Une Time-lapse, sans étiquette et Quantitative Phase imagerie de cellules cancéreuses humaines dormantes et Active

L’objectif global de cette expérience est de caractériser quantitativement les phénotypes angiogéniques et non angiogéniques des cellules d’ostéosarcome humain de manière systématique en combinant des analyses de la morphologie, de la prolifération et de la motilité cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l’établissement et la progression du cancer humain. En particulier, la sortie de la dormance tumorale et le switch endogène.

Le principal avantage de cette technique est que les paramètres multicellulaires peuvent être analysés simultanément par cette méthode intégrée à haute étalement. Cela comprend la surface de la cellule, l’épaisseur de la cellule, le volume de la cellule, le taux de prolifération, le temps de doublage, la vitesse de motilité, la migration et la motilité. Pour commencer, préchauffez le milieu de culture à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau.

Retirez ensuite les flacons cryogéniques de cellules d’ostéosarcome humain angiogéniques et non angiogéniques du réservoir d’azote liquide. Plongez le fond des flacons dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius et secouez doucement les flacons cryogéniques pour accélérer le processus de décongélation. Dès que les cellules sont décongelées, vaporisez le flacon avec de l’éthanol à 70 % et essuyez le flacon pour le stériliser.

Ensuite, aspirez immédiatement la suspension cellulaire du flacon et suspendez-les doucement dans 10 millilitres de milieu de culture chauffé. Ensuite, centrifugez les suspensions cellulaires pendant cinq minutes pour granuler les cellules. De retour dans la hotte, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu de culture chauffé.

Transférez ensuite la suspension cellulaire dans une fiole T75. Pipetez doucement la suspension cellulaire plusieurs fois pour disperser uniformément les cellules. Placez le flacon dans un incubateur et laissez les cellules se fixer pendant au moins 12 heures.

Changez de milieu de culture tous les deux à trois jours. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 100 %, retirez le milieu de culture du ballon et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS stérile sans calcium ni magnésium. Ajoutez ensuite un millilitre d’une solution EDTA tripson à 0,25 % dans le ballon et agitez brièvement le ballon.

Incuber le ballon pendant deux à trois minutes, puis vérifier les cellules au microscope pour s’assurer qu’elles sont arrondies et détachées. Une fois les cellules détachées, utilisez une pipette pour ajouter 10 millilitres de milieu de culture et pipetez doucement le milieu de haut en bas plusieurs fois pour briser les agrégats cellulaires restants. Après avoir compté les cellules, ensemencez deux millions d’entre elles dans une nouvelle fiole T75.

Placez le flacon dans un incubateur et faites croître les cellules jusqu’à une confluence comprise entre 80 et 100 % avant d’ensemencer les cellules pour l’expérience d’imagerie de phase quantitative. Récoltez les cellules par digestion tripson et ensemencez des cellules d’ostéosarcome humain angiogéniques et non angiogéniques dans six plaques de puits à la densité de 50 000 à 300 000 cellules par puits. Couvrez les cellules avec un total de cinq millilitres de milieu de culture.

Ensuite, incubez les plaques pendant au moins 12 heures pour laisser le temps aux cellules de se fixer. Remplacez le support par un support frais avant l’imagerie. Nettoyez une lamelle en la rinçant plusieurs fois à l’eau courante déminéralisée.

Ensuite, plongez-le dans une solution à 75 % d’éthanol pendant 15 minutes. Placez la housse stérilisée dans une hotte à flux laminaire pour la faire sécher. Ensuite, placez soigneusement le couvercle dans une assiette à six puits, en évitant les bulles évidentes.

Placez la plaque dans l’incubateur pour qu’elle s’équilibre pendant au moins 15 minutes. Si de la buée se forme sur le couvercle de la plaque, utilisez un coton-tige stérile pour l’essuyer avant l’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie de phase quantitative et initialisez le système.

Assurez-vous que les valeurs sont acceptables dans l’auto-étalonnage du temps d’exposition, du contraste du motif et du bruit de l’hologramme. Ensuite, placez la plaque à six puits sur la platine du microscope à image de phase quantitative. De retour dans le logiciel, cliquez sur capture en direct.

Allez ensuite dans le menu de mise au point du logiciel et sélectionnez manuel. Ensuite, allez dans le menu de réglage du microscope et faites grossièrement la mise au point des images de phase des cellules en ajustant la distance de travail pour obtenir des contours pour les cellules dans les images de phase. Lorsque vous avez terminé, revenez au menu de mise au point du logiciel et modifiez le paramètre de mise au point sur automatique.

