Name: In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Découvrez comment mesurer la perméabilité épithéliale intestinale in vitro et in vivo chez la souris. Ces méthodes permettent d'étudier les maladies inflammatoires et d'évaluer la fonction de barrière intestinale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions le docteur Jerrold R. Turner, de l’hôpital Brigham et des femmes, Harvard Medical School, pour son aide généreuse dans l’achèvement de cette étude. Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de licence 81470804, 31401229 et 81200620), le Natural Science Foundation de la Province du Jiangsu (numéro de licence BK20180838 et BK20140319), le programme d’Innovation de recherche des Diplômés de collège de la Province du Jiangsu (numéro de licence KYLX16-0116), Advanced Research projets de Soochow University (numéro de licence SDY2015_06) et maladie de Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship Award (octroyer le numéro 310801).

Cette étude a été approuvée par la protection des animaux et utilisation protocole de Cambridge-Suda génomique Resource Center (CAM-SU), l’Université Soochow.
1. électrodéposition et l’entretien de Caco-2bbe sur les Membranes poreuses en Polycarbonate
<ol><li>La croissance de cellules dans une fiole de T75 avec les médias (DMEM contenant 10 % FBS). Flacons doivent être nourris régulièrement, en fonction de la densité cellulaire. Remarque : Pour le placage optimal, cellules devraient se divisent rapidement et ont une forme plate « frit-œuf », qui indique que les cellules sont en phase de croissance.</li>
	<li>Une fois que les cellules sont 80 % confluentes, prendre le ballon hors de l’incubateur et retirez le support. Rincer tout média résiduel avec 1 à 2 mL de PBS stérile (sans Ca2 +). Pipeter 1,5 mL trypsine-EDTA dans le ballon et doucement rock la fiole ; Ensuite, placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min sans bascule.</li>
	<li>Alors que les cellules sont trypsinisation, place insère contenant des membranes poreuses en polycarbonate (taille des pores, 0,4 µm ; superficie, 0,33 cm2; voir Table des matières) dans les plaques 24 puits. Ajouter 1,0 mL de milieu de culture dans la chambre basale (l’espace inférieur de la membrane).</li>
	<li>Pipette 5 mL de médias dans la fiole et vigoureusement la pipette les cellules contre le côté du ballon de 5 à 10 fois pour atteindre les cellules desserrées, individuels ou 2 ou 3 cellules des touffes.</li>
	<li>
Plaque de 0,166 mL de cellules (atteindre un taux de dilution de 1:8) dans la chambre apicale (l’espace supérieur de la membrane). Incuber à 37 ° C pendant 3 semaines.
	<ol>
<li>Nourrir les cellules trois fois par semaine en aspirant soigneusement le support du compartiment basal de chaque bien en utilisant une pompe à pression. Ne versez doucement 1 mL de médias dans la chambre apicale de chaque insertion.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. utilisation d’épithélial mètre (v/Ohm) pour mesurer les TER
Remarque : Après environ 3 semaines de culture sur la membrane en polycarbonate, cellules Caco-2BBe sont prêts pour la mesure de TER.
<ol><li>Pour les études de cytokine, un jour avant la mesure, remplacer le milieu de base avec un milieu contenant 10 ng/mL d’IFNγ. Le jour de l’expérience, remplacez les médias HBSS contenant 2,5 ou 7,5 ng/mL de TNF. Remarque : Le traitement IFNγ augmente l’expression des récepteurs TNF 2 (TNFR2)16.</li>
	<li>Pour corriger le compteur, introduire l’électrode de correction dans le port d’entrée et choisissez le mode « Ohm ». Régler la vis de l’Adj R avec un tournevis jusqu'à ce que le compteur affiche une lecture de 1 000 Ω.</li>
	<li>Stériliser les électrodes en les plaçant dans l’éthanol à 70 % pour les 15-30 min et puis laissez-les à l’air sec pour 15 s. Rincer l’électrode dans les milieux de culture de cellule expérimentale.</li>
	<li>Mettre sous tension et choisissez le mode « Ohm ». Placer soigneusement les longues extrémités des ponts électrode dans la chambre basale et les petits bouts dans le compartiment apical. Veiller à ce que les électrodes plus touchent le fond du plat, tout en gardant les électrodes courtes sous la surface des médias mais surtout les inserts de culture cellulaire. Garder les électrodes verticales.</li>
