Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

L’objectif global de cette technique de photoconversion est de distinguer les cellules uniques d’un seul animal des autres populations de cellules fluorescentes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le développement sur le terrain et nous permettre de visualiser la migration d’une seule cellule au fil du temps. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est peu invasive et peut être utilisée pour marquer des cellules uniques ou des populations plus importantes.

De plus, l’utilisateur peut sélectionner la région d’intérêt spécifique et convertir la photo de la cible souhaitée. Après l’accouplement du poisson zèbre transgénique mâle et femelle exprimant une protéine photoconvertible et collecté les œufs selon le protocole de texte, utilisez un microscope de dissection avec une source lumineuse de 488 nanomètres et des ensembles de filtres GFP pour cribler 24 embryons hpf. À l’aide d’une aiguille ou d’une pince à épiler, déchorionnez manuellement les embryons.

Préparer au micro-ondes, cinq millilitres de solution d’agarose à 0,8 % à bas point de fusion. Une fois que l’agarose est refroidie au toucher, placez trois à quatre poissons transgéniques anesthésiés sox10 eos positif 48 hpf au centre d’une boîte de Pétri à fond de couvercle en verre de dix millimètres. Ajoutez environ un millimètre, ou suffisamment d’agarose pour couvrir la surface de la lamelle.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille à sonde, disposez les poissons sur le côté, en les ajustant au besoin, pendant que l’agarose se solidifie, ce qui prendra environ deux minutes. Une fois que l’agarose s’est solidifiée pendant deux minutes, ajoutez lentement un milieu embryonnaire contenant 0,02 % d’ester tricaïque d’acide aminobenzoïque dans le bol, jusqu’à ce que la surface inférieure de la gélose et du plat soit immergée. Pour effectuer la microscopie confocale, ouvrez le logiciel confocal et sélectionnez les fenêtres de capture et de mise au point.

Pour effectuer une imagerie de pré-conversion, sous la fenêtre de capture et l’onglet déroulant des paramètres de capture, sélectionnez les paramètres d’imagerie. Voici le paramètre de pile spécifique au laboratoire appelé imagerie des poissons. Placez l’échantillon sur le microscope confocal et utilisez les boutons de réglage grossier et fin pour le mettre au point.

Ouvrez ensuite la fenêtre de mise au point et localisez la région d’intérêt souhaitée, telle que le ganglion de la racine dorsale. Dans le menu de réglage des filtres, sélectionnez le laser c488, réglez l’exposition sur 300 millisecondes, la puissance laser sur cinq et l’intensification sur 75. Ensuite, dans la section du type de capture, cochez la case 3D.

Dans la section Capture 3D, sélectionnez Utiliser la position actuelle et vérifiez la plage autour du courant. Dans la même section, définissez la plage sur 35, le nombre de plans sur 36 et la taille du pas sur un. Sélectionnez l’emplacement actuel, puis cliquez sur démarrer en bas de la fenêtre de capture pour acquérir une image.

Avant le processus de photoconversion, assurez-vous de vérifier deux et trois fois les paramètres du laser. Parfois, il est nécessaire de réajuster les paramètres de conversion, lorsque la fenêtre de conversion est ouverte. Dans la fenêtre de capture, sous l’onglet déroulant des paramètres de la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifique au laboratoire.

Ici, le cadre spécifique au laboratoire s’appelle, le poisson ablate full chip. Dans le menu de filtre, sélectionnez les lasers c488 et c541. Réglez l’exposition à 300 millisecondes, la puissance laser à cinq et l’intensification à 75, ce qui produira suffisamment de signal fluorescent sans provoquer de photoblanchiment ou de toxicité.

Dans la fenêtre de mise au point, cliquez sur l’onglet photomanipulation, et changez la puissance de la pile laser à deux, puis cliquez sur go. Définissez la taille du bloc raster sur une et cliquez sur Définir. Changez ensuite la taille du double-clic en quatre et la ligne laser en v405.

