Name: In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez comment mesurer la perméabilité épithéliale intestinale in vitro et in vivo chez la souris. Ces méthodes permettent d'étudier les maladies inflammatoires et d'évaluer la fonction de barrière intestinale.

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Nous remercions le docteur Jerrold R. Turner, de l’hôpital Brigham et des femmes, Harvard Medical School, pour son aide généreuse dans l’achèvement de cette étude. Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de licence 81470804, 31401229 et 81200620), le Natural Science Foundation de la Province du Jiangsu (numéro de licence BK20180838 et BK20140319), le programme d’Innovation de recherche des Diplômés de collège de la Province du Jiangsu (numéro de licence KYLX16-0116), Advanced Research projets de Soochow University (numéro de licence SDY2015_06) et maladie de Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship Award (octroyer le numéro 310801).

Cette étude a été approuvée par la protection des animaux et utilisation protocole de Cambridge-Suda génomique Resource Center (CAM-SU), l’Université Soochow.
1. électrodéposition et l’entretien de Caco-2bbe sur les Membranes poreuses en Polycarbonate
<ol><li>La croissance de cellules dans une fiole de T75 avec les médias (DMEM contenant 10 % FBS). Flacons doivent être nourris régulièrement, en fonction de la densité cellulaire. Remarque : Pour le placage optimal, cellules devraient se divisent rapidement et ont une forme plate « frit-œuf », qui indique que les cellules sont en phase de croissance.</li>
	<li>Une fois que les cellules sont 80 % confluentes, prendre le ballon hors de l’incubateur et retirez le support. Rincer tout média résiduel avec 1 à 2 mL de PBS stérile (sans Ca2 +). Pipeter 1,5 mL trypsine-EDTA dans le ballon et doucement rock la fiole ; Ensuite, placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min sans bascule.</li>
	<li>Alors que les cellules sont trypsinisation, place insère contenant des membranes poreuses en polycarbonate (taille des pores, 0,4 µm ; superficie, 0,33 cm2; voir Table des matières) dans les plaques 24 puits. Ajouter 1,0 mL de milieu de culture dans la chambre basale (l’espace inférieur de la membrane).</li>
	<li>Pipette 5 mL de médias dans la fiole et vigoureusement la pipette les cellules contre le côté du ballon de 5 à 10 fois pour atteindre les cellules desserrées, individuels ou 2 ou 3 cellules des touffes.</li>
	<li>
Plaque de 0,166 mL de cellules (atteindre un taux de dilution de 1:8) dans la chambre apicale (l’espace supérieur de la membrane). Incuber à 37 ° C pendant 3 semaines.
	<ol>
<li>Nourrir les cellules trois fois par semaine en aspirant soigneusement le support du compartiment basal de chaque bien en utilisant une pompe à pression. Ne versez doucement 1 mL de médias dans la chambre apicale de chaque insertion.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. utilisation d’épithélial mètre (v/Ohm) pour mesurer les TER
Remarque : Après environ 3 semaines de culture sur la membrane en polycarbonate, cellules Caco-2BBe sont prêts pour la mesure de TER.
<ol><li>Pour les études de cytokine, un jour avant la mesure, remplacer le milieu de base avec un milieu contenant 10 ng/mL d’IFNγ. Le jour de l’expérience, remplacez les médias HBSS contenant 2,5 ou 7,5 ng/mL de TNF. Remarque : Le traitement IFNγ augmente l’expression des récepteurs TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Pour corriger le compteur, introduire l’électrode de correction dans le port d’entrée et choisissez le mode « Ohm ». Régler la vis de l’Adj R avec un tournevis jusqu'à ce que le compteur affiche une lecture de 1 000 Ω.</li>
	<li>Stériliser les électrodes en les plaçant dans l’éthanol à 70 % pour les 15-30 min et puis laissez-les à l’air sec pour 15 s. Rincer l’électrode dans les milieux de culture de cellule expérimentale.</li>
	<li>Mettre sous tension et choisissez le mode « Ohm ». Placer soigneusement les longues extrémités des ponts électrode dans la chambre basale et les petits bouts dans le compartiment apical. Veiller à ce que les électrodes plus touchent le fond du plat, tout en gardant les électrodes courtes sous la surface des médias mais surtout les inserts de culture cellulaire. Garder les électrodes verticales.</li>