	<li>Mesurer la résistance de l’échantillon insertions et insertions vides (c'est-à-dire, la culture insère sans cellules avec HBSS) à 0, 1, 2, 3, 4 h après le traitement de cytokine. Enregistrement de la résistance.</li>
	<li>Pour assurer l’uniformité dans l’ensemble plaque différents formats, calculer le produit de la résistance et de la zone de la membrane efficace : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg"> Pour les insertions de 24 puits, la surface de membrane efficace est 0,33 cm2.</li>
</ol>3. modèle murin de Dextran Sulfate Sodium (DSS)-induced Colitis
<ol><li>Ajouter DSS à eau stérilisés à l’autoclave à une concentration finale de 3,5 % (wt/vol).</li>
	<li>Administrer les 3,5 % Mas de souris C57BL/6 mâles de 8 semaines pour un total de 7 jours. Donner régulièrement l’eau potable sans DSS aux souris témoins.<ol>
<li>Passer l’eau contenant du MAS à l’eau potable ordinaire après jour 7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Souris de peser et évaluer des scores cliniques de chaque souris tous les jours. Normaliser le poids corporel de chaque souris à son poids corporel initial. Scores sont définis en fonction de la gravité de la maladie par quatre paramètres : prolapsus rectal (0-2), consistance des selles (0-2), saignements (0-2) et activité (0-2)5. Additionner les scores de ces paramètres pour un score final de clinique.</li>
	<li>Pour analyser la condition histopathologique des tissus du côlon, euthanasier souris par injection intrapéritonéale (i.p.) avec traitement de 1,2 % (vol/vol) Avertin (0,6 mL/10 g de poids corporel) 7 jours post-DSS. Pour préparer un stock de 100 % avertin, mélanger 10 g de 2,2,2-tribromoethanol 10 ml d’alcool de tert-amyle.  Stocker dans l’obscurité à 4° C. Pour utiliser, diluer 100 % stock à 2 % dans l’eau.</li>
	<li>Isoler le côlon et le caecum et mesurer la longueur du côlon5.</li>
	<li>Couper des segments de 0,5 cm de côlon distal et du fix dans un tube de falcon de 15 mL contenant 10 mL de formol 10 % du jour au lendemain. Laver les tissus fixés à l’éthanol graduée (75, 95 et 100 %) et le xylène. Incorporer les tissus à la paraffine et couper des sections de 6 mm pour l’hématoxyline et éosine coloration8.</li>
</ol>4. mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale chez les souris de la colite induite par le DSS
<ol><li>Mesurer la perméabilité de la barrière de 7 jours après le début de l’administration de DSS.</li>
	<li>Le jour du test, rapide souris pendant 3 h.</li>
	<li>Stériliser un gavage aiguille pour assurer la stérilité, puis gavage souris avec 150 µL 80 mg/mL 4 kDa FITC-dextran dans de l’eau stérile et garder le FITC-dextran inutilisé afin de mesurer la courbe d’étalonnage après le prélèvement de sérum. Peser les souris pour le calcul de la perméabilité. Remarque : La solution FITC-dextran convient dans l’eau.</li>
	<li>À l’aide d’une paire de ciseaux, couper un morceau de 1 cm de la queue et prélever 100 µL de sang de la queue dans les tubes de prélèvement de sérum. Faites tourner le sang à 10 000 g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Diluer le sérum 1 / 4 dans l’eau. Pour faire une norme curve, diluer FITC-dextran inutilisé avec de l’eau au 1 : 300, 1 / 1 000, 1:3, 000, 01:10, 000, 01:30, 000, 1/100 000, 1 : 300, 000, 1:1, 000, 000 et 1:3, 000, 000. Ajouter 100 µL/puits de sérum et les échantillons de la courbe d’étalonnage en plaques 96 puits.</li>
	<li>Lire la fluorescence dans un lecteur de plaque avec 485 excitation/528 d’émission. Calculer les valeurs de perméabilité basés sur la courbe d’étalonnage et multipliez par 4 pour corriger pour la dilution.</li>
	<li>Diviser la concentration du FITC-dextran par le poids de normaliser les valeurs (cela permet de normaliser la différence dans la livraison de la FITC-dextran si les souris sont malades et ont perdu du poids).</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. Les cellules Caco-2BBe (brosse exprimant frontière) sont toujours utilisés pour la mesure de TER, sélectionnée dans la lignée de cellules Caco-2 pour l’expression des protéines de la bordure en brosse. Les cellules Caco-2BBe ont un phénotype d’absorption de villosités lorsque complètement dissociés (après environ 3 semaines de confluence après culture)17. Il est nécessaire d’éviter toute contamination pendant la mesure et de stériliser l’électro...

