Name: Un optimisé Evans Blue protocole pour évaluer une fuite vasculaire chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Découvrez une méthode optimisée au bleu d'Évans pour quantifier l'extravasation plasmatique chez la souris. Ce protocole économique et reproductible permet d'évaluer la perméabilité vasculaire dans divers organes et espèces.

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Les auteurs tiennent à remercier Andy Poczobutt et Dr Jori Leszczynski pour leur aide précieuse et les modifications à ce manuscrit.  Pris en charge par des subventions provenance du National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, HL014985 de PPG et RO3 HL095439) et l’anciens combattants Ministère des (examen du mérite).

Toutes les directives internationales, nationales et/ou institutionnels pour le soin et l’utilisation des animaux (souris) ont été suivis dans les expériences décrites dans ce manuscrit.
Cette méthode utilise des souris adultes FVBN, âgés de 16 à 20 semaines, jugées optimales pour l’application de la présente étude. Jour 1 comprend les étapes 1 à 5 et 2 jours comprend les étapes 6 et 7 (Figure 1).
1. matériel préparation
<ol><li>Garantir un approvisionnement suffisant de seringues stériles, jetables et aiguilles, si la kétamine/xylazine est utilisé comme l’anesthésie (comme recommandé). Si l’isoflurane est utilisé comme l’anesthésie, vérifier le réservoir d’oxygène et le niveau de liquide d’isoflurane pour s’assurer qu’un approvisionnement adéquat pour l’expérience avant de commencer. En outre, assembler l’ogive circuits de respiration et joignez-les à la boîte de l’induction ; Fixez nouvelles cartouches à charbon sur les circuits respiratoires. Préparer la zone induction en tournant sur l’oxygène et s’être assuré que la deuxième étape lit environ 50 lb/po2.</li>
	<li>Mettre en marche le coussin chauffant à 37 ° C.</li>
	<li>Préparer la sonde de température rectale à la chirurgie.</li>
</ol>2. préparation souris
Cette étape comprend l’anesthésie, l’épilation et positionnement (FVBN souris-âge adulte 16 à 20 semaines).
<ol><li>Peser les souris et noter leur poids.</li>
	<li>Anesthésier les souris.<ol>
<li>Administrer la kétamine et xylazine IP (80-100 mg/kg et 7,5-16 mg/kg, respectivement). Toutefois, il est recommandé de commencer avec faibles doses de kétamine et de xylazine (30 mg/kg et de 6 mg/kg, respectivement).</li>
		<li>Maintenir l’anesthésie avec environ 0,1 - 0,25 fois initiale des doses de kétamine/xylazine tout au long de la chirurgie. Kétamine et xylazine étaient les agents anesthésiques de choix dans cette étude, car plus de reproductibilité et de survie ont été observés. On trouvera les agents anesthésiques de choix dans d’autres études d’être différent.  Si l’isoflurane est utilisé, placez la souris dans une chambre à induction et allumez isoflurane à 5 % jusqu'à ce que la souris perd conscience complète. Ensuite, utilisez une pointe nasale fixée à 1,5 à 2,5 % isoflurane durant le reste de la procédure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Surveiller les souris toutes les 2-3 min par pincement d’orteil pour vérifier la profondeur appropriée de l’anesthésie.</li>
	<li>Raser la zone ventrale de cou de la souris.</li>
	<li>Placez votre souris en position couchée sur le pad préchauffé. Fixez les pattes et les pieds de la souris sur la surface chirurgicale avec du ruban adhésif.</li>
	<li>Placez la larme artificielle onguent sur les yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie.</li>
</ol>3. chirurgies détails
<ol><li>Faire une incision de 1 cm dans le cou juste ventral sur la veine jugulaire.</li>
	<li>Appliquer une ou deux gouttes de lidocaïne (1-2 %) dans la zone de l’incision pour la gestion de la douleur et à favoriser la vasodilatation. Attendez 2 min. de la lidocaïne prenne effet.</li>
	<li>Exposer et isoler la veine jugulaire interne droite par l’intermédiaire de dissection non tranchante. Attacher la veine avec suture 4-0 et retirer doucement l’extrémité rostrale du navire avec une pince hémostatique. Découpez un trou, à l’aide des ciseaux, environ 3 mm ci-dessous ou caudale à la cravate, environ à mi-chemin à travers le diamètre de la veine.</li>
	<li>Marquer un cathéter polyvinylique PV-1 à 1,5 cm de l’extrémité et insérez-le dans la veine jugulaire dans le trou à l’aide d’un dilatateur de navire et visser le cathéter vers l’extrémité caudale du navire, environ 1,5 cm.</li>
	<li>Attacher le cathéter solidement dans la partie caudale du navire (en dessous de la coupe), avec de la soie de 4-0. Attacher la partie rostrale du navire à l’extérieur du cathéter avec les deux bouts de la suture qui servait à attacher la veine jugulaire rostrale, à l’étape 3.3.</li>
	<li>Amure la peau lâche de retour ensemble autour de la sonde avec de la soie de 4-0 pour aider à prévenir la perte de chaleur corporelle et de la dessiccation des tissus.</li>
	<li>Raccorder le cathéter à une seringue contenant du sérum physiologique hépariné (10 U/mL) et rincer le cathéter.</li>
</ol>4. injections