	<li>Mesurer la résistance de l’échantillon insertions et insertions vides (c'est-à-dire, la culture insère sans cellules avec HBSS) à 0, 1, 2, 3, 4 h après le traitement de cytokine. Enregistrement de la résistance.</li>
	<li>Pour assurer l’uniformité dans l’ensemble plaque différents formats, calculer le produit de la résistance et de la zone de la membrane efficace : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Pour les insertions de 24 puits, la surface de membrane efficace est 0,33 cm2.</li>
</ol>3. modèle murin de Dextran Sulfate Sodium (DSS)-induced Colitis
<ol><li>Ajouter DSS à eau stérilisés à l’autoclave à une concentration finale de 3,5 % (wt/vol).</li>
	<li>Administrer les 3,5 % Mas de souris C57BL/6 mâles de 8 semaines pour un total de 7 jours. Donner régulièrement l’eau potable sans DSS aux souris témoins.<ol>
<li>Passer l’eau contenant du MAS à l’eau potable ordinaire après jour 7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Souris de peser et évaluer des scores cliniques de chaque souris tous les jours. Normaliser le poids corporel de chaque souris à son poids corporel initial. Scores sont définis en fonction de la gravité de la maladie par quatre paramètres : prolapsus rectal (0-2), consistance des selles (0-2), saignements (0-2) et activité (0-2)5. Additionner les scores de ces paramètres pour un score final de clinique.</li>
	<li>Pour analyser la condition histopathologique des tissus du côlon, euthanasier souris par injection intrapéritonéale (i.p.) avec traitement de 1,2 % (vol/vol) Avertin (0,6 mL/10 g de poids corporel) 7 jours post-DSS. Pour préparer un stock de 100 % avertin, mélanger 10 g de 2,2,2-tribromoethanol 10 ml d’alcool de tert-amyle.  Stocker dans l’obscurité à 4° C. Pour utiliser, diluer 100 % stock à 2 % dans l’eau.</li>
	<li>Isoler le côlon et le caecum et mesurer la longueur du côlon5.</li>
	<li>Couper des segments de 0,5 cm de côlon distal et du fix dans un tube de falcon de 15 mL contenant 10 mL de formol 10 % du jour au lendemain. Laver les tissus fixés à l’éthanol graduée (75, 95 et 100 %) et le xylène. Incorporer les tissus à la paraffine et couper des sections de 6 mm pour l’hématoxyline et éosine coloration8.</li>
</ol>4. mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale chez les souris de la colite induite par le DSS
<ol><li>Mesurer la perméabilité de la barrière de 7 jours après le début de l’administration de DSS.</li>
	<li>Le jour du test, rapide souris pendant 3 h.</li>
	<li>Stériliser un gavage aiguille pour assurer la stérilité, puis gavage souris avec 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran dans de l’eau stérile et garder le FITC-dextran inutilisé afin de mesurer la courbe d’étalonnage après le prélèvement de sérum. Peser les souris pour le calcul de la perméabilité. Remarque : La solution FITC-dextran convient dans l’eau.</li>
	<li>À l’aide d’une paire de ciseaux, couper un morceau de 1 cm de la queue et prélever 100 µL de sang de la queue dans les tubes de prélèvement de sérum. Faites tourner le sang à 10 000 g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Diluer le sérum 1 / 4 dans l’eau. Pour faire une norme curve, diluer FITC-dextran inutilisé avec de l’eau au 1 : 300, 1 / 1 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1/100 000, 1 : 300, 000, 1:1, 000, 000 et 1:3, 000, 000. Ajouter 100 µL/puits de sérum et les échantillons de la courbe d’étalonnage en plaques 96 puits.</li>
	<li>Lire la fluorescence dans un lecteur de plaque avec 485 excitation/528 d’émission. Calculer les valeurs de perméabilité basés sur la courbe d’étalonnage et multipliez par 4 pour corriger pour la dilution.</li>
	<li>Diviser la concentration du FITC-dextran par le poids de normaliser les valeurs (cela permet de normaliser la différence dans la livraison de la FITC-dextran si les souris sont malades et ont perdu du poids).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. Les cellules Caco-2BBe (brosse exprimant frontière) sont toujours utilisés pour la mesure de TER, sélectionnée dans la lignée de cellules Caco-2 pour l’expression des protéines de la bordure en brosse. Les cellules Caco-2BBe ont un phénotype d’absorption de villosités lorsque complètement dissociés (après environ 3 semaines de confluence après culture)17. Il est nécessaire d’éviter toute contamination pendant la mesure et de stériliser l’électro...

