine polymérisée sur le cerveau à partir de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau. Déposez ensuite 20 microlitres de SAM avec des antibiotiques sur le cerveau intégré pour arrêter l’activité de la thrombine.

En utilisant cette procédure, procédez à l’intégration de cinq à six cerveaux dans un plat à fond de verre. Pour l’imagerie à long terme, immergez les cerveaux encastrés dans 600 microlitres de SAM avec des antibiotiques. Posez ensuite un morceau de membrane PTFE sur le support et collez les bords de la membrane sur les parties graissées du plat.

Pour des tests courts, remplissez la boîte avec deux millilitres de SAM avec des antibiotiques, en immergeant le cerveau et en omettant l’utilisation de la membrane PTFE. À l’aide des procédures décrites, des cerveaux exprimant un rapporteur d’horloge moléculaire piloté par un pilote de neurone d’horloge ont été entraînés dans la lumière-obscurité puis préparés sous forme de cultures d’explants. Les cultures à long terme ont été mises en place pendant la phase de lumière, juste avant la tombée de la nuit.

Une pile SUM contenant le neurone d’intérêt a été créée dans l’intensité moyenne de fluorescence de la zone correspondant au neurone a été mesurée après soustraction du bruit de fond. Pour déterminer la rythmicité de l’expression du rapporteur, l’analyse spectrale de l’entropie maximale et l’inspection manuelle ont été utilisées. Ensuite, des larves du même génotype ont été disséquées soit une heure après l’aube subjective, soit une heure après le crépuscule subjectif.

Les cerveaux ont été imagés deux fois en l’espace d’une heure pour obtenir une base de référence. Ensuite, un PDF ou un véhicule a été ajouté au milieu de culture et les cerveaux ont été imagés toutes les heures pendant six heures. Dans les cerveaux prélevés peu de temps après la tombée de la nuit, le profil d’expression PER-TDT dans LNvs a montré une augmentation de l’intensité de fluorescence en fonction du moment de la journée lors de l’ajout de PDF.

Cela s’est également produit dans les DN1 et, dans une moindre mesure, sur les DN2. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire une culture cérébrale ex vivo à partir de larves de drosophile à l’aide d’une matrice 3D de fibrine. Une fois maîtrisée, l’ensemble de la procédure dure environ 30 minutes, de la dissection à l’emboîtement.

Avant de commencer les dissections, préparez la configuration d’imagerie afin que le cerveau puisse être imagé immédiatement après l’intégration. À la suite de cette procédure, des cerveaux de drosophiles adultes peuvent également être cultivés pour l’imagerie en accéléré par fluorescence afin de répondre à des questions supplémentaires.