<ol><li>Injecter la solution de bleu Evans (50 μL d’une solution de 30 mg/mL dans une solution saline normale, unheparinized de 0,9 %, ou environ 50 mg/kg) dans le cathéter de la veine jugulaire, suivi d’une petite quantité de sérum physiologique hépariné pour rincer la ligne.</li>
	<li>2 min plus tard, injecter la substance P (100 μL d’une solution de 0,3 μM dans une solution saline normale, unheparinized de 0,9 %, ou 1 nmol/kg), suivie d’une petite quantité de sérum physiologique hépariné pour rincer la ligne. La substance P augmente l’extravasation de protéines plasmatiques à travers la couche endothéliale ; dans ce protocole, il induit systématiquement une augmentation des valeurs de l’extravasation plasmatique d’environ 1,5 fois, faire de plasma extravasation valeurs, plus facile à mesurer.</li>
	<li>Attendre 18 min après que la substance P est injecté. Pendant ce temps, le colorant bleu Evans s’équilibrer, faire circuler.</li>
	<li>Mettre fin à l’expérience 18 min après l’injection de la substance P (20 min après l’injection de bleu Evans) en sacrifiant la souris avec dislocation cervicale. Il est probable que la souris peut être directement doivent disloqué, sans premier donner une surdose d’anesthésique, comme la souris est probablement encore bien anesthésié de la chirurgie. Toutefois, s’il le faut, une surdose de l’anesthésique kétamine/xylazine, isoflurane ou pentobarbital peut être donnée, suivie par dislocation cervicale.</li>
</ol>5. isolation des organes
<ol><li>Fend la cavité thoracique de la souris et gravité-perfuse (d’une hauteur d’environ 51 cm ou 20"), le cœur et les vaisseaux sanguins avec 50 mL de 50 mM du citrate de sodium, pH de 3,5. pH 3.5 conserve sans doute contraignant de bleu Evans à l’albumine.</li>
	<li>D’accise 1-5 organismes concernés (tissus) avec un scalpel dissection (p. ex. de la vessie, rein, estomac, foie, pancréas, proximale ou distale du côlon, iléon, duodénum, flanc peau, oreilles, queue, coeur, et poumons) et de supprimer tout contenu résiduel, si présents.</li>
	<li>Rincez les organes à température ambiante (RT) tampon phosphate salin (PBS ; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8,0 g de NaCl et 0,20 g de KCl dans 1 L, pH 7,4).</li>
	<li>Épongez les organes avec tissu, couper chaque organe en deux et peser chaque moitié (wet poids, g).</li>
	<li>Sécher une moitié du tissu dans une étuve à 150 ° C, sur une feuille, pendant 48 h.</li>
	<li>Placez les autres tissus de la moitié dans un volume cohérent (200 µL) de formamide dans un microtube tube pendant 48 h (et jusqu'à 72 h) pour extraire le bleu Evans.</li>
</ol>6. mesures de tissu OD
<ol><li>Enlever 50 µL de formamide d’infusé de bleu Evans (après une incubation de 48-72 h RT) du tube à centrifuger et lieu dans un puits d’une plaque 96 puits en polystyrène. Veillez à ne pas transférer des morceaux de tissu ainsi que le formamide.</li>
	<li>Place 50 µL de nouveau, pure formamide dans chacun des deux puits vides de la plaque à 96 puits pour les blancs.</li>
	<li>Mesurer et consigner la do620 de chaque puits de la plaque de 96 puits sur un lecteur de plaque d’absorbance. 620 nm est l’absorbance maximale de bleu Evans.</li>
</ol>7. calcul de l’Extravasation plasmatique
<ol><li>Peser le tissu sec la moitié qui a été dans le four pendant 48 h.</li>
	<li>Calculer le ratio de poids poids humide/sec pour l’organe spécifique d’intérêt de chaque souris individuels, commençant par le poids de ce tissu moitié (obtenu en étape 5.4), divisé par le poids sec de ce même tissu moitié (obtenu en étape 7.1).</li>
	<li>Calculer le poids sec (en g) du tissu moitié en formamide en divisant le poids du tissu moitié avant il a été placé en formamide (obtenu à l’étape 5.4) par la voie humide : ratio de poids sec pour l’organe spécifique d’intérêt (calculé à l’étape 7.2).</li>
	<li>Calculer les valeurs de620 OD corrigé . À partir de l' OD620 valeur de chaque puits expérimental de la plaque à 96 puits (contenant du formamide de Evans bleu infusé de chaque tissu, obtenu à l’étape 6.3), soustraire la vierge bien OD620 (la valeur moyenne OD620 de les deux puits contenant du formamide pur, préparé à l’étape 6.2, OD620 valeurs obtenues à l’étape 6.3) de chaque valeur expérimentale.</li>
	<li>Calculer la valeur de l’extravasation plasmatique en divisant le corrigé do620 (calculée en étape 7,4) par le poids sec du tissu moitié en formamide (calculée en étape 7.3). Les unités de l’extravasation plasmatique sera OD620/g de poids sec.</li>
	<li>Analyser les données et explicite sous forme de moyenne ± SEM. statistiquement comparer les groupes de test t ou analyse de variance et test de comparaison multiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), selon le cas.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme indiqué ci-dessus, l’étude de l’extravasation plasmatique pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. L’utilisation efficace du protocole extravasation plasmatique (ci-dessus), à l’aide de bleu Evans, a été démontrée dans le manuscrit actuel. Bien que les données affichées en arrière l’hypothèse que le NEP peut protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique, c’est un objectif secondaire actuellemen...