Les cellules épithéliales intestinales ne sont pas seulement responsables de l’absorption des nutriments, mais constituent également un obstacle important pour se défendre contre les micro-organismes pathogènes et des toxines microbiennes. Cette fonction de barrière intestinale est régulée par la perméabilité de la jonction serrée et cellules épithéliales intégrité1,2,3, et le dysfonctionnement de la fonction de barrière épithéliale est associé à inflammatoires de l’intestin maladie (MICI). L’anneau d’actomyosine perijunctional (PAMR) se trouve dans la cellule qui est étroitement accolée à des jonctions serrées. La contraction de la PAMR, qui est régi par la chaîne légère de la myosine (MLC), est cruciale pour le règlement de la jonction serrée perméabilité4,5,6,7,8, 9,10. Facteur de nécrose tumorale (TNF) est au cœur de la perte de la barrière intestinale par cytoprotectrices expression intestinale épithéliale kinase (MLCK) MLC et induisant occludin internalisation11,12,13.
Ions tels que Na+ et Cl– peut traverser l’espace paracellulaire par le pore ou fuite voie14. Dans un épithélium « Baveur », changements de TER reflètent principalement perméabilité altérée de jonction serrée. Mesure de TER est une approche électrophysiologique couramment utilisée pour quantifier la perméabilité de jonction serrée, principalement à Na+ et Cl-, basée sur l’impédance des monocouches de cellules. Types de cellules différentes, y compris les cellules épithéliales intestinales, les cellules épithéliales pulmonaires et les cellules endothéliales vasculaires, ont été signalés pour des mesures de TER. Avantages de cette méthode sont que TER mesures sont non invasif et peuvent être utilisés pour surveiller des cellules vivantes en temps réel. En outre, la technique de mesure de TER est utile pour la drogue toxicité études15.
Caco-2BBe cellules sont des cellules d’adénocarcinome colorectal épithéliales humaines avec une structure et une fonction semblable aux petites cellules épithéliales intestinales différenciées : par exemple, ces cellules ont des microvillosités et enzymes associées à petite brosse intestinale frontière. Par conséquent, cultivées monocouches de Caco-2BBe sont utilisés comme modèle in vitro pour tester la fonction de barrière.
Chez la souris, une façon d’étudier la perméabilité paracellulaire intestinale est en mesurant la capacité du FITC-dextran à traverser de la lumière dans le sang. Ainsi, la perméabilité intestinale peut être évaluée par gavage FITC-dextran directement dans la souris et en mesurant la fluorescence dans le sang. Le protocole suivant décrit deux méthodes simples pour évaluer la perméabilité de l’épithélium intestinal in vitro et in vivo.

<table><tbody><tr><td>Aiguille à gavage 22 G</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Noir Plaques 96 puits pour fluorescence</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>Souris C57/B6 Institut</td><td>de recherche biomédicale de Nanjing de l’Université</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Cellules Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran sodique</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED avec glucose et pyruvate de sodium élevés</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Épithélial (Volt/Ohm) Compteur</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sinopharm ChimiqueRéactif</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Tube Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td>Microscope</tr> à <tr><td>fluorescence</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM de glucose&nbsp ;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Centre modulaire d’enrobage tissulaire</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement de sérum</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flacon</td><td>corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membranes en polycarbonate (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à pression</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Microtomie rotative</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Sinopharm ChimiqueRéactif</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro et in vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

La barrière intestinale défend contre les micro-organismes pathogènes et toxines microbiennes. Sa fonction est réglementée par la perméabilité de la jonction serrée et l’intégrité des cellules épithéliales, et perturbation de la fonction de barrière intestinale contribue à la progression de la maladie gastro-intestinale et systémique. Deux méthodes simples sont décrites ici pour mesurer la perméabilité de l’épithélium intestinal. In vitro, les cellules Caco-2BBe sont plaqués dans les puits de culture de tissu comme une monocouche et résistance électrique transépithéliale (TER) peut être mesurée par un compteur épithéliales (v/ohm). Cette méthode est convaincant en raison de son fonctionnement convivial et la répétabilité. In vivo, souris sont gavés avec 4 kDa isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran et les concentrations de FITC-dextran sont mesurées dans des échantillons de sérum prélevés chez des souris pour déterminer la perméabilité épithéliale. Gavage oral apporte une dose précise et par conséquent il est préférable de mesurer la perméabilité intestinale in vivo. Pris ensemble, ces deux méthodes permettant de mesurer la perméabilité de l’épithélium intestinal in vitro et in vivoet donc être utilisées pour étudier le lien entre les maladies et la fonction de barrière.

