Name: Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez la photoconversion cellulaire chez le poisson zèbre intact pour visualiser la migration de cellules uniques. Cette méthode minimalement invasive permet d'étiqueter des cellules spécifiques et d'étudier la dynamique cellulaire en temps réel.

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Nous remercions les membres du laboratoire Smith pour leurs commentaires utiles et les conseils de réactif, Sam Connell et Brent Redford de 3i pour mise en service d’imagerie questions et Deborah Bang, Karen Heed et Kay Stewart pour les soins de poisson-zèbre et Bernard Kulemaka. Ce travail a été soutenu par l’Université de Notre Dame, le Elizabeth et Michael Gallagher Family, l’Alfred P. Sloan Foundation, Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de notre-Dame et le Centre des cellules souches et médecine régénérative à l’Université de Notre Dame. Toutes les études animales ont été effectuées dans le respect de l’Université de Notre Dame IACUC au docteur Cody Smith.

Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université de Notre Dame institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.
1. préparation de l’éprouvette de poisson-zèbre
<ol><li>Placez un mâle adulte et un adulte femelle Tg (protéine convertible) dans une chambre accouplement par procédures standard13. Dans ce manuscrit, utilisez Tg(sox10:eos) poisson9 en raison de l’accès mais autres lignées transgéniques avec les protéines et peut être utilisée indifféremment. Mis en place plus d’une chambre dans le cas où ne pas placer de poissons. Laissez le poisson à rester dans la salle pendant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain matin, ramasser les œufs dans des boîtes de Petri de 100 mm. Laisser les oeufs à maturité à la fertilisation après 24h (hpf) avant de dépistage.</li>
	<li>Si les animaux ci-dessus est hétérozygotes pour le transgène, plats hpf écran 24 pour les embryons Tg(sox10:eos) + avec un 488 nm source lumineuse et GFP filtrent ensembles sur un microscope à dissection. Isoler les embryons Tg(sox10:eos) + et laisser pour mûrir à 48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate embryons manuellement avec une aiguille ou une pince à épiler.</li>
	<li>Préparer et chauffer 5 mL de solution de gel d’agarose point bas point de fusion 0,8 %.<ol>
<li>Une fois que l’agarose est froid au toucher, placer 3-4 Tg anesthésiés (sox10:eos) + 48 Pétri de fond de poisson hpf au centre d’une lamelle de verre de 10 mm.</li>
		<li>Ajouter assez d’agarose pour couvrir la surface de la lamelle, environ 1 mL. Utilisez une aiguille sonde pour disposer les poissons sur leurs côtés. Permettre d’agarose solidifier pour assurer le montage des animaux. Il peut être nécessaire de continuellement ré-arranger le poisson-zèbre, jusqu'à ce que l’agar solidifie14. Solidification prend environ 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une fois l’agarose a solidifié pendant 2 min, ajouter lentement milieu d’embryon contenant 0,02 % acide aminobenzoïque ester (tricaïne) à plat jusqu'à ce que la surface inférieure de l’agar et le plat est immergée. Cela devrait être environ 3mL.</li>
</ol>2. microscope montage et imagerie de pré-conversion
<ol><li>Ouvrez le logiciel confocal et sélectionner les fenêtres de capture et de mise au point [Figure 1]. Sous la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifiques lab sous la capture réglage menu déroulant onglet [Figure 1]. Ici, le paramètre de laboratoire spécifique est appelé «poisson Imaging. »</li>
	<li>Placer l’échantillon sur la portée confocale et donner le focus à l’aide de cours et les boutons de réglage fin.</li>
	<li>Ouvrez la fenêtre de discussion et localiser la région souhaitée d’intérêt (c.-à-d. les ganglions rachidiens).</li>
	<li>Sélectionnez le laser c488 sous le menu filtre défini. Régler l’exposition à 300 ms, laser de puissance à 5 et intensifier à 75 [Figure 2].</li>
