Traitement combinatoire de la trichostatine A et la vitamine C améliore l’efficacité du clonage de souris par transfert nucléaire de cellules somatiques

L’objectif global de cette expérience est d’améliorer l’efficacité de la production d’embryons reconstruits et de souris clonées en utilisant le transfert nucléaire de cellules somatiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie fondamentale, de la biologie du développement et du sauvetage des animaux en voie de disparition. Tels que le développement embryonnaire, la programmation nucléaire et la conservation de la recherche génétique.

Le principal avantage de cette méthode et de cette technique est qu’il est possible de générer des souris clonées avec un niveau d’efficacité pratique avec des procédures simples. Après avoir préparé le milieu de culture conformément au protocole textuel, dissoudre 1,2 gramme de BSA dans 10 ml d’eau stérile à température ambiante. Ajoutez environ 0,12 gramme de billes de résine échangeuse d’ions mélangés à la solution BSA à température ambiante en agitant doucement.

Lorsque les billes changent de couleur du bleu-vert à l’or, utilisez une pipette pour récupérer la solution surnageante, puis remplacez les billes par un lot frais. Après avoir vérifié que les billes fraîches ne changent pas de couleur, récupérez la solution. Ajoutez ensuite 250 microlitres de bicarbonate de sodium à 10,5 %.

À l’aide d’un filtre de 0,45 micron, stérilisez le surnageant, puis étiquetez-le comme solution mère DBSA et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Après avoir effectué l’euthanasie sur des souris femelles soumises à une superovulation selon le protocole de texte, utilisation de techniques de dissection standard pour inciser l’abdomen afin d’accéder à l’appareil reproducteur. À l’aide de petits ciseaux droits et d’une pince à épiler, extirpez les oviductes et transférez-les sur une feuille de papier filtre pour essuyer le sang de la surface.

Ensuite, placez les oviductes dans de l’huile minérale, puis utilisez des aiguilles de dissection pour découper l’ampoule de l’oviducte et déplacer les complexes ovocytaires cumulus provenant de l’ampoule dans des gouttes de 200 microlitres de milieu HCZB avec 0,1 % d’hyaluronidase. Incuber le tissu sur une plaque chauffante pendant cinq minutes. Au stéréomicroscope, confirmer que les cellules du cumulus sont libérées des complexes ovocytaires du cumulus, puis transférer les ovocytes du deuxième stade méiotique ou de la métaphase M2 avec quelques cellules de cumulus restantes dans un milieu MKSOM contenant 0,3 % de DBSA.

Lavez les ovocytes du stade M2 quatre fois en pipetant de haut en bas dans le milieu pour détacher les cellules de cumulus restantes. Ensuite, incubez les ovocytes dans un milieu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à l’énucléation. Pour isoler les ovocytes dénudés des complexes ovocytaires cumulus, à l’aide d’une pipette, transférez un petit nombre de cellules cumulus restantes dispersées à partir des complexes ovocytaires cumulus dans un milieu HCZB avec 6 % de DBSA.

Placez les cellules du cumulus sur la plaque chauffante à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour le transfert nucléaire de cellules somatiques ou SCNT. Après avoir préparé le milieu PVP et les solutions mères de CB conformément au protocole textuel, utilisez une pipette stérilisée avec 20 microlitres de milieu HCZB contenant cinq microgrammes par millilitre de CB pour laver les ovocytes du stade M2. Après avoir répété le lavage cinq fois, incubez les ovocytes dans une solution d’énucléation sur la plaque chauffante pendant 10 minutes.

Ensuite, préparez la chambre d’énucléation, puis utilisez une pipette pour transférer les ovocytes M2 dans la chambre. Ajoutez quatre microlitres de solution d’énucléation et couvrez la chambre d’huile minérale. Au microscope à température ambiante, identifiez les fuseaux et les chromosomes de l’ovocyte du stade M2.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de maintien et d’une micropipette, orientez l’ovocyte avec un premier corps polaire prononcé de sorte que le positionnement du fuseau et du chromosome soit à la position 3:00 ou 9:00. Réglez l’intensité de l’impulsion de paizo sur trois à six et, à l’aide d’une pipette de micromanipulation, percez dans la zone pellucide et ouvrez-y un trou. Ensuite, avec une quantité minimale de cytoplasme, énucléez complètement les fuseaux et les chromosomes.

