Name: Prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes Murine 32D/G-CSF-R cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Découvrez les protocoles de culture et de modification génétique des cellules précurseuses myéloïdes murines 32D/G-CSF-R pour étudier la prolifération et la différenciation neutrophilique. Cette méthode permet d'analyser le rôle des gènes dans l'hématologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient Prof. Ruud Delwel et Prof. Ivo Touw pour nous avoir fourni la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R et Prof. Daniel G. Tenen pour nous avoir fourni la lignée cellulaire de Bosc23. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence de Grant de la République tchèque (GACR 15-03796S et GACR 17-02177S) de la MA-J, le soutien de l’Institut de génétique moléculaire de l’Académie tchèque des Sciences (RVO 68378050) de la MA-J, une bourse de GA UK (projet n° 341015) de l’Université Charles à Prague pour MK et une bourse de GA UK (projet no 1278217) de l’Université Charles à Prague pour PD.

Remarque : La procédure décrivant l’expansion, la différenciation et la transduction des cellules-32D/G-CSF-R sont présentés ci-dessous.
1. préparation
<ol><li>Préparation des médias
	<ol>
<li>Préparer 250 mL de milieu de culture : milieu de 1640 de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) additionné de 10 % de chaleur inactivé FBS (sérum de veau fœtal) et murins IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>Vous pouvez également utiliser artisanale IL-3. Pour produire artisanale IL-3, transduce cellules HEK293 avec vecteur exprimant IL-3 et recueillir IL-3 contenant surnageant22. NOTE : Antibiotiques, tels que la pénicilline G (100 UI/mL), streptomycine (100 µg/mL) et gentamicine (40 µg/mL), peuvent être utilisés pour la culture des cellule à n’importe quelle étape du protocole, sauf indication contraire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer 50 mL de milieu de différenciation : milieu RPMI 1640 additionné de 10 % FBS et humaine de G-CSF (100 ng/mL). NOTE : (Important), pas de tous les lots de sérum soutiennent la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R. Avant le début de l’expérience, tester différents lots de sérum. Il est recommandé de tester au moins 4 lots différents et sélectionnez l’optimal basé sur la capacité des cellules-32D/G-CSF-R à différencier. Voir protocole de différenciation 32D/G-CSF-R ci-dessous.</li>
		<li>Préparer 10 mL de milieu de congélation : milieu RPMI 1640 additionné de 40 % FBS et 10 % DMSO (diméthyl sulfoxyde).</li>
	</ol></li>
	<li>Production des rétrovirus
	<ol>
<li>Une suspension monocellulaire de cellules Bosc23 (6 × 106) dans un plat de Pétri de 16 cm sur plaque et cultiver chez 18 mL de DMEM (milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco) contenant 10 % FBS jusqu'à la confluence de la culture atteint 80 % (24h). Remarque : Les cellules devraient croître en une monocouche et non forme des touffes dans la culture. Comptage de cellules peut être effectuée à l’aide de différentes méthodes (valables pour le reste des protocoles présentés ici). En cas de faible nombre d’échantillons, il est recommandé de comptage manuel sous le microscope à l’aide de Bürker chambre. Dans ce cas, utilisez le bleu Trypan pour l’exclusion des cellules mortes. Mélange 1:1 des cellules avec 0,4 % bleu Trypan dans du PBS. Pour effectuer le comptage du grand nombre d’échantillons, un compteur de cellule automatique peut être employé.</li>
		<li>Mélanger 40 µg de construction rétrovirale (notamment MSCV), 20 µg de pCL-Eco (vecteur d’emballage)23, 80 µl de PEI (polyethylenimine) et 2 mL de sérum réduit moyen (p. ex. Opti-MEM) moyen (sans antibiotiques). Incuber à ce mélange pendant 20 min à température ambiante (RT).</li>
		<li>Bosc23 milieu de cellules soigneusement remplacer 16 mL DMEM additionné de 2 % FBS. Réchauffez le milieu à 37 ° C avant utilisation. Remarque : N’utilisez pas d’antibiotiques au cours de la transfection, car elle peut réduire l’efficacité de la transfection.</li>
		<li>Ajouter le mélange préparé en 1.2.2. goutte à goutte et soigneusement la Bosc23 culture et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Limite d’incubation de moins de 6 h en raison de la toxicité du PEI.</li>
		<li>Après incubation, changer Bosc23 moyen à 18 mL préchauffée DMEM contenant 10 % FBS et de cultiver des cellules pendant 48 h à 37 ° C. Placer les capsules dans un laboratoire de niveau 2 de biosafety, garder ici de cette étape sur et suivez les procédures de sécurité standard.</li>