Les cellules épithéliales intestinales ne sont pas seulement responsables de l’absorption des nutriments, mais constituent également un obstacle important pour se défendre contre les micro-organismes pathogènes et des toxines microbiennes. Cette fonction de barrière intestinale est régulée par la perméabilité de la jonction serrée et cellules épithéliales intégrité1,2,3, et le dysfonctionnement de la fonction de barrière épithéliale est associé à inflammatoires de l’intestin maladie (MICI). L’anneau d’actomyosine perijunctional (PAMR) se trouve dans la cellule qui est étroitement accolée à des jonctions serrées. La contraction de la PAMR, qui est régi par la chaîne légère de la myosine (MLC), est cruciale pour le règlement de la jonction serrée perméabilité4,5,6,7,8, 9,10. Facteur de nécrose tumorale (TNF) est au cœur de la perte de la barrière intestinale par cytoprotectrices expression intestinale épithéliale kinase (MLCK) MLC et induisant occludin internalisation11,12,13.
Ions tels que Na+ et Cl– peut traverser l’espace paracellulaire par le pore ou fuite voie14. Dans un épithélium « Baveur », changements de TER reflètent principalement perméabilité altérée de jonction serrée. Mesure de TER est une approche électrophysiologique couramment utilisée pour quantifier la perméabilité de jonction serrée, principalement à Na+ et Cl-, basée sur l’impédance des monocouches de cellules. Types de cellules différentes, y compris les cellules épithéliales intestinales, les cellules épithéliales pulmonaires et les cellules endothéliales vasculaires, ont été signalés pour des mesures de TER. Avantages de cette méthode sont que TER mesures sont non invasif et peuvent être utilisés pour surveiller des cellules vivantes en temps réel. En outre, la technique de mesure de TER est utile pour la drogue toxicité études15.
Caco-2BBe cellules sont des cellules d’adénocarcinome colorectal épithéliales humaines avec une structure et une fonction semblable aux petites cellules épithéliales intestinales différenciées : par exemple, ces cellules ont des microvillosités et enzymes associées à petite brosse intestinale frontière. Par conséquent, cultivées monocouches de Caco-2BBe sont utilisés comme modèle in vitro pour tester la fonction de barrière.
Chez la souris, une façon d’étudier la perméabilité paracellulaire intestinale est en mesurant la capacité du FITC-dextran à traverser de la lumière dans le sang. Ainsi, la perméabilité intestinale peut être évaluée par gavage FITC-dextran directement dans la souris et en mesurant la fluorescence dans le sang. Le protocole suivant décrit deux méthodes simples pour évaluer la perméabilité de l’épithélium intestinal in vitro et in vivo.

<table><tbody><tr><td>Aiguille à gavage 22 G</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-dextran</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Noir Plaques 96 puits pour fluorescence</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>Souris C57/B6 Institut</td><td>de recherche biomédicale de Nanjing de l’Université</td><td></td><td></td>de Nanjing</tr><tr><td>Cellules Caco-2BBe</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran sodique</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>DMED avec glucose et pyruvate de sodium élevés</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>Épithélial (Volt/Ohm) Compteur</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sinopharm ChimiqueRéactif</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Tube Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430791</tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td>Microscope</tr> à <tr><td>fluorescence</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimètre</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 0,4 mM MgSO4, 0,5 mM MgCl2, 5,0 mM KCl, 0,3 mM KH2PO4, 15,0 mM HEPES, 1,3 mM CaCl2, 25 mM de glucose&nbsp ;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>Centre modulaire d’enrobage tissulaire</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement de sérum</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flacon</td><td>corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Parraffin</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Membranes en polycarbonate (Transwell)</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à pression</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>Microtomie rotative</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Sinopharm ChimiqueRéactif</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro et in vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

La barrière intestinale défend contre les micro-organismes pathogènes et toxines microbiennes. Sa fonction est réglementée par la perméabilité de la jonction serrée et l’intégrité des cellules épithéliales, et perturbation de la fonction de barrière intestinale contribue à la progression de la maladie gastro-intestinale et systémique. Deux méthodes simples sont décrites ici pour mesurer la perméabilité de l’épithélium intestinal. In vitro, les cellules Caco-2BBe sont plaqués dans les puits de culture de tissu comme une monocouche et résistance électrique transépithéliale (TER) peut être mesurée par un compteur épithéliales (v/ohm). Cette méthode est convaincant en raison de son fonctionnement convivial et la répétabilité. In vivo, souris sont gavés avec 4 kDa isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran et les concentrations de FITC-dextran sont mesurées dans des échantillons de sérum prélevés chez des souris pour déterminer la perméabilité épithéliale. Gavage oral apporte une dose précise et par conséquent il est préférable de mesurer la perméabilité intestinale in vivo. Pris ensemble, ces deux méthodes permettant de mesurer la perméabilité de l’épithélium intestinal in vitro et in vivoet donc être utilisées pour étudier le lien entre les maladies et la fonction de barrière.

