Immunoprécipitation de la chromatine native à l’aide de Neurospheres de tumeur de cerveau murin

L’objectif global de cette procédure est d’identifier l’enrichissement des marques d’histones dans un emplacement génomique spécifique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique, telles que l’impact des mutations dans les régulateurs épigénétiques qui modifient les modifications des histones sur le transcriptome des cellules tumorales. Le principal avantage de cette technique est que les cellules ne sont pas réticulées, elles sont donc dans un état plus naturel, ce qui peut favoriser la spécificité des anticorps.

Commencez par disséquer la tumeur induite expérimentalement à partir du cerveau d’une souris dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Si la tumeur exprime une protéine fluorescente, visualisez la tumeur à l’aide d’un microscope de dissection fluorescent réglé sur le canal fluorescent approprié avec un grossissement de 0,3 fois. Utilisez un scalpel et une pince pour séparer le tissu tumoral du cerveau normal et coupez la tumeur en petits morceaux dans la boîte de Pétri.

Transférez la tumeur disséquée dans un tube de 1,5 millilitre avec 300 microlitres de milieu NSC et utilisez une seringue jetable pour homogénéiser doucement la tumeur. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de détachement cellulaire et incubez l’échantillon pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Ensuite, lavez la passoire avec 25 millilitres de milieu NSC et centrifugez la suspension à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir transvasé le surnageant, remettez la pastille en suspension dans six millilitres de milieu NSC et transférez la suspension de cellules tumorales dans une fiole de culture T25. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire avec une atmosphère de 95 % d’air et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les neurosphères se forment.

Une fois les neurosphères récoltées, centrifugez une fois 10 pour les six cellules de la neurosphère par précipitation d’acides aminés à 300 fois G pendant cinq minutes. Après la centrifugation, décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille de neurosphère dans un millilitre de solution saline équilibrée. Transférez la suspension dans des micro-tubes de centrifugation de 1,5 millilitre à faible liaison protéique, puis centrifugez comme précédemment.

Ensuite, décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 95 microlitres de tampon de digestion, complété de un à 100 avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase par une fois 10 les six cellules. Pipetez immédiatement les cellules de haut en bas pour éviter qu’elles ne s’agglutinent et ne créent pas de bulles. Ensuite, mélangez cinq microlitres de nucléase micrococcique 0,1X dans 145 microlitres de tampon de digestion et ajoutez cinq microlitres de nucléase micrococcique diluée par une fois 10 aux six cellules.

Agitez le tube pour mélanger et placez le tube dans un bloc de chaleur de 37 degrés Celsius pendant exactement 12 minutes. La digestion des nucléases micrococciques pour fragmenter la chromatine est l’étape la plus critique. Une bonne fragmentation de la chromatine est importante pour obtenir une résolution élevée pour la ChIP.

Pour vous assurer que l’étape est réussie, incubez plusieurs échantillons un à la fois pour éviter une surdigestion. Après 12 minutes, ajoutez 10 microlitres de tampon d’arrêt des nucléases micrococciques 10X par une fois 10 aux six cellules. À partir de ce moment, les échantillons doivent être conservés sur de la glace.

L’analyse par bioanalyseur de l’échantillon de nucléase micrococcique digéré démontre que la majeure partie de l’ADN a été fragmentée en mononucléosomes mono, di et tri. Ensuite, ajoutez 110 microlitres de tampon 2X ripa complété un à 100 avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase par une fois 10 aux six cellules. Agitez le tube pour mélanger, puis centrifugez pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius en 1700 fois G.Transférez le surnageant qui contient la chromatine dans un micro-tube de centrifugation ordinaire de 1,5 millilitre et placez-le sur de la glace.

Utilisez un tampon de ripa complété par des inhibiteurs de protéase à une dose de un à 1000 pour diluer la chromatine, de sorte que chaque PI ait un volume de 100 à 200 microlitres. Ensuite, prélevez une aliquote équivalente à 10 % du volume ChIP comme échantillon d’entrée. Préparez l’entrée en ajoutant 100 microlitres de tampon TE complété par la protéinase K, et incubez à 55 degrés Celsius pendant une heure.

Après avoir purifié l’entrée avec un kit de purification PCR, mesurez la concentration de l’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. Enregistrez les résultats dans un carnet. Ajouter 10 microlitres de billes magnétiques de protéines A et G lavées par IP qui seront effectuées sur chaque échantillon, et incuber pendant une heure à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min.

Placez l’échantillon sur un support magnétique et laissez les billes se séparer, puis transférez le volume requis dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez l’anticorps souhaité dans chaque tube, puis enveloppez les capuchons d’un film de paraffine plastique pour éviter l’évaporation. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec rotation comme précédemment.

Le lendemain, faites tourner les tubes à 2000 fois G pendant 10 secondes, puis ajoutez 10 microlitres de billes à chaque IP et incubez pendant 3 heures à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 RPM. Ensuite, placez les échantillons sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. À l’aide d’une pipette, retirez le surnageant, puis ajoutez 150 microlitres de tampon de ripa avec des inhibiteurs de protéase à chaque IP et incubez à 4 degrés Celsius à 20 tr/min pendant cinq minutes.

Après la période d’incubation, placez les échantillons sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. À l’aide d’une pipette, retirez le surnageant, puis ajoutez 150 microlitres de tampon de chlorure de lithium complété par des inhibiteurs de protéase à faible concentration à chaque IP, et incubez à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min pendant cinq minutes. Après la période d’incubation, placez les échantillons sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer, puis utilisez une pipette pour retirer le surnageant.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de TE froid sans inhibiteurs de protéase aux billes et incubez à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min pendant cinq minutes. Après l’étape finale de lavage, remettre l’échantillon en suspension dans 100 microlitres de tampon TE complété par la concentration finale de 0,5 milligramme par millilitre de protéinase K, et incuber à 55 degrés Celsius pendant une heure. Enfin, purifiez l’ADN précipité à l’aide d’un kit de purification PCR.

Ensuite, pour vérifier si l’IP est réussie, effectuez une qPCR avec des amorces ciblées sur les régions de contrôle positives et négatives. La qPCR a été réalisée avec de l’ADN ChIP IGG, de l’ADN ChIP histone-3-lycène-4-triméthylé et de l’ADN ChIP histone-3-lycène-27-thriméthylé, en utilisant des amorces pour la glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase. Des résultats représentatifs démontrent que Gapdh, un gène de ménage, n’est enrichi qu’avec la modification H3K4me3 associée à la transcription active, et non avec la modification H3K27me3 associée à la chromatine réprimée.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme la ChIP-C peuvent être effectuées afin d’identifier les changements dans les marques d’histones, à l’échelle du génome. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la ChIP native dans les neurosphères pour identifier la marque d’histones à des sites génétiques spécifiques.