Prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes Murine 32D/G-CSF-R cellules

L'objectif général de cette expérience est de modifier génétiquement des cellules murines myéloïdes 32D-G-CSF-R en surexprimant ou en inhibant le gène d'intérêt, puis de déterminer l'effet de ces modifications sur la prolifération et la différenciation neutrophilique de la lignée cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématologie, telles que le rôle potentiel de votre protéine d'intérêt dans la croissance et la différenciation des cellules précurseurs myéloïdes. Le principal avantage de cette lignée cellulaire réside dans sa capacité de prolifération illimitée, sa sensibilité aux manipulations génétiques, son coût relativement faible, ainsi que la simplification biologique qu'elle permet, nécessaire pour certaines approches expérimentales. La démonstration de la procédure aujourd'hui sera assurée par Petr Danek, étudiant au doctorat dans mon laboratoire.

Préparez 250 millilitres de milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 10 nanogrammes par millilitre d'interleukine-3 murine. Préparez ensuite 50 millilitres de milieu de différenciation.

Dans une boîte de Pétri de 16 centimètres, ensemencer une suspension monocellulaire de cellules Bosc23 dans 18 millilitres de milieu DMEM complété avec 10 % de sérum de veau fœtal. Cultiver pendant environ 24 heures jusqu'à ce que la confluence atteigne 80 %. Ensuite, combiner le vecteur rétroviral MSCV, le vecteur d'emballage PCL-écho, la polyéthylènimine et un milieu à faible teneur en sérum sans antibiotiques. Incuber ce mélange dans une hotte à flux laminaire à température ambiante pendant 20 minutes. Puis remplacer soigneusement le milieu de culture des cellules Bosc23 par 16 millilitres de milieu DMEM préchauffé complété avec 2 % de sérum de veau fœtal maintenu à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite le mélange rétroviral goutte à goutte sur les cellules Bosc23. Incuber ensuite la culture à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Une fois l'incubation terminée, aspirez le milieu de culture Bosc23 et ajoutez 18 millilitres de milieu DMEM préchauffé contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. À l’aide d’une pipette serologique de 25 millilitres, prélèvez le milieu contenant le virus Bosc23 et transférez-le dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez le tube à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite 18 millilitres de milieu DMEM préchauffé contenant 10 % de sérum de veau fœtal aux cellules Bosc23 et cultivez les cellules pendant 24 heures.

Centrifuger le surnageant viral à 1 500 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, aliquoter le virus et le congeler rapidement à l’aide d’azote liquide pour le conserver à moins 80 degrés Celsius.

Dans chaque puits d'une plaque à six puits, ensemencer les cellules NIH/3T3 dans trois millilitres de milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal pour titrer un virus. Cultiver les cellules pendant une nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, diluer le virus avec du milieu préchauffé sans vortexer les particules virales. Aspirer le milieu de culture des cellules NIH/3T3 et ajouter un millilitre de virus dilué dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une nuit. Le jour suivant, aspirer soigneusement le milieu viral dilué et le remplacer par deux millilitres de milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal, puis incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une nuit. Après l'incubation, aspirer les anciens milieux et les remplacer par du milieu DMEM contenant deux microgrammes par millilitre de puromycine. Continuer la culture des cellules toutes les trois journées ou jusqu'à ce que le milieu devienne jaune, et renouveler avec du milieu frais contenant de la puromycine.

Entre le 10ᵉ et le 12ᵉ jour suivant l'infection, aspirez le milieu des puits et rincez délicatement avec du tampon phosphate salin. Ensuite, coloriez avec un millilitre de solution de violet de crésyl à température ambiante pendant deux minutes. Après la coloration, rincez soigneusement deux fois avec du tampon phosphate salin. Comptez le nombre total de colonies bleues présentes dans chaque puits au microscope.