Une fuite vasculaire dans les organes se réfère à l’extravasation, ou fuite du plasma sanguin par des fentes produites dans l’endothélium des post veinules capillaires dans les organes. Cette extravasation plasmatique ou augmentation de la perméabilité vasculaire, qui peut-être découler d’une réaction inflammatoire quelconque, peut avoir des conséquences graves. Ainsi, il est important que ce phénomène, ses causes, les modulateurs et les conséquences, sont étudiés et compris, et même, que les enquêteurs ont bien des outils et protocoles permettant de les étudier. Les lacunes endothéliales peuvent être produits par un certain nombre de stimuli, mais sont habituellement produites par l’action des neurotransmetteurs peptidiques et/ou tachykinines sur l’endothelia. Un des principaux médiateurs naturels de ce processus, ce qui provoque l’extravasation plasmatique accrue, est l’undecapeptide TACHYKININE neuropeptide, la substance P1.
Méthodes d’enquêter et de mesurer la perméabilité vasculaire ou l’extravasation plasmatique, qui utilisent la propriété de liaison de l’albumine de bleu Evans, ont été développés et sont généralement réputés pour leur précision, simplicité, économie, sécurité et aptitude à permettre le détermination de l’extravasation plasmatique de plusieurs tissus à la fois, dans l’affirmative désiré2,3,4,5,6,7,8,9 . Ce protocole de bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN utilise tous ces, mais ajoute quelques modifications importantes qui le rendent généralement utile et adaptable pour de futures études, impliquant le laboratoire moyens qui effectue ou qui seront mener des études importantes des facteurs liés à l’extravasation plasmatique ou perméabilité vasculaire. Dans ce protocole, la substance P est introduite à la souris à 1 nmol/kg, ce qui augmente l’extravasation de plasma par 1,5 fois. Ceci augmente la sensibilité du protocole, ce qui entraîne plus facilement des résultats observables et réalisables. Autres facteurs qui influent sur la perméabilité, telles que diverses autres peptides, produits chimiques ou certaines formes de lésions toxiques, peuvent être utilisés ou étudiés par d’autres laboratoires, comme vous le souhaitez. Veine jugulaire injections sont utilisés dans le présent protocole qui va présenter le bleu Evans et substance P systémique, qui nécessite une chirurgie terminale. Cependant, veine jugulaire injections5,7,10, même après avoir examiné les techniques chirurgicales terminales nécessaires, sont plus faciles à maîtriser et conduire à la production de résultats plus cohérents qu’autre des injections veineuses, y compris la queue de la veine des injections4,9. Bien qu’il serait possible de bleu Evans doivent être fournis par des injections de sinus veineux rétro-orbitaire, aucuns références dans la littérature n’ont été trouvés qui utilisent cette méthode de livraison de bleu Evans. Toutefois, en ce qui concerne les injections de queue de veine, le degré élevé d’expertise et de la pratique de façon reproductible maîtriser cette technique très limite son utilisation pour des injections de bleu Evans réussies. En revanche, la méthode d’injection de rechange veine jugulaire, comme décrit dans notre protocole, offre une solution techniquement possible. Une procédure cruciale pour la perfusion des veines de la souris, effectué juste après le sacrifice de la souris sous perfusion bleu Evans, supprime les excès bleu Evans et a été normalisé par le présent protocole. Méthodes précédemment décrites de perfusion ont été soigneusement examinés et modifiés pour obtenir la procédure actuelle. Autres modifications décrites ici sont tous optimisés, simple et peu coûteux.
