L’analyse cinétique de vasculogénèse quantifie dynamique de vasculogénèse et angiogenèse In Vitro

L’objectif global de cette méthode expérimentale est de visualiser et de quantifier le processus dynamique de vasculogenèse au fil du temps. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’angiogenèse et de la vasculogenèse sur les taux de formation des vaisseaux et les différences entre les modèles structurels des réseaux formés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier un grand nombre de points temporels de vasculogenèse, ce qui permet d’évaluer la cinétique du processus vasculogénique.

Cette méthode peut être appliquée à toute population cellulaire ou état pathologique qui a un impact sur les processus de vasculogenèse ou d’angiogenèse pour l’étude de populations cellulaires individuelles ou de systèmes de co-culture. Environ une à deux heures avant de commencer l’expérience, préchauffez un incubateur supérieur de scène de microscope à 37 degrés Celsius et réglez le dioxyde de carbone à 5 % et l’humidité à 85 %. Remplissez le réservoir d’humidité de l’incubateur s’il est vide. Placez la chambre de la cellule vivante sur le microscope, puis placez une lame vide dans l’une des deux positions ouvertes à l’intérieur de la chambre de la cellule vivante.

Remplissez la diapositive d’eau distillée et réglez un ventilateur secondaire à 39 à 42 degrés Celsius pour chauffer les lames par le bas et minimiser la condensation. Le maintien de la température et de l’humidité appropriées à l’intérieur de la chambre d’imagerie des cellules vivantes est essentiel au succès de l’expérience. Ajoutez une deuxième diapositive en tant que lame vierge jusqu’à ce que la diapositive expérimentale puisse être ajoutée.

Ensuite, ajoutez de l’eau dans les réservoirs entourant les puits sur la deuxième lame pour imiter les conditions pendant l’expérience d’imagerie. Pour charger la lame de la chambre expérimentale avec une matrice de membrane basale, chargez d’abord une pipette de 20 microlitres avec une pointe de pipette froide de 20 microlitres et utilisez des ciseaux pour couper à environ un centimètre de l’extrémité de la pointe. Réglez le volume de la pipette à un niveau légèrement supérieur à 10 microlitres et aspirez lentement la matrice dans la pointe de la pipette modifiée.

Placez immédiatement la pointe de la pipette au centre d’un puits de lame, en touchant doucement la pointe au fond du puits, et appuyez lentement sur le piston pour pousser la matrice vers l’extérieur. Après avoir ajouté de la matrice dans les 15 puits, poussez le couvercle à fond sur la lame. Un pipetage précis et cohérent des volumes de Matrigel dans chaque puits est essentiel pour obtenir des images de contraste de phase de haute qualité.

Ensuite, placez la lame à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes à côté d’un capuchon de tube conique de 50 millilitres rempli de deux à trois millilitres de PBS pour réduire la déshydratation de la matrice. Lorsque la matrice s’est solidifiée, retirez le surnageant d’une culture cellulaire endothéliale formant une colonie et lavez les cellules avec sept millilitres de PBS. Aspirez le PBS, lavez et détachez les cellules avec deux à trois millilitres de trypsine à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes.

Ensuite, rémettez en suspension les cellules dissociées dans trois millilitres de Endothelial Growth Medium-2 pour briser les amas cellulaires et transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres. Une fois que tous les échantillons de cellules formant une colonie endothéliale ont été remis en suspension, granulez les cellules par centrifugation et remettez les granules en suspension dans un à deux millilitres de milieu de croissance endothéliale frais. Comptez le nombre de cellules viables dans chaque échantillon et ajoutez suffisamment de cellules endothéliales formant des colonies dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pour permettre la dilution des cellules à 1,4 fois 10 puissance quatre cellules par 175 microlitres de concentration moyenne.

Ensuite, mélangez chaque mélange principal avec un pipetage doux. Retirez le couvercle de la diapositive et versez 50 microlitres de chaque mélange maître par puits en trois exemplaires sur la lame. Pour imager les cellules, remplacez la lame vierge par une lame expérimentale et ajoutez de l’eau dans les réservoirs entourant les cellules de la lame.

Passez en revue chaque position de l’étape et vérifiez que le centre du premier puits est sélectionné. Concentrez-vous sur les cellules plaquées dans le puits et réglez la position Z de la scène. Lorsque les réglages sont précis, éteignez les lumières pour commencer l’expérience d’imagerie.