		<li>Bosc23 moyen (contenant ecotropic des particules rétrovirales) à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL dans un tube conique de 50 mL de recueillir et stocker à 4 ° C. Remarque : L’efficacité de la Transfection (Important) devrait atteindre 90 % pour produire un titre élevé de virus.</li>
		<li>Ajouter 18 mL préchauffée DMEM 10 % FBS à Bosc23 cellules et cultiver pendant 24 h.</li>
		<li>Répétez l’étape 1.2.6. NOTE : Retroviral surnageants de 1.2.6 et 1.2.8 peuvent être regroupés dès qu’ils atteignent la même température (4 ° C) afin de préserver l’intégrité virale.</li>
		<li>Pour éviter toute contamination de Bosc23 dans les surnageants de virales, spin virus prélevés à 1500 × g pendant 10 min à 4 ° C. Virus aliquote, snap gel à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche et conserver à-80 ° C. Toutefois, Notez que le virus fraîchement préparé est de meilleure qualité en termes d’efficacité de l’infection que les stocks congelés. NOTE : (Important) Eviter répétitive de gel/dégel du virus, car elle conduit à une dégradation virale.</li>
	</ol></li>
	<li>Production de lentivirus
	<ol>
<li>Une suspension monocellulaire HEK293T (rein embryonnaires humaines 293 t) cellules (6 × 106) dans un plat de Pétri de 16 cm sur plaque et cultiver chez 18 mL de DMEM contenant 10 % FBS jusqu'à la confluence de la culture atteint 80 % (24h). Remarque : Les cellules devraient croître en une monocouche et non forme des touffes dans la culture.</li>
		<li>Mélanger 15 µg de construction des gènes (par exemple, pGhU6), emballage des plasmides pCMVdR8.74 (encodage pour gag/pol, 12 µg) et pMD2.VSVG (encodage de VSV-G, 1,4 µg), 85.2 µL PEI et 2 mL de sérum réduit moyen (sans antibiotiques). Incuber à ce mélange pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Soigneusement remplacer HEK293T moyen par 16 mL de DMEM additionné de 2 % FBS. Réchauffez le milieu à 37 ° C avant utilisation. Ne pas utiliser antibiotiques au cours de la transfection, car cela pourrait réduire l’efficacité de transfection.</li>
		<li>Soigneusement, déposer le mélange préparé dans la section 1.3.2 à la culture de cellules HEK293T et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Limiter la durée d’incubation de moins de 6 h à prévenir la toxicité du PEI.</li>
		<li>Moyenne de changement à 18 mL préchauffée DMEM 10 % FBS et cultiver des cellules pendant 48 h à 37 ° C. Placer les capsules dans un laboratoire de niveau 2 de biosafety, garder ici de cette étape sur et suivez les procédures de sécurité standard.</li>
		<li>HEK293T moyen (contenant amphotropic de Particules Lentivirales) à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL dans un tube conique de 50 mL de recueillir et de conserver à 4 ° C. Remarque : L’efficacité de la Transfection (Important) devrait atteindre 90 % pour produire un titre élevé de virus.</li>
		<li>Ajouter avec précaution 18 mL de DMEM préchauffé 10 % FBS aux cellules HEK293T. Cultiver pendant 24 h à 37 ° C.</li>
		<li>Répétez l’étape 1.3.6. Remarque : Des gènes surnageants de 1.3.6 et 1.3.8 peuvent être regroupés dès qu’ils atteignent la même température (4 ° C) afin de préserver l’intégrité virale.</li>
		<li>Pour éviter toute contamination du surnageant viral avec cellules HEK293T, spin virus prélevés à 1500 × g pendant 10 min à 4 ° C. Virus aliquote, snap gel à l’aide d’azote liquide ou de glace sèche et conserver à-80 ° C. Toutefois, Notez que fraîchement préparé des virus est de meilleure qualité en termes d’efficacité de l’infection que les stocks congelés. NOTE : (Important) Eviter répétitive de gel/dégel du virus, car elle conduit à une dégradation virale.</li>
	</ol></li>
	<li>Titrage des virus contenant un reporter GFP
	<ol>
<li>Graines de 1 × 105 NIH/3 t 3 cellules dans 300 µL de DMEM 10 % FBS / puits dans une plaque de 24 puits. 7 puits seront employés pour les un virus titre.</li>
		<li>Décongeler les virus à 37 ° C et ajouter 1, 5, 10, 50, 100 et 500 virus µL à NIH/3 t 3 cultures. N’ajoutez pas n’importe quel virus dans contrôle négatif bien. Cultiver des cellules en présence de virus pendant 48 h à 37 ° C.</li>
		<li>Récolter les cellules NIH/3 t 3 avec 30 µL de trypsine/EDTA (acide éthylènediamine tétra-acétique) (0,25 % trypsine, EDTA de 0,01 % dans du PBS) et placer les cellules dans 250 µL PBS dans un tube de FACS (fluorescence activé cellule Tri).</li>
		<li>Déterminer la fréquence des cellules GFP+ par cytométrie en flux dans chaque échantillon24. Exclure les cellules mortes par ajout d’un colorant de la viabilité, comme Hoechst 33258.</li>