Cliquez maintenant sur une nouvelle expérience. Commencez à sélectionner les positions d’acquisition d’images à l’aide de la souris ou des touches fléchées du pavé numérique. Cliquez sur Mémoriser après chaque sélection.

Une fois que les positions ont toutes été sélectionnées, allez dans la section time lapse et configurez les intervalles d’imagerie de manière à ce qu’ils soient inférieurs à cinq minutes et que la période totale soit de 48 heures. Démarrez l’expérience en cliquant sur capturer. Cela permettra de faire la mise au point et d’acquérir automatiquement des images aux positions sélectionnées à chaque point temporel de l’intervalle.

Suite à l’acquisition de l’image, analysez la morphologie des cellules en cliquant d’abord sur identifier les cellules. Ajustez le paramètre numérique du seuil d’arrière-plan afin que les zones de cellule soient bien séparées du bruit de fond. Ajustez ensuite le numéro de réglage de la taille de l’objet pour vous assurer que chaque cellule n’a qu’un seul noyau.

Modifiez manuellement les segments de cellule qui ne correspondent pas à cette exigence à l’aide des modifications manuelles. Utilisez ensuite la fonction d’analyse des données du logiciel pour analyser les cellules. Démarrez une nouvelle analyse de données en cliquant sur Nouvelle analyse.

Faites glisser les images sélectionnées dans l’onglet des images sources et enregistrez les paramètres de morphologie des cellules, notamment la surface de la cellule, l’épaisseur optique et le volume de chaque cellule. Lorsque vous avez terminé, choisissez le mode nuage de points ou histogramme et exportez les données sous forme de tableaux ou de figures. Sélectionnez au moins cinq images espacées de 12 heures et notez les numéros de cellule fournis par le logiciel.

Estimez le taux de prolifération des cellules en normalisant avec les numéros de cellule initiaux, puis en traçant les numéros de cellule. Enfin, estimez le temps de doublement en ajustant les points de données à l’aide d’une courbe de croissance exponentielle. Pour analyser le mouvement des cellules, utilisez la fonction de suivi des cellules dans le logiciel.

Commencez par cliquer sur nouvelle analyse pour lancer une nouvelle analyse de données. Faites ensuite glisser une série d’images de la période d’intérêt dans l’onglet des images source. Ensuite, sous le mode de sélection Ajouter des cellules, choisissez au hasard 10 à 30 cellules en cliquant dessus.

Assurez-vous de vérifier le suivi dans la série d’images. Dans le cas où le système perd la trace d’une cellule ou suit la mauvaise cellule, ajustez manuellement la cellule de suivi en cliquant sur identifier pour identifier les cellules ou en passant en mode de sélection et en cliquant sur Modifier l’emplacement pour modifier l’emplacement d’une cellule. Lorsque vous avez terminé, allez dans Tracer le mouvement et choisissez Lignes Tracer les trajectoires des cellules ou Allez dans Tracer les caractéristiques et tracer pour les autres paramètres liés au mouvement, tels que la motilité, la vitesse, la motilité, la migration et la directivité de la migration.

Exportez les données sous forme de tableaux ou de figures. Dans ce protocole, les images de phase quantitatives sont présentées sous forme d’hologrammes. Les cellules montrées ici représentent la morphologie cellulaire typique des cellules d’ostéosarcome humain angiogénique et non angiogénique.

L’épaisseur de la cellule est calculée par l’indice de réfraction et la longueur du chemin optique et est représentée ici sous forme de nuage de points. Les deux types de phénotypes cellulaires différents présentaient des schémas de distribution différents et indiquent que les cellules angiogéniques ont des surfaces cellulaires plus petites et une plus grande épaisseur cellulaire que les cellules non angiogéniques. Le taux de prolifération cellulaire des deux types de cellules peut être calculé à partir d’images 2D telles que celles-ci, qui ont été segmentées et s’étendent sur deux jours.

Pour ces types de cellules spécifiques, aucune différence significative n’a été observée. Pour déterminer les caractéristiques de mouvement des cellules, il faut sélectionner des cellules individuelles et les suivre au fil du temps. Ici, les cellules suivies sont entourées de différentes couleurs.

Chaque cellule individuelle a été suivie pendant quatre heures avec sa trajectoire totale décrite ici où le point zéro, zéro est son emplacement de départ et son emplacement final est indiqué par le point de couleur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’imagerie de phase quantitative pour comparer quantitativement un ensemble de paramètres morphologiques et comportementaux cellulaires. Dans ce cas, entre les phénotypes cellulaires angiogéniques et non angiogéniques.

Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer l’échappement de la dormance tumorale et le rôle de l’angiogénétique dans ce processus. Dans une plateforme continue et non étiquetée. N’oubliez pas que travailler avec des lignées cellulaires humaines peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.