Il y a certaines limitations importantes de la méthode de colorant bleu Evans. Par exemple, faible sensibilité, parfois associée à cette méthode peut empêcher certains examen brut supplémentaire de pathologique et histologique des tissus provenant d’animaux d’injection de bleu Evans. Cependant, ceux-ci et autres contraintes ont conduit au développement de méthodes alternatives et des modèles qui, néanmoins, toujours utilisent bleu Evans. La mesure de bleu Evans par fluorescence (plutôt que par la portée visuelle) spectroscopie peut augmenter la sensibilité de la méthode. En outre, la microscopie de fluorescence des tissus de coloration bleu Evans a été développée pour permettre l’observation d’une fuite vasculaire en plus distincts endroits11. Aussi, confiné d’imagerie et d’analyse d’un animal vivant précédemment injecté avec Evans bleu12 permet d’enquête des concentrations de bleu Evans d’une manière continue, plutôt qu’au une propre fois choisi le point de l’expérience. Toutefois, cette méthode requiert la disponibilité d’installations d’imagerie appropriées et peut être très coûteuse. Les adaptations impliquant Evans bleu et interprété dans un type in vitro de modèle, comme dans une cellule culture ou poussin modèle Chorio-13 (CAM) ont également été décrites. Ces modèles sont surveillées par fluorescence et de la microscopie intravitale14 et permettent la quantification des modifications de la perméabilité vasculaire au fil du temps, mais peuvent soulever des questions au sujet de la modélisation précise de in vivo des conditions et peuvent également être cher.
Il y a eu des autres méthodes mises au point afin de déterminer et de quantifier une fuite vasculaire ou perméabilité, qui n’impliquent pas l’administration de bleu Evans. Ces méthodes peuvent employer une molécule fluorescente appropriée (comme l’albumine ou fluorescéine), ou une molécule tagged isotopiquement étiquetée ou autrement, d’animaux vivants (ou à la cellule culture ou Chorio (CAM) modèles13, suivi non invasif imagerie (balayage d’animal de compagnie, MRI, la microscopie intravitale, corps entier balayage) ou invasive d’imagerie (microscopie fluorescente)3,12,15. Bien que ces techniques peuvent offrir un certain nombre d’avantages par rapport aux autres Evans méthodes bleus, ils ont aussi des inconvénients, qui peuvent comprendre leur complexité considérable, compétences requises, les ressources et les coûts monétaires élevés.
Néprilysine16 (la peptidase enzyme NEP, également connu sous le nom CD10, MME ou enképhalinase) a été suggéré d’être impliqués dans l’inhibition de l’extravasation plasmatique, au moins en partie, par le métabolisme enzymatique et l’inactivation de P. de substance endogène Ainsi, dans les tissus où la peptidase de surface cellulaire NEP survient, il peut y avoir une atténuation de l’effet de la substance P, probablement par l’activité peptidase du NEP.
Au départ, nous avons testé pour l’extravasation plasmatique induite par la substance P utilisant ce protocole modifié de bleu Evans, avec FVBN sauvage (WT) et souris knockout (KO) de NEP. Participation de NEP à l’extravasation plasmatique augmentée la substance P a été soupçonnée de ces premières études, et nous décrire ces expériences plus rôle de NEP impliquant dans l’extravasation plasmatique. Toutefois, la mise au point de ce manuscrit n’est pas son rôle dans l’extravasation plasmatique ou NEP, mais plutôt l’extravasation plasmatique expériences eux-mêmes. Les résultats de la NEP sont représentatifs du type de résultats pouvant être obtenus via l’utilisation de ce protocole modifié. La méthode de bleu Evans pour mesurer l’extravasation plasmatique a été optimisée et modifiée, tel que décrit en détail ci-dessous pour les souris FVBN.