	<li>Cocher la case 3D sous la section type de capture . Dans la section Capture 3D , sélectionnez utiliser la position actuelle et vérifier la plage autour de courant. Dans la même section, définissez la plage à 35 le nombre d’avions à 36 et la taille de palier 1. La gamme peut être augmentée ou diminuée pour tenir compte de la profondeur de la zone d’imagerie. Pour la moelle épinière, une valeur de plage entre 35-40 piles est généralement suffisant [Figure 5].</li>
	<li>Sélectionnez l’emplacement actuel [Figure 5].</li>
	<li>Cliquez sur Démarrer en bas de la fenêtre de capture, d’acquisition d’image.</li>
</ol>3. cellule unique Photoconversion
<ol><li>Ouvrez le logiciel confocal et sélectionner les fenêtres de capture et de mise au point [Figure 1]. Sous la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifiques lab sous la capture réglage menu déroulant onglet [Figure 1]. Ici, le paramètre de laboratoire spécifique est appelé « Poisson ablation complète puce. »</li>
	<li>Sélectionnez le laser c488 et c541 sous le menu filtre défini. Si ce n’est pas le cas, en utilisant le même logiciel de microscope, trouver le menu pour sélectionner les différents lasers et de sélectionner les 488 nm et de 541 nm lasers. Définir les expositions à 300 ms, laser de puissance à 5 et intensifier à 75 [Figure 2]. Ces paramètres laser seront choisis sur la production assez signal fluorescent sans causer de photoblanchiment ou toxicité. Si toxicité ou photoblanchiment est visualisé, réduire la puissance laser ou l’exposition.</li>
	<li>Ouvrez la fenêtre de discussion et cliquez sur l’onglet photomanipulation dans la fenêtre de discussion. Ajuster les paramètres du laser en conséquence. Changer la puissance du laser pile à 2 et puis cliquez sur OK. Changer la taille du bloc Raster à 1, puis cliquez sur définir. Changer la taille de double-clic à 4. Remplacez la ligne laser v405 [Figure 3].</li>
	<li>Ouvrez les paramètres avancés de capture dans la fenêtre de capture. Sélectionnez l’onglet photomanipulation et définissez les répétitions de double-clic sur 2. Cliquez sur OK [Figure 4].</li>
	<li>Sélectionnez l’onglet XY dans la fenêtre de discussion. Vérifiez les paramètres du laser de l’étape 2 dans l’onglet photomanipulation [Figure 3, Figure 4]. Définir les paramètres de laser à photoconvert la cellule des intérêts sans photoconversion des cellules environnantes.<ol>
<li>Se photoconversion de cellules adjacentes, réduire la puissance du laser. Si photoconversion des cellules ne se produit pas, les puissances de laser peuvent être augmentées. La valeur optimale, puissance du laser photoconvert seule de la région d’intérêt et ne pas les régions avoisinantes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cochez la case timelapse sous type de capture. Puis, cliquez sur Démarrer [Figure 6].</li>
	<li>Une fois que la fenêtre de timelapse direct s’ouvre, sélectionnez l’outil cercle sur la barre d’outils supérieure [Figure 7]</li>
	<li>Tracez un cercle dans la région centrale de la cellule. Cliquez avec le bouton droit sur le cercle dessiné, sélectionnez la région FRAPet attendre 3 secondes. La zone sélectionnée doit devenir gradateur [Figure 8]. Cliquez sur arrêter la capture.</li>
	<li>Si plus d’un animal de l’imagerie, revenir à l’onglet XY dans le menu de mise au point et sélectionnez position 2. Ensuite, répétez les étapes 4.1 à 4.6.</li>
	<li>Pour convertir une population de cellules, suivre les paramètres de protocole et laser pour obtenir la procédure 4.1 à 4.4 sauf au lieu de dessiner un cercle pour FRAP la région d’intérêt, utilisez l’outil en ligne. Tracez une ligne sur la région d’intérêt et FRAP la région en utilisant les mêmes paramètres énumérés ci-dessus.</li>
</ol>4. post-photoconversion Imaging
