Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison

L’objectif global de la fonctionnalisation chimique de la surface des nanoparticules de VHE est de fournir une approche reproductible et cohérente pour la conjugaison des molécules immunogènes, thérapeutiques et diagnostiques ciblées à la surface des nanoparticules de VHE à des fins de diagnostic et de traitement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanomédecine, telles que la manière dont le ciblage amélioré du cancer et la distribution des nanothérapies peuvent être surveillés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est hautement reproductible, efficace et beaucoup plus facile à réaliser que de générer du génie génétique.

Michelle Nguyen et Ivan Ruiz, assistants de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration des procédures. Commencez ce protocole par la production et la purification de nanoparticules du virus de l’hépatite E, comme décrit dans le protocole textuel. Diluez les échantillons de nanoparticules HEV entre 0,5 et deux milligrammes par millilitre avec une MES de 10 millimolaires, pH 6,2 pour une imagerie TEM.

Ionisez les grilles recouvertes de carbone avec une décharge luminescente de 40 milliampères pendant 30 secondes pour produire une surface de carbone hydrophile. La surface en carbone hydrophile des grilles ne peut durer que 30 minutes après le traitement de décharge luminescente. Après l’ionisation, tenez la grille et la pince à épiler et ajoutez deux microlitres de l’échantillon de nanoparticules HEV à la grille.

Après 15 à 30 secondes, épongez la grille avec du papier filtre. Ensuite, lavez immédiatement la grille avec de l’eau double distillée et épongez à nouveau avec du papier filtre. Ajoutez immédiatement deux microlitres d’acétate d’uranyle à deux pour cent à la grille.

Après 15 secondes, épongez la grille avec du papier filtre. Séchez les grilles d’échantillonnage en les plaçant dans une armoire sèche de déshumidificateur électronique pendant la nuit. Selon l’échantillon, la microscopie électronique cryogénique ou cryo-EM peut être nécessaire pour la visualisation et la caractérisation de la structure.

Transférez la grille dans un MET et une image à un grossissement de 10 à 80 K. Les nanoparticules HEV apparaissent dans le TEM sous la forme de protéines icosaédriques vides d’environ 27 nanomètres de diamètre en raison de l’absence d’ARN viral. Pour effectuer la conjugaison en une étape des nanoparticules HEV et de la biotine liée au maléimide, appliquez d’abord les nanoparticules HEV à des mini-unités de dialyse.

Dialyser les nanoparticules contre 0,01 molaire PBS pH 7,4 à température ambiante pendant une heure selon le protocole du fabricant. Après la dialyse, transférez les nanoparticules HEV dans des tubes de 1,5 millilitre et mesurez la concentration en protéines à 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Mélangez les nanoparticules à raison d’un milligramme par millilitre avec une quantité égale de 100 micromolaires de biotine de maléimide et de 0,01 molaire de PBS pH 7,4 pour obtenir un rapport de une à cinq molaires.

Après avoir réagi toute la nuit à quatre degrés Celsius, retirez la biotine maléimide non liée à l’aide d’une procédure de colonne de dessalage par centrifugation conformément au protocole du fabricant. Analysez les échantillons à l’aide d’une page de réduction de données de sécurité standard. À l’aide des procédures standard, préparer un transfert Western chimiluminescent à l’aide de streptavidine liée à la HRP et capturer le signal chimiluminescent à l’aide d’une pellicule radiographique.

Pour effectuer la conjugaison en deux étapes du ligand spécifique des cellules cancéreuses du sein, LXY30, pour faire apparaître la cystéine exposée sur des nanoparticules HEV, appliquez d’abord les nanoparticules sur des mini-unités de dialyse et dialysez contre 0,01 molaire PBS pH 7,4 à température ambiante pendant une heure. Transférez ensuite les nanoparticules HEV dans des tubes de 1,5 millilitre et mesurez la concentration de protéines à 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, combinez 650 micromolaires d’azoture de maléimide et 650 micromolaires d’alcyne LXY30 avec 200 micromolaires de sulfate de cuivre et un millimolaire d’acide ascorbique.

Cela forme un LXY 30 lié au maléimide à 650 micromolaires. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, mélangez les nanoparticules HEV à un milligramme par millilitre avec environ 10 % du volume de LXY 30 lié au maléimide pour obtenir un rapport de une à trois molaires.

Réagissez pendant la nuit à quatre degrés Celsius. En raison de la concentration relativement élevée de maléimide LXY 30, les concentrations finales des réactifs tels que le sulfate de cuivre sont réduites environ 10 fois après le mélange. Pour éviter qu’elles ne soient endommagées par les nanoparticules du virus de l’hépatite E, une autre option est la méthode d’apport sans cuivre.

Retirez le maléimide LXY 30 à l’aide d’une colonne de dessalage par centrifugation conformément au protocole du fabricant. Maintenez les nanoparticules HEV liées à LXY 30 à quatre degrés Celsius. Pour effectuer la conjugaison en une étape des nanoparticules LXY 30 HEV et de l’étiquette fluorescente Cy5.5, mélangez d’abord les nanoparticules liées à LXY 30 à un milligramme par millilitre avec un volume égal d’étiquette fluorescente Cy5.5 pour obtenir un rapport molaire de une à cinq.

Après avoir fait réagir le mélange pendant une nuit à quatre degrés Celsius, retirez le Cy5.5 NHS non lié avec une procédure de colonne de dessalage par centrifugation conformément au protocole du fabricant. Maintenez les nanoparticules HEV liées à LXY 30 Cy5.5 à quatre degrés Celsius. Deux méthodes ont été tentées pour la fonctionnalisation LXY 30 des nanoparticules HEV pour le ciblage des cellules tumorales.

Lorsque les nanoparticules HEV 573C ont été liées à l’azoture de maléimide en premier, suivie d’une réaction chimique click à l’alcyne LXY 30, les nanoparticules HEV 573C ont semblé se désassembler sous observation TEM. Cependant, une réaction chimique initiale entre l’alcyne LXY 30 et l’azoture de maléimide pour former un LXY 30 lié au maléimide, suivie d’une conjugaison pour aider les nanoparticules HEV modifiées n’a pas affecté sa structure et les nanoparticules HEV 573C sont restées intactes. Des nanoparticules HEV liées à LXY 30 et Cy5.5 ont été appliquées sur des cellules cancéreuses du sein en culture et observées par microscopie confocale.

Les images de fluorescence dans le proche infrarouge par microscopie confocale indiquent que les nanoparticules HEV liées à LXY 30 Cy5.5 avaient une affinité de liaison plus élevée pour une internalisation accrue dans les cellules cancéreuses du sein MDA MB 231 par rapport aux nanoparticules HEV liées à Cy5.5. Les implications de cette technique s’étendent à l’examen du ciblage multimodal et des molécules thérapeutiques qui permettent un ciblage et un diagnostic précis de la tumeur sans endommager les cellules normales. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le ciblage du cancer et des tumeurs grâce à la modulation chimique de surface, elle peut être appliquée au diagnostic précoce du cancer, au dépistage et au traitement guidé par imagerie.