Sous la lumière visible, confirmez l’absence de chromosomes dans le cytoplasme, puis avec un milieu MKSOM contenant 0,3 % de DBSA manquant de CB, lavez soigneusement les ovocytes énucléés. Incuber la parabole à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à la fusion des cellules. Pour préparer l’HBJE, ajoutez 260 microlitres de solution de suspension HBJE glacée au HVJ-E lyophilisé, et pipetez de haut en bas jusqu’à ce qu’il soit complètement suspendu.

Préparez cinq aliquotes d’un microlitre de la solution et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la fusion des cellules. Pour réaliser la fusion cellulaire, utilisez 20 microlitres de tampon de fusion cellulaire pour diluer cinq microlitres de solution HVJ-E. Placez la solution diluée d’HBJE sur de la glace jusqu’à utilisation.

Après avoir préparé la chambre de fusion cellulaire comme indiqué ici, utilisez une pipette pour transférer les ovocytes énucléés dans un milieu HCZB dans la chambre. Ajoutez quatre microlitres de chaque solution comme indiqué et utilisez environ un millilitre d’huile minérale pour couvrir la chambre. Placez la chambre avec les ovocytes énucléés à température ambiante sous un microscope à un grossissement de 400x.

Ensuite, à l’aide de la pipette de micromanipulation, transférez les cellules du donneur dans la solution de suspension HVJ-E. Aspirez les cellules du cumulus une par une pour les séparer de manière égale les unes des autres, ce qui permet la fusion cellulaire en série. Ensuite, à l’aide d’une pipette de maintien, conservez les ovocytes énucléés dans un milieu HCZB et utilisez l’impulsion de paizo avec la pipette de micromanipulation pour percer la zone pellucide.

Après avoir ouvert le trou dans la zone pellucide, pipetez une cellule de cumulus avec environ cinq fois le volume de la solution HVJ-E et expulsez-la fermement dans la membrane de l’ovocyte sans traverser la membrane. Après la manipulation de la fusion cellulaire, transférez rapidement les ovocytes dans un milieu MKSOM contenant 0,3 % de DBSA et déplacez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Les étapes de léther doivent être terminées dans les 10 minutes qui suivent la mise en place des ovocytes énucléés dans un milieu HCVB sous le microscope jusqu’à leur retour dans l’incubateur.

Après la fusion cellulaire, un microscope à un grossissement de 400x vérifie la condensation chromosomique prématurée dans les ovocytes reconstruits. Transférez les ovocytes reconstruits dans un milieu d’activation contenant de la trichostatine A, ou TSA, et incubez-les à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans l’air pendant six heures. Observez la formation des pronoyaux dans les embryons SENT, puis appliquez deux heures supplémentaires de traitement TSA dans un milieu MKSOM avec 0,3 % de TBSA.

Effectuez un traitement à la vitamine C selon le protocole textuel. Comme le montre ce tableau, le traitement à la TSA et à la vitamine C sur des ovocytes de souris clonées a montré un taux très élevé de formation de pronucléaires et s’est développé jusqu’au stade de deux cellules dans toutes les conditions. Certains embryons clonés, qui ont été dérivés de cellules de cumulus et développés au stade de deux cellules, ont été transférés dans des oviductes de femelles pseudo-enceintes.

Cette figure montre six descendants clonés qui se sont développés à partir de 72 embryons transférés produits à partir de trois femelles enceintes par le traitement en série à la TSA et à la vitamine C.Enfin, comme démontré ici, le traitement par TSA et VC a considérablement amélioré l’efficacité du développement embryonnaire in vitro jusqu’au stade de blastocyste. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que tous les milieux et réactifs nécessaires sont préparés à l’avance. La procédure elle-même, un matériel simple à suivre et bien préparé, garantira l’obtention des résultats escomptés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des ovocytes reconstruits.