Ensuite, dans la fenêtre de capture, ouvrez les paramètres de capture avancés. Sélectionnez l’onglet photomanipulation et remplacez les répétitions du double-clic par deux, puis cliquez sur OK. Sélectionnez l’onglet xy dans la fenêtre de focus.

Dans l’onglet photomanipulation, vérifiez les paramètres du laser. Ensuite, réglez les paramètres laser pour photoconvertir la cellule d’intérêt, sans photoconversion des cellules environnantes. Sous Type de capture, cochez la case timelapse, puis cliquez sur Démarrer.

Une fois la fenêtre timelapse en direct ouverte, sélectionnez l’outil cercle dans la barre d’outils supérieure. Dessinez un cercle dans la région la plus centrale de la cellule, puis cliquez avec le bouton droit sur le cercle dessiné, sélectionnez Région FRAP et attendez trois secondes. La zone sélectionnée doit devenir plus sombre lorsqu’il clique sur arrêter la capture.

Si vous imagez plus d’un animal, retournez à l’onglet xy dans le menu de mise au point et sélectionnez la position deux. Ensuite, répétez la photoconversion. Pour convertir une population de cellules, suivez le protocole et les peramètres laser en ouvrant la fenêtre timelapse.

Maintenant, au lieu de dessiner un cercle pour FRAP la région d’intérêt, utilisez l’outil ligne pour tracer une ligne sur la région d’intérêt. Ensuite, FRAP la région en utilisant les mêmes paramètres que ceux que nous venons de démontrer. Une fois que tous les points sont photoconvertis, sous l’onglet déroulant des paramètres de capture dans la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre de pile standard spécifique au laboratoire décrit précédemment dans cette vidéo.

Sélectionnez le laser c488 et réglez l’exposition sur 300 millisecondes, la puissance laser sur cinq et l’intensification sur 75. Sélectionnez le laser c541 et réglez l’exposition sur 500 millisecondes, la puissance laser sur dix et l’intensification sur 75. Dans la section du type de capture, cochez la case 3D.

Dans la section Capture 3D, sélectionnez Utiliser la position actuelle et vérifiez la plage autour du courant. Dans la même section, définissez la plage sur 35, le nombre de plans sur 36 et la taille du pas sur un. Le nombre de portées peut augmenter ou diminuer pour s’adapter à la profondeur d’imagerie souhaitée.

S’il y a des points multiplicateurs dans l’onglet de focus xy, dans la fenêtre de capture, sélectionnez l’option de liste multipoint. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez l’emplacement actuel. Enfin, en bas de la fenêtre de capture, cliquez sur démarrer pour acquérir une image.

Ces panneaux montrent une seule cellule de préphotoconversion, au sein d’un ganglion d’un poisson zèbre transgénique, exprimant la protéine eos photoconvertible, sous contrôle de la séquence régulatrice sox10. Après la photoconversion, eos était nettement présent dans la région d’intérêt, alors qu’aucune cellule voisine n’a été marquée. Pour démontrer l’utilité de cette technique de photoconversion, une population de cellules de la face ventrale de la moelle épinière a été exposée à la lumière UV, à l’aide d’une ligne.

Par la suite, des images ont été prises montrant la protéine eos photoconvertie dans la région de la ligne. La protéine eos non photoconvertie était visible dans toutes les autres zones. Plusieurs heures après la photoconversion, des images identiques ont été prises qui ont montré des cellules positives eos photoconverties dispersées dans toute la région de la moelle épinière, à la fois dans les zones dorsale et ventrale.

Cette découverte est cohérente avec l’hypothèse selon laquelle les cellules vertébrales ventrales se sont déplacées vers des emplacements dorsaux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 45 minutes, si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de prendre une image de post-conversion, pour confirmer que votre région d’intérêt a bien subi la photoconversion.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie timelapse peuvent être effectuées afin d’observer la migration cellulaire et la dynamique au fil du temps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de distinguer les cellules uniques au sein d’une population de cellules fluorescentes. N’oubliez pas que travailler avec de la lumière ultraviolette peut être extrêmement dangereux et que les précautions nécessaires doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Par exemple, ne regardez jamais directement la lumière.