<ol><li>Une fois que tous les points sont photoconverted. Sélectionnez la pile d’image standard de laboratoire spécifiques définissant décrit dans la precoversion d’imagerie étape 3. Cela se trouve sous la capture définissant le menu déroulant onglet dans la fenêtre de capture [Figure 5].</li>
	<li>Sélectionnez le laser c488 et régler l’exposition à 300ms, puissance 5 laser et intensifier à 75 [Figure 2].</li>
	<li>Sélectionnez le laser c541 trouvé sous le même menu que le laser c488. Régler l’exposition à 500 ms, puissance de 10 de laser et d’intensifier à 75 [Figure 9].</li>
	<li>Cocher la case 3D sous la section type de capture . Dans la section Capture 3D , sélectionnez utiliser la position actuelle et vérifier la plage autour de courant. Dans la même section, définissez la plage à 35 le nombre d’avions à 36 et la taille de palier 1. Le numéro de série peut augmenter ou diminuer pour s’adapter à la profondeur désirée d’imagerie [Figure 5].</li>
	<li>S’il y a plusieurs points dans l’onglet de discussion XY, sélectionnez l’option liste multipoint dans la fenêtre de capture. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez l’emplacement actuel.</li>
	<li>Cliquez sur Démarrer en bas de la fenêtre de capture, d’acquisition d’image.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans les tissus complexes, différents types de cellules organisent dans des domaines spécifiques. Récemment, des techniques ont été utilisées pour marquer les cellules individuelles au sein de ces tissus de grandes structures1,2,3. Nous démontrons ici deux techniques qui peuvent de même être utilisées pour visualiser les interactions cellulaires unique et interactions entre population de cellules dans les tissus complexes. L’ava...

Plusieurs cellules distinctes interagissent pour construire et entretenir des tissus animaux et végétaux complexes. Ces cellules sont souvent intercalés et difficiles à distinguer des voisins au niveau unicellulaire sans microscopie haute résolution qui nécessitent la fixation du tissu. Cependant, pour comprendre comment ces forment les tissus, sont maintenus et deviennent malades, il a été essentiel pour étudier comment simple cellules dans les tissus sont en interaction avec le temps. Idéalement, ces expériences exigent l’étiquetage des cellules individuelles au sein d’un tissu, d’une manière non invasive sans l’exigence de fixation. Les scientifiques ont maintenant développé de nombreuses techniques pour accomplir cette tâche1,2,3,4.
La découverte et la mise en œuvre de la protéine fluorescente méduse verte (GFP) était une approche passionnante qui a permis pour l’étiquetage des cellules distinctes dans un tissu environnement1. À l’aide de promoteurs spécifiques des cellules, il est possible de sélectionner génétiquement un sous-ensemble de cellules qui sont étiquetés1. Alternativement, expression induite virale de GFP peut être utilisée pour expression sélectionné par l’utilisateur de GFP3,4. Bien que très utile, expression génétique de médiation de GFP ne permet pas d’expression sélectionné par l’utilisateur dans un sous-ensemble de cellules dans les tissus ; et l’expression virale de GFP, bien qu’avantageuse, peut être envahissante. Avec l’avènement des dérivés de la GFP et habiles techniques comme Brainbow pour exprimer les protéines fluorescentes distinctes plus faiblement dans les tissus, il est devenu possible de visualiser les cellules individuelles et les interactions entre eux en tissu complexe2, 5. Toutefois, ces approches étiqueter les cellules de façon aléatoire. Si l’expérience désirée exige la visualisation d’une seule cellule ou d’une population de cellules qui est définie par l’expérimentateur, elles sont donc limitées. Avec de telles expériences, il serait avantageux d’avoir une protéine fluorescente génétiquement explicite qui peut être manipulée pour distinguer, d’une façon unique cellule, d’autres cellules fluorescentes et non fluorescent.