<table><tbody><tr><td>isoflurane</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>anesthésique inhalé</td></tr><tr><td>kétamine</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>anesthésique injectable</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td> seringues <td>anesthésiques injectables</td></tr><tr><td>(10,3 & 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, aiguilles 309659</td><td></td></tr><tr><td>(20G1,23G1 & 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>chambre d’induction isoflurane</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 litre</td></tr> de <tr><td>cône de nez circuits respiratoires&nbsp ;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Contrôleur de circuit pour rongeurs 2</td></tr><tr><td>réservoir d’oxygène</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100 % médical</td></tr><tr><td>coussin chauffant</td><td>CWE Inc.</td><td>Régulateur de température</td> <td>TC-1000</td></tr><tr><td>sonde de température rectale</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td> balance <td>de souris</td></tr><tr><td>(pour rongeurs)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>15000-00</td><td>Vannas Ciseaux à ressort 3mm lame droite (récipients de coupe)&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Outils de science fine</td><td>11151-10</td><td>Pince extra fine Graefe (isolant les vaisseaux de souris)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-hémostatiques</td><td>Outils de science fine</td><td>13009-12</td><td>Hémostats de Halstead-mosquito (dissection émoussée, maintien des tissus)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux -pilotes de sutures</td><td>Outils de science fine</td><td>12502-12</td><td>Pilotes de sutures Olsen-Hegar (suture)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Fine Outils scientifiques</td><td>11627-12</td><td>Pince crocodile Adson-Brown (suture de préhension tissulaire, rat)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>14110-15</td><td>ciseaux à coupe dure Mayo 15 cm (chirurgie, dissection, os, rat)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pince</td><td>Outils de science fine</td><td>18025-10</td><td>pince à attacher la suture (utilisée pour le cath Millar)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>14078-10</td><td>Lexer Ciseaux pour bébé droits (chirurgie, souris)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 pince à pointe fine (vaisseaux de rat, dissection)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-ciseaux</td><td>Outils de science fine</td><td>14082-09</td><td>Ciseaux de dissecteur 12 mm (chirurgie, souris rat</td></tr>)<tr><td>outils chirurgicaux-pince</td><td>Outils de science fine</td><td>11051-10 10</td><td>cm pince Graefe (préhension de tissus, souris rat)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-35</td><td>Pince Dumont 5/45 (introducteur pour vaisseaux)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-écarteurs</td><td>Outils de science fine</td><td>17012-11</td><td>écarteurs Weitlaner 2/3 dents (chirurgie du rat)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Outils de science fine</td><td>11294-00</td><td>Pince Dumont #4 (isolation des vaisseaux rats, souris)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pince</td><td>Fine Outils scientifiques</td><td>11297-00</td><td>Pince Dumont #7 (préhension tissulaire, dissection)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-ciseaux</td><td>Outils scientifiques</td><td>fins 14058-11</td><td>ciseaux à iris à coupe dure (dissection de souris, os)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11009-13</td><td>pince Semken dentelée, incurvée (préhension tissulaire, rat de souris)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-hémostatiques</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>13003-10</td><td>Hartman hémostatiques incurvés (dissection émoussée, maintien des tissus)</td></tr><tr><td>outils chirurgicaux-pinces</td><td>Outils de science fine</td><td>11006-12</td><td>Pince dentelée Adson (préhension des tissus)</td></tr><tr><td>tondeuses</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>pommade de larme artificielle</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaïne</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td></td></tr><tr><td>Cathéters</td> injectables en polyvinyle à 2 % <td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans bleu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substance P</td><td>Bachem&nbsp ;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>héparine</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>solution saline</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0,9 % chlorure de sodium</td></tr><tr><td>phénobarbital&nbsp ;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>citrate de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes Kimwipes pour buvard</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbalance</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>tubes microfuges</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polystyrène 96 plaque à puits</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>plaque d’absorbance lecteur</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>gels de polyacrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>protéine poids moléculaire étalon</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran soutenu nitrocellulose</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>boîte de gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de sodium</td><td>Fisher Anticorps</td> polyclonal primaire NEP <td>S271-1 de S271-1</td><td></td></tr><tr><td>.</td><td>R & D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline chow</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.130750&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>FVB/NJ souris de type sauvage</td><td>Jackson</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>anticorps secondaire (chèvre anti-lapin)</td><td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>ECL solution-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>film</td><td>Pierce</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