		<li>Calculer le nombre total de cellules GFP+ (basés sur le nombre de cellules plaqués et le pourcentage de cellules GFP+ ) et leur complot contre le volume de virus utilisé pour l’infection. NOTE : (Important) l’efficacité de l’infection atteint un plateau lorsque de fortes doses virales sont appliquées. Par conséquent, il est important d’estimer le titre basé sur la concentration virale à laquelle infection efficacité se produit dans une gamme de linéarité (exemple illustré dans le tableau 1). Le nombre de cellules GFP+ indique le nombre de particules virales fonctionnelles (TU - transformant des unités) dans un volume donné de virus. Recalculer le nombre de TU / mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Titrage des virus contenant un journaliste puromycine
	<ol>
<li>Graines de 5 × 104 NIH/3 t 3 cellules dans 3 mL de DMEM 10 % FBS / puits dans une plaque 6 puits ; emploient 6 puits au un virus titre. Culture nuit à 37 ° C.</li>
		<li>Lendemain diluer les virus comme il est indiqué dans le tableau 2. Pour diluer les virus, utilisez DMEM préchauffé 10 % FBS. Ne pas vortexer.</li>
		<li>Retirer le milieu de culture de cellules NIH/3 t 3 et ajouter 1 mL de virus dilué.</li>
		<li>Incuber une nuit à 37 ° C.</li>
		<li>Doucement de remplacer le support contenant le virus avec 2 mL de DMEM préchauffé 10 % FBS et incuber une nuit à 37 ° C.</li>
		<li>Remplacer doucement NIH/3 t 3 moyen avec 2 mL de préchauffé DMEM 10 % FBS contenant la puromycine (2 µg/mL).</li>
		<li>Culture à 37 ° C et soigneusement rafraîchissement moyen avec la puromycine tous les 3 jours ou quand milieu se colore en jaune.</li>
		<li>À 10-12 jours après l’infection, aspirer la moyenne de chaque puits et laver doucement avec du PBS.</li>
		<li>Tache avec 1 mL de solution de violet de gentiane (cristal violet 0,5 % à 20 % d’éthanol et dH2O), 2 min à ta et laver soigneusement avec du PBS.</li>
		<li>Compter les colonies bleues présentes dans chaque puits sous un microscope (grossissement X4). Eh bien, aucune colonie ne doit être observée dans le contrôle négatif.</li>
		<li>Calculer le nombre total de TU/mL tenant compte du facteur de dilution.</li>
	</ol></li>
</ol>2. l’expansion et l’entretien des cellules-32D/G-CSF-R
<ol><li>Si les cellules 32D/G-CSF-R sont figés, prélever une partie aliquote et dégel des cellules dans un bain-marie à 37 ° C pendant 1 min et verser dans le flacon directement dans 10 mL de pré chauffé additionné de RPMI 1640 à 10 % des cellules FBS dans un tube de 15mL. Inverser le tube 3 fois et faire tourner les cellules vers le bas à 400 × g. éliminer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans un milieu de culture contenant IL-3 à une concentration de 0,3 × 106 cellules/mL.</li>
	<li>La concentration de la croissance cellulaire optimale est de 0,25 à 0,5 × 106 cellules/mL. Fractionner les cellules tous les 2 jours amenant à une concentration de 0,1 à 0,2 × 106 cellules/mL. Remarque : Les cellules 32D/G-CSF-R (Important) peuvent partiellement perdent leur capacité de différencier si elles sont cultivées à des concentrations supérieures à 1 × 106 cellules/mL. Par conséquent, il est très important de scinder les cellules 32D/G-CSF-R à l’heure.</li>
	<li>Au besoin, congeler et stocker les aliquotes de la cellule pendant de longues périodes de temps à-80 ° C ou dans l’azote liquide. Tournez en bas 3 × 106 cellules, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de milieu de congélation. Placer le tube dans un récipient de congélation à-80 ° C. Pour le stockage à long terme, repositionner les cellules à l’azote liquide.</li>
</ol>3. transduction des cellules-32D/G-CSF-R
<ol><li>Cellules 32D/G-CSF-R de plaque en plaque 6 puits à une concentration de 0,3 × 106 cellules/mL.</li>
	<li>Ajouter la quantité appropriée de virus pour atteindre un MOI (multiplicité d’infection) entre 10 et 40. NOTE : MOI supérieur se traduira par l’augmentation du pourcentage de cellules GFP+ ainsi que des niveaux plus élevés d’expression du gène d’intérêt. Exemple : Pour infecter 0,3 × 106 cellules avec un MOI de 10 ; 3 × 106 TU devront être ajoutés aux cellules 32D/G-CSF-R.</li>
	<li>Ajouter polybrene à concentration finale 8 µg/mL et incuber pendant 6 h à 37 ° C. Vous pouvez également effectuer une procédure de spin-inoculation : centrifuger à 1200 × g pendant 90 min à 30 ° C dans une plaque de culture à l’aide d’un rotor de swing-seau et incuber pendant 3 h à 37 ° C.</li>
	<li>Cellules de collecter, transférer dans un tube de 15 mL et actionner à 450 × g pendant 5 min (4 ° C).</li>
	<li>Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules granulés dans 6 mL de milieu de culture, placer dans un flacon de culture cellulaire T25 et de la culture à 37 ° C.</li>