En culture, cellules Caco-2BBe croître comme une monocouche et lentement se différencient en des entérocytes absorption matures qui ont des frontières de la brosse. Dans ce protocole, les cellules Caco-2BBe ont été plaqués avec une forte densité sur la membrane en polycarbonate et cellules atteint 100 % confluence un jour après l’ensemencement. Cependant, les cellules sont indifférenciées, à ce stade : pour bien différencier les cellules, les médias sont changé tous les 2-3 jours pendant ...

Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

L’objectif global de cette expérience est d’étudier les maladies causées par le dysfonctionnement épithélial de barrière en mesurant la perméabilité épithéliale intestinale de cellules in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la fonction de barrière intestinale, telles que celles liées à la maladie inflammatoire de l’intestin. Le principal avantage de cette technique est que la perméabilité intestinale des cellules épithéliales peut être évaluée à la fois in vitro et in vivo.Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie ou le diagnostic des maladies gastro-intestinales, parce que le dysfonctionnement épithélial intestinal de barrière contribue à ces maladies. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la fonction de barrière intestinale, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que des études de toxicité de drogue et l’intégrité de barrière d’autres types de cellules. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car certaines étapes sont difficiles à apprendre.Un fonctionnement précis de cette méthode peut maintenant être compris par description textuelle. Pour commencer, faire pousser les cellules Caco-2bbe dans un flacon T75 avec moyen. Nourrissez les flacons régulièrement, selon la densité cellulaire.Lorsque les cellules sont 80% confluent, enlever le milieu et utiliser 1-2 millilitres de PBS stérile sans calcium pour les rincer. Ajouter 1,5 millilitres de Trypsin-EDTA et faire basculer doucement le flacon. Ensuite, placez-le dans l’incubateur de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, sans basculer.Pendant que les cellules trypsinisent, placez des inserts contenant des membranes poreuses de polycarbonate dans 24 plaques de puits. Ajouter ensuite 1 millilitre de milieu de culture dans la chambre basale qui est l’espace inférieur de la membrane. Ajouter 5 millilitres de milieu au flacon, et pipette vigoureusement les cellules contre l’intérieur du flacon 5 à 10 fois, pour séparer la culture en cellules individuelles lâches, ou deux à trois touffes de cellules.Plaque 0,166 millilitres des cellules dans la chambre apical qui est l’espace supérieur de la membrane. Puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant un jusqu’à trois semaines. Nourrissez les cellules trois fois par semaine, à l’aide d’une pompe à pression pour aspirer soigneusement le milieu du compartiment basal de chaque puits.Puis égouttez doucement un millilitre de milieu dans la chambre apical de chaque insert. Pour les études de cytokine, un jour avant la résistance électrique transepithelial ou les mesures TER, remplacer le milieu basal par moyen, contenant 10 nanogrammes par millilitre d’interféron gamma. Le jour de l’expérience, remplacer le milieu par HBSS contenant 2,5 ou 7,5 nanogrammes par millilitre de TNF.Pour corriger le compteur, insérez l’électrode de correction dans le port d’entrée et choisissez le mode Ohm. Ensuite, utilisez un tournevis pour régler la vis R Adjustment jusqu’à ce que le compteur affiche une lecture de 1000 ohms. Stériliser les électrodes dans 70% d’éthanol pendant 15 à 30 minutes et leur permettre de sécher à l’air libre pendant 15 secondes.Rincez ensuite les électrodes dans le milieu expérimental de culture cellulaire. Ensuite, allumez la puissance et choisissez le mode Ohm. Tout en gardant les électrodes verticales, placez soigneusement les longues extrémités des ponts d’électrode dans la chambre basale, en s’assurant qu’ils touchent le plat.Placez ensuite les extrémités courtes dans la chambre apical, en veillant à ce qu’elles restent sous la surface du milieu, mais au-dessus des inserts de culture tissulaire. Mesurer la résistance de l’échantillon et les inserts vierges à 0, 1, 2, 3 et 4 heures après le traitement par cytokine. Alors enregistrez la résistance.Pour obtenir une cohérence entre les différents formats de plaques, calculez le produit de la résistance et la zone membranaire efficace comme indiqué ici. Pour 24 inserts de puits, la surface membranaire efficace est de 0,33 centimètre carré. Pour induire la colite, ajouter le DSS à l’eau autoclavée à une concentration finale de 3,5% de poids par volume.Ensuite, utilisez la solution DSS pour remplacer l’eau