un optimisé evans blue protocole pour évaluer une fuite vasculaire chez la souris

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Une fuite vasculaire ou l’extravasation plasmatique, a un certain nombre de causes et peut être une conséquence grave ou un symptôme d’une réaction inflammatoire. Cette étude pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. Il est important que les chercheurs aient les outils appropriés, y compris les meilleures méthodes disponibles, pour étudier l’extravasation plasmatique. Dans cet article, nous décrivons un protocole, à l’aide de la méthode de colorant bleu Evans, pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN. Ce protocole est volontairement simple, à aussi grand un degré possible, mais fournit des données de haute qualité. Bleu Evans a été choisi principalement parce qu’il est facile pour le laboratoire moyen à utiliser. Nous avons utilisé ce protocole pour fournir des preuves et le soutien pour l’hypothèse que l’enzyme néprilysine pourrait protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique. Toutefois, ce protocole peut être expérimentalement utilisé et facilement adapté pour être utilisés dans d’autres souches de souris ou chez d’autres espèces, dans de nombreux différents organes ou tissus, pour les études qui peut impliquer des autres facteurs qui sont importants dans la compréhension, la prévention ou le traitement, extravasation plasmatique. Ce protocole a été grandement amélioré et modifiés de protocoles existants et combine fiabilité, facilité d’utilisation, économie et la disponibilité générale des matériaux et équipements, rendant ce protocole supérieur pour le laboratoire moyens à utiliser dans quantifier l’extravasation plasmatique des organes.

Dans la Figure 1, un schéma de la procédure est montré, qui a été trouvé pour entraîner les valeurs de l’extravasation plasmatique induite par la substance P plus fiable et cohérente des organes des souris FVBN. Cette procédure prend généralement deux jours de travail, séparés par au moins 48 h de délai d’attente. Il est possible de l’étendre encore plus, si cela est fait systématiquement pour toutes les expériences à comparer. Par exemple, après que les orga...

Un protocole simple, optimisé et économique décrit dans cet article, qui utilise la méthode du colorant bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN qui peuvent être adaptés à d’autres souches, espèces et autres organes ou tissus.

Un optimisé Evans Blue protocole pour évaluer une fuite vasculaire chez la souris