	<li>48 h plus tard, récolter les cellules et les essorer à 450 × g pendant 5 min (4 ° C). Jeter le surnageant.</li>
	<li>Dans le cas d’un journaliste GFP : placer les cellules dans 500 µL de PBS et trier les cellules GFP+ à l’aide d’un trieur de cytométrie de flux. Dans le cas d’un journaliste de puromycine contenant le vecteur : placer les cellules dans un milieu de culture contenant 2 µg/mL de puromycine.</li>
	<li>Développez les cellules nécessaires aux expériences et à une analyse plus approfondie. NOTE : (Facultatif) Transduced cellules peuvent être congelés dans de la presse dans un conteneur de congélation à-80 ° C et encore conservés dans l’azote liquide.</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R analyse de prolifération de cellules
<ol><li>Pour évaluer la prolifération taux place 0,2 × 106 cellules dans 1 mL de milieu de culture et incuber une nuit à 37 ° C.</li>
	<li>Lendemain compter nombre de cellules et diluer à une concentration de 0,2 × 106 cellules/mL à l’aide de milieu de culture. Incuber une nuit à 37 ° C. Tenir des registres des concentrations cellulaires et des dilutions appliquées aux cultures quotidiennes à l’aide du tableau 3.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.2 pour autant de jours que la prolifération doit être évaluée. Remarque : La longueur des prolifération des essais dépendra de l’effet du gène d’intérêt. Dans le cas d’un phénotype solide, 8-9 jours pourrait être suffisantes pour observer un effet significatif (voir la Figure 3 a). Toutefois, dans le cas d’un phénotype doux, de longues périodes de temps peuvent être nécessaires.</li>
	<li>Évaluer la croissance cellulaire en faisant une courbe de prolifération, comme il est indiqué dans le tableau 3.</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R test de différenciation des cellules
<ol><li>Laver 0,2 × 106 cellules 32D/G-CSF-R deux fois avec le milieu RPMI sans cytokines. Remarque : Les étapes de lavage avant l’ajout de G-CSF dans la culture sont importantes, car la présence d’IL-3 résiduelle peut inhiber la différenciation.</li>
	<li>Placer les cellules dans 1 mL de milieu de différenciation (contenant 100 ng/mL de G-CSF) dans un puits/plaque 24, ce qui entraîne une concentration de cellules de 0,2 × 106 cellules/mL (jour 0). Culture nuit à 37 ° C.</li>
	<li>Compter le nombre de cellules/mL comme indiqué ci-dessus (1.2.1 étape).</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 cellules sur une lame de verre (76 X 26 mm) en utilisant une centrifugeuse avec adaptateurs nécessaires à 20 × g.</li>
	<li>Actualiser la différenciation moyen et plaque de cellules à une concentration de 0,2 × 105 cellules/mL sur une plaque 24 puits / (jour 1). Jeter la vieille plaque et continuez le lendemain avec point 5.6 avec la nouvelle plaque.</li>
	<li>Jours 2 à 7, répétez les étapes 5.3 à 5.5. Évaluer la prolifération cellulaire en présence de G-CSF tel que décrit à l’étape 4. NOTE : (Important) au cours de la différenciation, la prolifération des cellules se ralentit, donc après 3 à 4 jours en présence de G-CSF, il est possible de cellules en culture à des concentrations plus élevées.</li>
	<li>Évaluer l’état de différenciation des cellules 32D/G-CSF-R basée sur la morphologie des cellules.<ol>
<li>Difficulté des cellules de l’étape 5.4 dans le méthanol pendant 5 min à ta et laisser les diapositives à sécher à l’air. NOTE : Diapositives de jour 0 à 7 peuvent être stockées sur RT et fixe en même temps. De même, ils peuvent également être conservés à RT pendant une période prolongée après fixation.</li>
		<li>Colorer les cellules à l’aide de May-Grünwald Giemsa souillant le protocole du fabricant suivant.</li>
		<li>Visualiser les cellules colorées à l’aide d’un microscope et grossissement X40.</li>
		<li>Quantifier le nombre de blastes, cellules moyennement différenciées et granulocytes mûrs à l’aide de photos illustratives sur la Figure 1 et la description du tableau 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le choix d’un modèle expérimental est l’une des principales questions de recherche. Si des cellules animales et humaines primaires sont censés produire des données plus biologiquement pertinentes, ces modèles peuvent impliquer des préoccupations d’ordre éthique et sont souvent associés avec les procédures d’isolement/culture coûteux et sophistiqués. Les cellules primaires sont limités en nombre et il est difficile de les manipuler génétiquement. Par ailleurs, les cellules primaires représentent une population hétérogène,...