Pour atteindre cet objectif et visualiser la biologie cellulaire de cellules individuelles au sein d’un tissu vivant complexe, la communauté scientifique utilise seule cellule photoconversion distinctes de protéines fluorescentes6,7,8. Vous utilisez génétiquement contrôlé d’expression d’une protéine et (c.-à-d., eos, kaede, etc.) qui passe du vert au rouge État fluorescente lorsqu’ils sont exposés aux UV (488 nm) léger, on distingue une seule cellule de ses fluorescent étiquetés voisins6,7,8. Cette approche utilise un appareil attaché à notre microscope confocal qui peut diriger la lumière d’une pile de laser à une région limitée par la diffraction d’intérêt. Avec cette technique, nous pouvons soit l’étiquette cellules individuelles ou des populations plus importantes dans une manière définie par l’utilisateur9,10,11. La technique est peu invasive par rapport à des injections de cellule unique de GFP virale. Comme une preuve de concept, nous montrons que nous pouvons photoconvert des cellules individuelles au sein d’un ganglion dans le système nerveux périphérique et de la photoconvert des populations plus importantes comme les cellules situées sur la face ventrale de la moelle épinière9,10, 11,12. Ensuite, nous pouvons visualiser ces populations de cellules photoconverted 24h plus tard pour avoir un aperçu de leur mouvement et de la différenciation au cours du développement.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10 :eos) animaux de poisson-zèbre</td><td></td><td></td><td>Des poissons ont été obtenus et croisés à partir de l’installation de poissons de l’Université de Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm boîte de Pétri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryon medium</td><td></td><td></td><td>Un milieu embryonnaire est fabriqué chaque semaine et fourni par l’installation de gestion du poisson de l’Université de Notre Dame, contenant 5 litres d’eau osmosée, 30 μL de bleu de méthylène et 200 ml de stock de sel.</td></tr><tr><td>0,8 % à faible point de fusion Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri à fond de lamelle en verre de 35 X 10 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr>Sonde <td></td><td></td><td></td><td>de dissection à l’aiguille</td></tr><tr><td>0,002 % ester d’acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne)</td><td>Fluka analytique</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection fluorescent avec filtres GFP</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal avec lasers pour exciter les jeux de filtres GFP et RFP</td><td>3i disque rotatif confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière UV (laser) pour photoconversion</td> Laser <td></td><td></td><td>405 nm</td></tr><tr><td>Logiciel de diaporama</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre intact de la vie

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Des tissus animaux et végétaux sont composée de populations distinctes de cellules. Ces cellules interagissent au fil du temps pour bâtir et maintenir les tissus et peuvent provoquer des maladies lorsque perturbés. Les scientifiques ont développé des techniques intelligents afin d’étudier les caractéristiques et la dynamique naturelle de ces cellules dans les tissus intacts en exprimant des protéines fluorescentes en sous-ensembles de cellules. Toutefois, à certains moments, expériences nécessitent plus sélectionnée visualisation des cellules dans les tissus, parfois à la manière monocellulaires ou population-de-cells. Pour atteindre cet objectif et visualiser les cellules individuelles au sein d’une population de cellules, les scientifiques ont utilisé unicellulaires photoconversion de protéines fluorescentes. Pour illustrer cette technique, nous montrons ici comment diriger la lumière UV à une cellule exprimant l’Eos d’intérêt dans un état intact, vit le poisson-zèbre. Nous avons ensuite image ces cellules de Eos+ photoconverted 24 h plus tard pour déterminer comment ils ont changé dans le tissu. Nous décrivons deux techniques : simple cellule photoconversion et photoconversions des populations de cellules. Ces techniques permettent de visualiser les interactions cellule-cellule, cellule-destin et différenciation et les migrations cellulaires, ce qui en fait une technique qui s’applique à nombreuses questions biologiques.

Photoconversion de protéines fluorescentes peut être utilisée pour étiqueter des cellules distinctes au sein d’un tissu6. Pour illustrer cela, Tg(sox10:eos) poisson9 ont été utilisés pour exprimer la protéine et Eos sous les séquences régulatrices de sox10. Les animaux Tg(sox10:eos) à 48 hpf ont monté tout d’abord et ensuite imagés pour détecter n’importe quel photoconversion non spécifique qui peut avoir eu lieu. ...