Ensemencez les cellules 32D-G-CSF-R dans une plaque de six puits. Ajoutez le virus à une multiplicité d'infection comprise entre 10 et 40. Ajoutez ensuite de la polybrene pour obtenir une concentration finale de huit microgrammes par millilitre dans les cellules, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après l'incubation, regroupez les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 450 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Les cellules 32D peuvent partiellement perdre leur capacité à se différencier si elles sont cultivées à des concentrations supérieures à un million de cellules par ml ; par conséquent, il est très important de repiquer ces cellules en temps voulu et de ne pas surcroître les cultures.

Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans un flacon de culture T25 contenant six millilitres de milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur et 10 nanogrammes par millilitre d'interleukine-3 murine. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Lavez les cellules 32D-G-CSF-R deux fois avec du milieu RPMI-1640 sans cytokines. Ensuite, semez les cellules dans un millilitre de milieu de différenciation dans une plaque de 24 puits au jour zéro et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Les cellules mettront de sept à neuf jours pour se différencier en granulocytes matures. Puis comptez le nombre de cellules en utilisant le bleu de trypan pour exclure les cellules mortes.

Étant donné que l'IL-3 peut inhiber le processus de différenciation, il est absolument essentiel d'éliminer toute trace de cette cytokine avant de cultiver les cellules en présence de GCSF.

Centrifuger les cellules sur une lame de verre à l’aide d’une machine à centrifuger équipée des adaptateurs nécessaires, à 20 fois g pendant cinq minutes. Fixer ensuite les cellules dans du méthanol pendant cinq minutes à température ambiante et laisser sécher les cellules. Colorer les cellules en utilisant la coloration de May-Grünwald Giemsa selon le protocole du fabricant. Une fois colorées, observer les cellules ayant fixé la coloration en utilisant un grossissement de 40X.

En fonction de la morphologie cellulaire, quantifiez le nombre de blastes, de cellules différenciées de manière intermédiaire et de granulocytes matures parmi les cellules colorées.

Voici une représentation graphique illustrant la prolifération des cellules 32D-G-CSF-R dans un milieu contenant l'interleukine-3 et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes. L'axe des abscisses représente les jours de traitement, l'axe des ordonnées représente le nombre de cellules sur une échelle logarithmique. La courbe noire montre la prolifération lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu contenant l'interleukine-3. La courbe bleue montre une diminution de la prolifération cellulaire lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu contenant le facteur de stimulation des colonies de granulocytes.

Des diagrammes circulaires représentatifs et des colorations selon May-Grunwald Giemsa sont présentés ici, montrant la proportion et la morphologie de la différenciation des cellules 32D-G-CSF-R en présence de milieu contenant du facteur de stimulation des colonies de granulocytes. Les diagrammes circulaires illustrent la proportion de cellules blastiques, de cellules différenciées de manière intermédiaire et de neutrophiles après traitement par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes à zéro, deux, quatre et six jours. Les cellules colorées au Giemsa au jour zéro présentent de grands noyaux caractéristiques et un cytoplasme foncé. Au jour six, la taille du noyau est réduite et le cytoplasme est agrandi, mais pas foncé.

Des diagrammes circulaires représentatifs sont présentés ici, montrant une proportion plus élevée de cellules blastiques lorsqu'elles sont transduites avec des protéines de fusion BCR-ABL par rapport au vecteur contrôle MSCV, dans un milieu contenant du facteur de stimulation des colonies de granulocytes. La coloration de Giemsa dans le panneau inférieur est représentative des cellules transduites avec les protéines de fusion contrôle ou BCR-ABL.

Les cellules ont subi une différenciation neutrophilique au jour six lorsqu'elles ont été transduites avec le vecteur contrôle MSCV, mais les cellules transduites avec BCR-ABL présentaient majoritairement des cellules blastiques et aucun neutrophile mature.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de cultiver les cellules 32D-récepteur du G-CSF aux concentrations indiquées. Après cette procédure, d'autres méthodes comme des tests de migration et des expériences de survie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation de la lignée cellulaire 32D-récepteur du G-CSF, incluant la manipulation génétique par transduction lentivirale et rétrovirale, l'expansion, la différenciation, ainsi que l'évaluation de la prolifération et de la différenciation de ces cellules. N'oubliez pas que le travail avec des virus peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.