La population de souches et progénitrices hématopoïétique fournit à l’organisme avec une grande variété de cellules matures, y compris les cellules de la lignée myéloïde (neutrophiles, éosinophiles, basophiles et monocytes). Le processus qui entraîne la production de cellules myéloïdes de cellules souches hématopoïétiques est connu comme myelopoiesis, et une production adéquate des cellules myéloïdes matures en réponse aux demandes changeantes est une condition sine qua non pour la bonne adaptation de l’organisme au stress conditions, telles que les infections et la perte de sang. Production insuffisante de cellules myéloïdes matures peut conduire à l’impossibilité d’éliminer les agents pathogènes, réduit la coagulation sanguine et autres mortelle conditions1,2. En outre, les modifications dans le développement de la lignée myéloïde peuvent également être associées avec des hémopathies malignes, telles que la leucémie myéloïde aiguë (AML)3. Altérations de myelopoiesis peuvent se produire pour diverses raisons, tels que les défauts dans la cellule récepteurs de surface4, expressions altérées de facteurs de transcription5, impaired signalisation des voies6, mutations entraînant la formation de / activation des oncogènes7ou inactivation de gènes suppresseur tumeur8.
Diverses méthodes ont été développées pour étudier le développement myéloïde et évaluer l’effet des altérations génétiques spécifiques dans ce processus. Des approches communes utilisées pour étudier myelopoiesis impliquent des cellules primaires et les souris transgéniques. Bien que ces modèles permettent l’acquisition des données pertinentes sur le plan biologique, ils ont certaines limites. L’utilisation de cellules primaires rencontre un nombre limité de cellules et une période de restriction de la culture, réduisant les possibilités pour modifier l’expression génétique et analyse biologique ou biochimique. Les souris transgéniques sont coûteuses et exigent un degré raisonnable de justification biologique. En outre, le travail avec des modèles in vivo ajoute un degré de complexité dans la compréhension du rôle d’un gène d’intérêt dans un processus donné. Par conséquent, les approches alternatives pour contourner ces limitations sont nécessaires. Lignées cellulaires ont des avantages incontestables : (1) ils possèdent la capacité de prolifération illimitée qui permet de générer assez de matériel pour les études biochimiques et biologiques, (2) ils sont sensibles aux manipulations génétiques (précipitation, knockout, surexpression), (3) le coût est relativement faible, et (4), elles permettent un degré de simplification biologique requis dans certaines approches expérimentales.
L’IL-3 parental (interleukine-3) dépendantes 32D lignée cellulaire a été créée en 1983 par Greenberger et ses collègues de l’infection des cellules de moelle osseuse de souris C3H/HeJ ami murine leukemia virus9. Plusieurs clones 32D ont été décrits dans la littérature : cl-239cl-310et cl-1011. Les cellules de cl-3 32D apparaissaient à proliférer dans IL-3 et subissent une différenciation neutrophilique après traitement avec des colonies de granulocytes stimulation facteur (G-CSF)10. Au contraire, 32D cl-10 cellules, tout en étant dépendant de l’IL-3, ont été à l’origine ne différenciant en réponse au traitement de G-CSF. En 1995 le groupe du Dr. Ivo Touw transduites retrovirally 32D cl-10 cellules de type sauvage et des formes mutantes de récepteur de G-CSF (G-CSF-R), afin d’identifier les régions fonctionnellement importantes de ce récepteur11. Cette étude a abouti à la génération des cellules-32D/G-CSF-R, qui dépendent de la même façon sur l’IL-3, mais dans les 6 à 10 jours après le remplacement de l’IL-3 avec le G-CSF, les cellules arrêtent pour proliférer et irréversiblement se différencient en neutrophiles matures. Ces propriétés font 32D cl-3 et modèles simplifiés 32D/G-CSF-R cellules murines différenciation neutrophiles qui peut être modulée par deux croissance bien définie et facteurs de différenciation - IL-3 et G-CSF. Durant les dernières décennies plusieurs groupes ont utilisé des cellules-32D/G-CSF-R pour étudier le rôle de certains gènes dans la prolifération et la différenciation des cellules myéloïdes en culture12,13,14,15 , 16et d’étudier le G-CSF, signalisation17,18. Ce qui est important, les résultats obtenus à l’aide de cette lignée cellulaire en corrélation avec les données obtenues avec les cellules primaires et les souris transgéniques16,19,20,21. En conséquence, nous pensons que les cellules 32D/G-CSF-R, étant un modèle largement utilisé et bien établi, représentent un système utile pour étudier la différenciation myéloïde qui peut être utilisée en parallèle avec d’autres approches de répondre à cette question.
Ici, les protocoles détaillés décrivant la manipulation de la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R, dont la couverture de l’expansion, la différenciation et l’évaluation de la prolifération et la différenciation de ces cellules est présenté. Information détaillée pour la modification génétique des cellules-32D/G-CSF-R, soit par transduction rétrovirale ou des gènes, ainsi que des protocoles pour le titrage de virus sont prévus. En outre, plusieurs résultats représentatifs qui illustrent les applications potentielles des cellules-32D/G-CSF-R sont fournis.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 poudre moyenne</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td><td>T 121-10</td><td>sans NaHCO3, avec L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>31985-047</td><td>L-Glutamine, Phénol</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin rouge (FBS)</td><td>Laboratoires PAA (GE Healthcare, Chicago, IL, États-Unis)</td><td>MT35011CV</td><td>Pour la différenciation des cellules 32D/G-CSF-R</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270</td><td>Utilisé pour la culture des cellules HEK293T, NIH3T3, BOSC23</td></tr><tr><td>Pénicilline</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>Sulfate de streptomycine en poudre</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>murin IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, États-Unis</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>humain G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, États-Unis</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine</td><td>Polyscience, Warrington, PA, États-Unis</td><td>23966</td><td>Linéaire, MW 25 000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, États-Unis</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Violet cristallin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Bleu trypan</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, États-Unis)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml ; nwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, Italie</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes murine 32d/g-csf-r cellules