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

L’objectif global de cette technique de photoconversion est de distinguer les cellules uniques d’un seul animal des autres populations de cellules fluorescentes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le développement sur le terrain et nous permettre de visualiser la migration d’une seule cellule au fil du temps. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu invasive et peut être utilisée pour marquer des cellules uniques ou des populations plus importantes.De plus, l’utilisateur peut sélectionner la région d’intérêt spécifique et convertir la photo de la cible souhaitée. Après l’accouplement du poisson zèbre transgénique mâle et femelle exprimant une protéine photoconvertible et collecté les œufs selon le protocole de texte, utilisez un microscope de dissection avec une source lumineuse de 488 nanomètres et des ensembles de filtres GFP pour cribler 24 embryons hpf. À l’aide d’une aiguille ou d’une pince à épiler, déchorionnez manuellement les embryons.Préparer au micro-ondes, cinq millilitres de solution d’agarose à 0,8 % à bas point de fusion. Une fois que l’agarose est refroidie au toucher, placez trois à quatre poissons transgéniques anesthésiés sox10 eos positif 48 hpf au centre d’une boîte de Pétri à fond de couvercle en verre de dix millimètres. Ajoutez environ un millimètre, ou suffisamment d’agarose pour couvrir la surface de la lamelle.Ensuite, à l’aide d’une aiguille à sonde, disposez les poissons sur le côté, en les ajustant au besoin, pendant que l’agarose se solidifie, ce qui prendra environ deux minutes. Une fois que l’agarose s’est solidifiée pendant deux minutes, ajoutez lentement un milieu embryonnaire contenant 0,02 % d’ester tricaïque d’acide aminobenzoïque dans le bol, jusqu’à ce que la surface inférieure de la gélose et du plat soit immergée. Pour effectuer la microscopie confocale, ouvrez le logiciel confocal et sélectionnez les fenêtres de capture et de mise au point.Pour effectuer une imagerie de pré-conversion, sous la fenêtre de capture et l’onglet déroulant des paramètres de capture, sélectionnez les paramètres d’imagerie. Voici le paramètre de pile spécifique au laboratoire appelé imagerie des poissons. Placez l’échantillon sur le microscope confocal et utilisez les boutons de réglage grossier et fin pour le mettre au point.Ouvrez ensuite la fenêtre de mise au point et localisez la région d’intérêt souhaitée, telle que le ganglion de la racine dorsale. Dans le menu de réglage des filtres, sélectionnez le laser c488, réglez l’exposition sur 300 millisecondes, la puissance laser sur cinq et l’intensification sur 75. Ensuite, dans la section du type de capture, cochez la case 3D.Dans la section Capture 3D, sélectionnez Utiliser la position actuelle et vérifiez la plage autour du courant. Dans la même section, définissez la plage sur 35, le nombre de plans sur 36 et la taille du pas sur un. Sélectionnez l’emplacement actuel, puis cliquez sur démarrer en bas de la fenêtre de capture pour acquérir une image.Avant le processus de photoconversion, assurez-vous de vérifier deux et trois fois les paramètres du laser. Parfois, il est nécessaire de réajuster les paramètres de conversion, lorsque la fenêtre de conversion est ouverte. Dans la fenêtre de capture, sous l’onglet déroulant des paramètres de la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifique au laboratoire.Ici, le cadre spécifique au laboratoire s’appelle, le poisson ablate full chip. Dans le menu de filtre, sélectionnez les lasers c488 et c541. Réglez l’exposition à 300 millisecondes, la puissance laser à cinq et l’intensification à 75, ce qui produira suffisamment de signal fluorescent sans provoquer de photoblanchiment ou de toxicité.Dans la fenêtre de mise au point, cliquez sur l’onglet photomanipulation, et changez la puissance de la pile laser à deux, puis cliquez sur go. Définissez la taille du bloc raster sur une et cliquez sur Définir. Changez ensuite la taille du double-clic en quatre et la ligne laser en v405.Ensuite, dans la fenêtre de capture, ouvrez les paramètres de capture avancés. Sélectionnez l’onglet photomanipulation et remplacez les répétitions du double-clic par deux, puis cliquez sur OK. Sélectionnez l’onglet xy dans la fenêtre de focus.Dans