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

L’objectif général de ce protocole est d’évaluer et de quantifier relativement l’extravasation ou la fuite plasmatique dans les organes de souris ou d’autres espèces animales à l’aide d’une méthode modifiée de colorant bleu d’Evans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine vasculaire, telles que : quels facteurs endogènes ou exogènes modifient l’extravasation plasmatique chez une espèce ou un organe d’intérêt spécifique ? Le principal avantage de cette technique est que, bien que le cathétérisme nécessite un degré modeste de compétence chirurgicale, la méthode offre un accès veineux durable et est reproductible d’une souris à l’autre.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de la difficulté chirurgicale modeste de la mise en place du cathéter. Après avoir pesé une souris adulte FVB NJ âgée de 16 à 20 semaines, confirmez une absence de réponse au pincement des orteils et rasez la région ventrale du cou de l’animal. Placez la souris en position couchée sur un coussin préchauffé et collez les quatre pattes sur la surface chirurgicale.Appliquez une pommade sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement. Faites une incision d’un centimètre dans le cou ventral droit au-dessus de la veine jugulaire. Appliquez une ou deux gouttes de 1 à 2 % de lidocaïne sur la zone d’incision pour gérer la douleur et favoriser la vasodilatation.Isolez la veine jugulaire interne droite par dissection émoussée. Attachez la veine avec une suture 4-0 et utilisez un hémostat pour rétracter doucement l’extrémité rostrale du vaisseau. À l’aide de ciseaux fins, découpez un trou d’environ trois millimètres caudal jusqu’à la suture et à peu près à mi-chemin du diamètre de la veine.Ensuite, insérez un cathéter en polyvinyle PV1 dans la veine jugulaire à travers le trou et enfilez le cathéter sur environ 1,5 centimètre vers l’extrémité caudale du vaisseau. Utilisez une nouvelle suture 4-0 pour attacher solidement le cathéter dans la section caudale du vaisseau et attachez la partie rostrale du vaisseau à l’extérieur du cathéter avec les extrémités libres de la suture utilisée à l’origine pour attacher la veine jugulaire rostrale. Recollez la peau autour du cathéter avec un autre morceau de suture 4-0 pour prévenir la déshydratation, la perte de chaleur corporelle et la dessiccation des tissus.Ensuite, connectez le cathéter à une seringue contenant une solution saline héparinée et rincez le cathéter avec la solution saline. Pour évaluer l’extravasation et la fuite de l’organe d’intérêt, injectez d’abord 50 microlitres de solution Evans Blue dans le cathéter de la veine jugulaire, puis un petit volume de solution saline héparinée pour rincer la ligne. Deux minutes plus tard, injectez 100 microlitres de substance P dans le cathéter, suivi d’une deuxième injection de sérum physiologique hépariné.Dix-huit minutes après l’injection de la substance P, ouvrez la cavité thoracique de l’animal et perfuser par gravité le cœur et les vaisseaux sanguins avec 50 millilitres de solution de citrate de sodium à 50 millimolaires pour éliminer l’excès d’Evans Blue de l’intérieur des vaisseaux sanguins. Prélever les organes et les tissus d’intérêt et retirer tout contenu résiduel de chaque tissu si nécessaire. Rincez les organes dans du PBS à température ambiante, épongez les organes avec une lingette de laboratoire et coupez chaque organe en deux.Obtenez les poids humides de chaque moitié d’organe sur une balance et séchez 1/2 de chaque organe sur un morceau de papier d’aluminium dans une étuve de séchage à 150 degrés Celsius pendant 48 heures. Ensuite, placez l’autre moitié de chaque organe dans jusqu’à 200 microlitres de formamide dans un tube à microfuge pendant 48 à 72 heures pour l’extraction du colorant bleu Evans. Les souris knock-out de Neprilysin présentent une augmentation de l’extravasation plasmatique de la vessie induite par la substance P par rapport aux animaux de type sauvage, ce qui suggère un rôle de Neprilysin dans la régulation négative de l’extravasation plasmatique de la vessie induite par la substance P.Le traitement à la doxycycline de souris transgéniques pour la surexpression de Neprilysin pendant une semaine pour activer la surexpression de Neprilysin indique un rôle supplémentaire pour cette enzyme dans l’extravasation duodénale, car les animaux transgéniques traités à la doxycycline présentent une extravasation plasmatique induite par la substance P significativement réduite du duodénum par rapport aux trois groupes d’animaux, ce qui n’est pas observé après le traitement à la doxycycline d’animaux de type sauvage ou knock-out. Une fois maîtrisées, les étapes de cathétérisme, d’injection et d’isolement d’organe peuvent être réalisées en 45 à 55 minutes si elles sont effectuées correctement. Prévoyez deux à trois jours supplémentaires pour le reste du protocole.Lors de l’apprentissage initial de cette technique, il est important de répéter la procédure chez au moins 10 à 20 animaux d’entraînement avant d’effectuer une expérience. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer et de quantifier relativement l’extravasation ou la fuite de plasma dans les organes de souris ou d’autres espèces de petits animaux à l’aide de cette méthode modifiée de colorant bleu d’Evans.

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Les réponses allergiques, caractérisé par l'activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d'IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d'Evans pour suivre l'évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique.

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