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Compréhension de la biologie des cellules souches et progénitrices hématopoïétique a des implications importantes pour la médecine régénérative et le traitement des pathologies hématologiques. Malgré les données les plus pertinentes qui peuvent être acquis en utilisant des modèles in vivo ou des cultures primaires, la faible abondance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques restreint considérablement l’ensemble des techniques appropriées pour leur enquête. Par conséquent, l’utilisation de lignées cellulaires permet une production suffisante de matériel biologique pour l’exécution des examens préalables ou des dosages nécessitant un nombre de grandes cellules. Nous présentons ici une description détaillée, lecture et interprétation des tests de prolifération et la différenciation qui sont utilisées pour l’étude des processus impliqués dans la myelopoiesis et la différenciation des neutrophile. Ces expériences utilisent la ligne de cellule myéloïde murine dépendante de cytokine 32D/G-CSF-R, qui possède la capacité à proliférer en présence de l’IL-3 et se différencier dans le G-CSF. Nous fournissons optimisé des protocoles de traitement des cellules-32D/G-CSF-R et discuter les principaux écueils et les inconvénients qui pourraient compromettre les essais décrits et les résultats escomptés. En outre, cet article contient des protocoles pour la production des gènes et rétrovirale, titrage et transduction des cellules-32D/G-CSF-R. Nous démontrons que la manipulation génétique de ces cellules peut être employée pour réaliser avec succès des études moléculaires et fonctionnelles, qui peuvent compléter les résultats obtenus avec des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques primaires ou des modèles in vivo .