l’onglet photomanipulation, vérifiez les paramètres du laser. Ensuite, réglez les paramètres laser pour photoconvertir la cellule d’intérêt, sans photoconversion des cellules environnantes. Sous Type de capture, cochez la case timelapse, puis cliquez sur Démarrer.Une fois la fenêtre timelapse en direct ouverte, sélectionnez l’outil cercle dans la barre d’outils supérieure. Dessinez un cercle dans la région la plus centrale de la cellule, puis cliquez avec le bouton droit sur le cercle dessiné, sélectionnez Région FRAP et attendez trois secondes. La zone sélectionnée doit devenir plus sombre lorsqu’il clique sur arrêter la capture.Si vous imagez plus d’un animal, retournez à l’onglet xy dans le menu de mise au point et sélectionnez la position deux. Ensuite, répétez la photoconversion. Pour convertir une population de cellules, suivez le protocole et les peramètres laser en ouvrant la fenêtre timelapse.Maintenant, au lieu de dessiner un cercle pour FRAP la région d’intérêt, utilisez l’outil ligne pour tracer une ligne sur la région d’intérêt. Ensuite, FRAP la région en utilisant les mêmes paramètres que ceux que nous venons de démontrer. Une fois que tous les points sont photoconvertis, sous l’onglet déroulant des paramètres de capture dans la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre de pile standard spécifique au laboratoire décrit précédemment dans cette vidéo.Sélectionnez le laser c488 et réglez l’exposition sur 300 millisecondes, la puissance laser sur cinq et l’intensification sur 75. Sélectionnez le laser c541 et réglez l’exposition sur 500 millisecondes, la puissance laser sur dix et l’intensification sur 75. Dans la section du type de capture, cochez la case 3D.Dans la section Capture 3D, sélectionnez Utiliser la position actuelle et vérifiez la plage autour du courant. Dans la même section, définissez la plage sur 35, le nombre de plans sur 36 et la taille du pas sur un. Le nombre de portées peut augmenter ou diminuer pour s’adapter à la profondeur d’imagerie souhaitée.S’il y a des points multiplicateurs dans l’onglet de focus xy, dans la fenêtre de capture, sélectionnez l’option de liste multipoint. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez l’emplacement actuel. Enfin, en bas de la fenêtre de capture, cliquez sur démarrer pour acquérir une image.Ces panneaux montrent une seule cellule de préphotoconversion, au sein d’un ganglion d’un poisson zèbre transgénique, exprimant la protéine eos photoconvertible, sous contrôle de la séquence régulatrice sox10. Après la photoconversion, eos était nettement présent dans la région d’intérêt, alors qu’aucune cellule voisine n’a été marquée. Pour démontrer l’utilité de cette technique de photoconversion, une population de cellules de la face ventrale de la moelle épinière a été exposée à la lumière UV, à l’aide d’une ligne.Par la suite, des images ont été prises montrant la protéine eos photoconvertie dans la région de la ligne. La protéine eos non photoconvertie était visible dans toutes les autres zones. Plusieurs heures après la photoconversion, des images identiques ont été prises qui ont montré des cellules positives eos photoconverties dispersées dans toute la région de la moelle épinière, à la fois dans les zones dorsale et ventrale.Cette découverte est cohérente avec l’hypothèse selon laquelle les cellules vertébrales ventrales se sont déplacées vers des emplacements dorsaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 45 minutes, si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de prendre une image de post-conversion, pour confirmer que votre région d’intérêt a bien subi la photoconversion.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie timelapse peuvent être effectuées afin d’observer la migration cellulaire et la dynamique au fil du temps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de distinguer les cellules uniques au sein d’une population de cellules fluorescentes. N’oubliez pas que travailler avec de la lumière ultraviolette peut être extrêmement dangereux et que les précautions nécessaires doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.Par exemple, ne regardez jamais directement la lumière.

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JoVE Journal

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