En culture, cellules Caco-2BBe croître comme une monocouche et lentement se différencient en des entérocytes absorption matures qui ont des frontières de la brosse. Dans ce protocole, les cellules Caco-2BBe ont été plaqués avec une forte densité sur la membrane en polycarbonate et cellules atteint 100 % confluence un jour après l’ensemencement. Cependant, les cellules sont indifférenciées, à ce stade : pour bien différencier les cellules, les médias sont changé tous les 2-3 jours pendant ...

Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

L’objectif global de cette expérience est d’étudier les maladies causées par le dysfonctionnement épithélial de barrière en mesurant la perméabilité épithéliale intestinale de cellules in vitro et in vivo. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la fonction de barrière intestinale, telles que celles liées à la maladie inflammatoire de l’intestin. Le principal avantage de cette technique est que la perméabilité intestinale des cellules épithéliales peut être évaluée à la fois in vitro et in vivo.Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie ou le diagnostic des maladies gastro-intestinales, parce que le dysfonctionnement épithélial intestinal de barrière contribue à ces maladies. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la fonction de barrière intestinale, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que des études de toxicité de drogue et l’intégrité de barrière d’autres types de cellules. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car certaines étapes sont difficiles à apprendre.Un fonctionnement précis de cette méthode peut maintenant être compris par description textuelle. Pour commenc

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole décrit l’utilisation de préparations de tissus intestinaux excisés ou « sacs intestinaux » comme modèle ex vivo de la fonction de la barrière intestinale. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale et de la couche de gel muqueux à des sites intestinaux spécifiques dans des modèles animaux de maladies digestives.

Ex Vivo intestinale Sacs pour évaluer la perméabilité de la muqueuse dans les modèles de maladies gastro-intestinales

Les traitements actuels des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) visent à soulager les symptômes de la maladie, mais peuvent entraîner des effets secondaires graves. Ainsi, les stratégies alternatives sont à l'étude dans les modèles de colite animales. Ici, nous expliquons comment les effets bénéfiques de compléments alimentaires sur les signes cliniques MII sont analysés dans un tel modèle de colite.

Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

L’accès des nutriments, de métabolites de la microbiote et de médicaments pour la circulation est contrôlée par la barrière intestinale-(GBB). Nous décrivons une méthode directe pour mesurer le GBB perméabilité in vivo, qui, contrairement aux méthodes indirectes couramment utilisés, n’est pratiquement pas affecté par les fonctions hépatiques et rénales.

Une méthode In Vivo pour l’évaluation de la barrière intestinale-sang et le métabolisme hépatique du microbiote produits

Profitant de la microscopie intravitale, la méthode présentée ici permet la visualisation en temps réel de l’excrétion cellulaire épithéliale intestinale chez les animaux vivants. Par conséquent, la muqueuse intestinale topiquement tachée (acriflavine et rhodamineB-dextran) des souris anesthésiées est image jusqu’à la résolution d’une seule cellule utilisant la microscopie confoccale.

Une approche à base de microscopie intravitale pour évaluer la perméabilité intestinale et la performance épithéliale de l’excrétion cellulaire

Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.

Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

La fonction épithéliale intestinale dérégulée de barrière et les immuno-réactions sont des cachets de la maladie d’entrailles inflammatoire qui restent mal étudiées en raison d’un manque de modèles physiologiques. Ici, nous décrivons un modèle intestinal de boucle de souris qui emploie un segment bien-vascularisé et extériorisé d’entrailles pour étudier la perméabilité muqueuse et le recrutement de leucocyte in vivo.

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Le présent protocole décrit une méthode qui utilise le jaune de lucifer dans un modèle entéroïde apical-out pour déterminer la perméabilité intestinale. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la perméabilité paracellulaire chez les entéroïdes qui modélisent les maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante.

Détermination de la perméabilité intestinale à l’aide du jaune de Lucifer dans un modèle entéroïde apical-out

Décrites ici sont des protocoles utilisés pour visualiser le processus dynamique de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire chez les animaux entiers et au niveau cellulaire. Ces méthodes peuvent être appliquées pour étudier la biologie cellulaire de refermeture membrane plasmique et la médecine régénérative.

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Découvrez comment mesurer la perméabilité épithéliale intestinale in vitro et in vivo chez la souris. Ces méthodes permettent d'étudier les maladies inflammatoires et d'évaluer la fonction de barrière intestinale.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

Explorer plus de vidéos