Prolifération et la différenciation des cellules-32D/G-CSF-R
Pour évaluer la prolifération des cellules 32D/G-CSF-R dans des conditions pro-prolifération et de Pro-différenciation, on a cultivé des cellules 32D/G-CSF-R dans des milieux contenant IL-3 et G-CSF, respectivement. Il a été observé que les cellules cultivées dans un milieu contenant IL-3 (10 ng/mL) divisent approximativement toutes les 24 h (Figure 2...

Ici sont présentés les protocoles détaillés pour cultiver la lignée murine précurseurs myéloïdes 32D/G-CSF-R, effectuant des infections virales et effectuer des tests de prolifération et la différenciation. Cette lignée cellulaire convient pour étudier le développement des cellules myéloïdes et le rôle des gènes d’intérêt dans la croissance des cellules myéloïdes et différenciation des neutrophile.

Prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes Murine 32D/G-CSF-R cellules

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

L'objectif général de cette expérience est de modifier génétiquement des cellules murines myéloïdes 32D-G-CSF-R en surexprimant ou en inhibant le gène d'intérêt, puis de déterminer l'effet de ces modifications sur la prolifération et la différenciation neutrophilique de la lignée cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématologie, telles que le rôle potentiel de votre protéine d'intérêt dans la croissance et la différenciation des cellules précurseurs myéloïdes. Le principal avantage de cette lignée cellulaire réside dans sa capacité de prolifération illimitée, sa sensibilité aux manipulations génétiques, son coût relativement faible, ainsi que la simplification biologique qu'elle permet, nécessaire pour certaines approches expérimentales. La démonstration de la procédure aujourd'hui sera assurée par Petr Danek, étudiant au doctorat dans mon laboratoire.Préparez 250 millilitres de milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 10 nanogrammes par millilitre d'interleukine-3 murine. Préparez ensuite 50 millilitres de milieu de différenciation.Dans une boîte de Pétri de 16 centimètres, ensemencer une suspension monocellulaire de cellules Bosc23 dans 18 millilitres de milieu DMEM complété avec 10 % de sérum de veau fœtal. Cultiver pendant environ 24 heures jusqu'à ce que la confluence atteigne 80 %. Ensuite, combiner le vecteur rétroviral MSCV, le vecteur d'emballage PCL-écho, la polyéthylènimine et un milieu à faible teneur en sérum sans antibiotiques. Incuber ce mélange dans une hotte à flux laminaire à température ambiante pendant 20 minutes. Puis remplacer soigneusement le milieu de culture des cellules Bosc23 par 16 millilitres de milieu DMEM préchauffé complété avec 2 % de sérum de veau fœtal maintenu à 37 degrés Celsius. Ajouter ensuite le mélange rétroviral goutte à goutte sur les cellules Bosc23. Incuber ensuite la culture à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.Une fois l'incubation terminée, aspirez le milieu de culture Bosc23 et ajoutez 18 millilitres de milieu DMEM préchauffé contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. À l’aide d’une pipette serologique de 25 millilitres, prélèvez le milieu contenant le virus Bosc23 et transférez-le dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez le tube à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite 18 millilitres de milieu DMEM préchauffé contenant 10 % de sérum de veau fœtal aux cellules Bosc23 et cultivez les cellules pendant 24 heures. Centrifuger le surnageant viral à 1 500 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, aliquoter le virus et le congeler rapidement à l’aide d’azote liquide pour le conserver à moins 80 degrés Celsius. Dans chaque puits d'une plaque à six puits, ensemencer les cellules NIH/3T3 dans trois millilitres de milieu DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal pour titrer un virus. Cultiver les cellules pendant une nuit à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, diluer le virus avec du milieu préchauffé sans vortexer les particules virales. Aspirer le milieu de culture des cellules NIH/3T3 et ajouter un millilitre de virus dilué dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une nuit. Le jour suivant, aspirer soigneusement le milieu viral dilué et le remplacer par deux millilitres de milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal, puis incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant une nuit. Après l'incubation, aspirer les anciens milieux et les remplacer par du milieu DMEM contenant deux microgrammes par millilitre de puromycine. Continuer la culture des cellules toutes les trois journées ou jusqu'à ce que le milieu devienne jaune, et renouveler avec du milieu frais contenant de la puromycine.Entre le 10ᵉ et le 12ᵉ jour suivant l'infection, aspirez le milieu des puits et rincez délicatement avec du tampon phosphate salin. Ensuite, coloriez avec un millilitre de solution de violet de crésyl à température ambiante pendant deux minutes. Après la coloration, rincez soigneusement deux fois avec du tampon phosphate salin. Comptez le nombre total de colonies bleues présentes dans chaque puits au microscope.Ensemencez les cellules 32D-G-CSF-R dans une plaque de six puits. Ajoutez le virus à une multiplicité d'infection comprise entre 10 et 40. Ajoutez ensuite de la polybrene pour obtenir une concentration finale de huit microgrammes par millilitre dans les cellules, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant six heures. Après l'incubation, regroupez les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 450 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Les cellules 32D peuvent partiellement perdre leur capacité à se différencier si elles sont cultivées à des concentrations supérieures à un million de cellules par ml ; par conséquent, il est très important de repiquer ces cellules en temps voulu et de ne pas surcroître les cultures. Jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans un flacon de culture T25 contenant six millilitres de milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur et 10 nanogrammes par millilitre d'interleukine-3 murine. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Lavez les cellules 32D-G-CSF-R deux fois avec du milieu RPMI-1640 sans cytokines. Ensuite, semez les cellules dans un millilitre de milieu de différenciation dans une plaque de 24 puits au jour zéro et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Les cellules mettront de sept à neuf jours pour se différencier en granulocytes matures. Puis comptez le nombre de cellules en utilisant le bleu de trypan pour exclure les cellules mortes.Étant donné que l'IL-3 peut inhiber le processus de différenciation, il est absolument essentiel d'éliminer toute trace de cette cytokine avant de cultiver les cellules en présence de GCSF.Centrifuger les cellules sur une lame de verre à l’aide d’une machine à centrifuger équipée des adaptateurs nécessaires, à 20 fois g pendant cinq minutes. Fixer ensuite les cellules dans du méthanol pendant cinq minutes à température ambiante et laisser sécher les cellules. Colorer les cellules en utilisant la coloration de May-Grünwald Giemsa selon le protocole du fabricant. Une fois colorées, observer les cellules ayant fixé la coloration en utilisant un grossissement de 40X.En fonction de la morphologie cellulaire, quantifiez le nombre de blastes, de cellules différenciées de manière intermédiaire et de granulocytes matures parmi les cellules colorées. Voici une représentation graphique illustrant la prolifération des cellules 32D-G-CSF-R dans un milieu contenant l'interleukine-3 et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes. L'axe des abscisses représente les jours de traitement, l'axe des ordonnées représente le nombre de cellules sur une échelle logarithmique. La courbe noire montre la prolifération lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu contenant l'interleukine-3. La courbe bleue montre une diminution de la prolifération cellulaire lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu contenant le facteur de stimulation des colonies de granulocytes.Des diagrammes circulaires représentatifs et des colorations selon May-Grunwald Giemsa sont présentés ici, montrant la proportion et la morphologie de la différenciation des cellules 32D-G-CSF-R en présence de milieu contenant du facteur de stimulation des colonies de granulocytes. Les diagrammes circulaires illustrent la proportion de cellules blastiques, de cellules différenciées de manière intermédiaire et de neutrophiles après traitement par le facteur de stimulation des colonies de granulocytes à zéro, deux, quatre et six jours. Les cellules colorées au Giemsa au jour zéro présentent de grands noyaux caractéristiques et un cytoplasme foncé. Au jour six, la taille du noyau est réduite et le cytoplasme est agrandi, mais pas foncé.Des diagrammes circulaires représentatifs sont présentés ici, montrant une proportion plus élevée de cellules blastiques lorsqu'elles sont transduites avec des protéines de fusion BCR-ABL par rapport au vecteur contrôle MSCV, dans un milieu contenant du facteur de stimulation des colonies de granulocytes. La coloration de Giemsa dans le panneau inférieur est représentative des cellules transduites avec les protéines de fusion contrôle ou BCR-ABL.Les cellules ont subi une différenciation neutrophilique au jour six lorsqu'elles ont été transduites avec le vecteur contrôle MSCV, mais les cellules transduites avec BCR-ABL présentaient majoritairement des cellules blastiques et aucun neutrophile mature. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de cultiver les cellules 32D-récepteur du G-CSF aux concentrations indiquées. Après cette procédure, d'autres méthodes comme des tests de migration et des expériences de survie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manipulation de la lignée cellulaire 32D-récepteur du G-CSF, incluant la manipulation génétique par transduction lentivirale et rétrovirale, l'expansion, la différenciation, ainsi que l'évaluation de la prolifération et de la différenciation de ces cellules. N'oubliez pas que le travail avec des virus peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Ce protocole décrit la dérivation de précurseurs gliales fœtales restreintes de la moelle épinière et maintenues in vitro, soit à la transplantation ou à l'étude de la lignée oligodendrogliome.