potable dans les cages de 8 semaines mâle C57 noir six souris pour un total de sept jours. Donnez régulièrement de l’eau potable sans DSS pour contrôler les souris. Après le septième jour, passez l’eau DSS à l’eau potable ordinaire.Chaque jour, pesez les souris et évaluez les scores cliniques tels que définis en fonction de la gravité de la maladie par quatre paramètres : prolapsus rectal, consistance des selles, saignements et activité. Résumez les scores de ces paramètres pour un score clinique final. Analyser l’état histopathologique des tissus du côlon sept jours après le traitement du DSS, après avoir euthanasié des souris selon le protocole du texte, isoler le côlon et le ccum, et mesurer la longueur du côlon.Couper 0,5 centimètre segments du côlon distal, et fixer le tissu dans un tube de faucon de 15 millilitres contenant 10 millilitres de formaline 10% pendant la nuit. Laver les tissus fixes avec de l’éthanol et du xylène classés. Puis intégrer les tissus dans la paraffine et couper six sections millimétriques pour l’hématoxyline et la coloration de l’éosine.Pour mesurer la perméabilité épithéliale de barrière chez les souris DSS-induites, sept jours après le début de l’administration de DSS, jeûnez les souris pendant trois heures. Autoclavez une aiguille de gavage pour assurer la stérilité, puis utilisez 150 microlitres de 80 milligrammes par millilitre quatre kilodalton FITC dextran dans l’eau stérile pour gaver les souris, et gardez le dextran FITC inutilisé pour mesurer la courbe standard après la collecte du sérum. Ensuite, pondération des souris pour le calcul de perméabilité.Quatre heures plus tard, après avoir anesthésié les souris par injection IP, confirmer l’anesthésie appropriée par le manque de réflexes et de mouvement de moustache. Ensuite, placez les souris sur un bloc thermique pendant cinq minutes. À l’aide d’une paire de ciseaux, couper un morceau d’un centimètre de la queue et recueillir 100 microlitres de sang de la queue dans un tube de collecte de sérum.Faites tourner le sang recueilli à 10 000 fois g et la température ambiante pendant dix minutes. Avec de l’eau, diluer le sérum un à quatre. Ensuite, pour faire une courbe standard, utilisez l’eau pour préparer les dilutions du dextran FITC inutilisé.Ajouter 100 microlitres par puits du sérum et les échantillons de courbe standard dans 96 plaques de puits. À l’aide d’un lecteur de plaque, lisez la fluorescence à une excitation de 485 et une émission de 528. Calculez les valeurs de perméabilité en fonction de la courbe standard, et multipliez par quatre pour corriger la dilution.Divisez la concentration de FITC dextran par le poids pour normaliser les valeurs. Cela aide à normaliser la différence dans l’accouchement par dextran FITC si les souris sont malades, et ont perdu du poids. Les cellules Caco-2bbe montrées ici ont été étiquetées avec des taches de noyaux et de F-actin pour montrer la différence entre les cellules indifférenciées et différenciées.Les fibres de stress sont clairement visibles dans les cellules indifférenciées. Les cellules différenciées ont un volume plus faible, des noyaux plus grands et moins de fibres de stress que les cellules indifférenciées. Le TNF est au cœur de la perte de barrière intestinale par la régulation des jonctions serrées dépendante du MLCK.Comme on le voit dans ce chiffre, TNF diminue significativement le TER de la monocouche Caco-2bbe d’une manière dépendante de la dose, ce qui suggère que le TNF augmente la perméabilité épithéliale. Par rapport à leur poids corporel initial, les souris traitées avec DSS perdent une quantité importante de poids. La sévérité de la colite est notée par prolapsus rectal, consistance de selles, saignement, et activité.Les sections transversales des tissus du côlon tachés d’hématoxyline et d’éosine présentent des lésions muqueuses du côlon chez les souris traitées par le DSS. En outre, la longueur de la crypte du côlon, ainsi que le côlon lui-même, est diminué chez les souris traitées par le DSS. Enfin, il y a une augmentation d’environ deux fois les niveaux de coloration dextran FITC chez les souris traitées au DSS, par rapport aux souris témoins.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser les erreurs, en standardisant les procédures opérationnelles et en utilisant des méthodes statistiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la fonction barrière intestinale pour explorer les maladies gastro-intestinales dans les organismes modèles et les lignées cellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la perméabilité épithéliale intestinale en mesurant le TER, en gavant fitc dextran, et en observant les changements morphologiques et histochimiques.

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