Dérivation de précurseurs gliales restreint de souris E13

Cette vidéo présente une méthode permettant d’obtenir des cellules de type cellules de Schwann à partir de cellules stromales multipotentes de moelle osseuse (BMSC). Initialement, les BMSC subissent un traitement par hypoxie, suivi d’une différenciation dirigée en cellules progénitrices neuronales. Par la suite, des milieux et des conditions de culture spécifiques sont utilisés pour induire la transformation de ces cellules progénitrices en cellules semblables aux cellules de Schwann.

Génération de cellules de type cellules de Schwann à partir de cellules stromales de moelle osseuse

Ce protocole décrit les procédures expérimentales pour évaluer la différenciation des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer de progéniteurs de cellules dendritiques ordinaires, en utilisant des techniques impliquant l'isolement FACS à médiation cellulaire, le transfert de gène hydrodynamique, et l'analyse des flux de sous-ensembles immuns dans les plaques de Peyer.

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

Dans cette étude, nous présentons un système de culture in vitro capable de générer efficacement des pDC en co-cultivant des progéniteurs lymphoïdes communs avec des cellules nourricières AC-6 en présence du ligand Flt3.

In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Découvrez les protocoles de culture et de modification génétique des cellules précurseuses myéloïdes murines 32D/G-CSF-R pour étudier la prolifération et la différenciation neutrophilique. Cette méthode permet d'analyser le rôle des gènes dans l'hématologie.

Prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes Murine 32D/G-CSF-R cellules

Explorer plus de vidéos