Une fois l’imagerie terminée, mettez à l’échelle et exportez les fichiers de pile d’images dans le logiciel Image Capture, en enregistrant les images sous forme de fichiers TIFF pour analyse. Pour analyser les images, faites glisser le fichier d’analyse cinétique de la vasculogenèse de son dossier vers la barre grise en bas de la fenêtre du logiciel pour ouvrir le logiciel, puis cliquez sur Enregistrer pour ajouter le logiciel à la liste. Cliquez sur Fichier et Ouvrir pour sélectionner le fichier image à ouvrir ou faites glisser le fichier image vers la barre grise du logiciel.

Cliquez sur Image, Ajuster et Luminosité/Contraste pour ouvrir la fenêtre Luminosité/Contraste. Cliquez sur Réinitialiser dans la fenêtre Luminosité/Contraste pour visualiser l’image. Ensuite, cliquez sur Image, Type et 8 bits pour convertir les images en 8 bits.

Sélectionnez Outils et Gestionnaire de régions d’intérêt, puis utilisez un outil de sélection de forme appropriée pour créer une nouvelle région d’intérêt. Cliquez sur Ajouter pour ajouter la forme de la région d’intérêt à la fenêtre du Gestionnaire de régions d’intérêt et cliquez sur l’étiquette Région d’intérêt dans le Gestionnaire de régions d’intérêt pour afficher la région sur l’image. Ajustez la région d’intérêt si nécessaire.

Lorsque la région est en place, cliquez sur Image, puis sur Recadrer, pour recadrer l’image. Ensuite, ouvrez le menu Edition et sélectionnez Effacer l’extérieur pour supprimer les données d’image en dehors de la zone d’intérêt pour chaque image de la pile. Ensuite, ouvrez le menu Plugins et sélectionnez le plugin Analyze Network.

Utilisez la flèche déroulante dans la fenêtre contextuelle pour modifier la méthode de seuillage et cliquez sur OK pour lancer le traitement du logiciel. À la fin de l’analyse, une table de données et une pile d’images fusionnées représentant les rendus du squelette et du masque s’ouvriront. Cliquez sur Fichier et Enregistrer sous pour transférer les valeurs numériques dans une feuille de calcul et enregistrez la feuille de calcul contenant les valeurs des données brutes.

Cliquez sur l’image du squelette et du masque fusionnés et enregistrez la pile d’images du masque squelette fusionné et la pile d’images à contraste de phase recadré en tant que fichiers TIFF. Ensuite, cliquez sur la fenêtre Gestionnaire de régions d’intérêt, sélectionnez la région d’intérêt utilisée pour recadrer les images, puis cliquez sur Plus, puis sur Enregistrer, pour enregistrer la région d’intérêt pour une utilisation future. Les réseaux cellulaires endothéliales formant des colonies, identifiés par l’analyse cinétique de la vasculogenèse, sont représentés graphiquement sous forme de représentations du squelette et du masque pour illustrer les structures utilisées par le logiciel pour la quantification.

Lorsque la qualité des images à contraste de phase est élevée et qu’un contraste suffisant est obtenu, l’analyse cinétique de la vasculogenèse identifiera avec précision les réseaux cellulaires endothéliales formant des colonies, comme l’indiquent les similitudes observées entre l’image à contraste de phase et les rendus du squelette et du masque générés par l’analyse cinétique de la vasculogenèse. Si les images à contraste de phase n’ont pas un contraste élevé, ou si des artefacts d’imagerie tels que le quadrillage se produisent, la précision de détection du réseau est réduite et les résultats deviennent ambigus. Cependant, différentes méthodes de seuillage, telles que Mean et Otsu, illustrées ici, peuvent être sélectionnées avant l’analyse dans le menu déroulant du logiciel pour s’adapter aux différences de qualité d’image.

L’utilisation de l’analyse cinétique de la vasculogenèse pour déterminer si le diabète sucré gestationnel exposé présente une cinétique modifiée de la formation du réseau révèle une formation de structure de réseau modifiée de manière hétérogène dans les cultures de diabète sucré gestationnel par rapport aux cultures de cellules formant des colonies endothéliales provenant d’une grossesse sans complication. En effet, les échantillons de grossesse non compliquée forment généralement un plus grand nombre de réseaux fermés par rapport aux échantillons de diabète sucré gestationnel. Cependant, tous les échantillons de cellules endothéliales formant des colonies présentent un modèle biphasique de formation de réseau dans l’ensemble, bien que les taux de formation et le nombre maximal de réseaux atteints varient d’un échantillon à l’autre.

En suivant cette procédure, les valeurs de données générées par l’analyse cinétique de la vasculogenèse peuvent être représentées graphiquement et analysées pour déterminer si les structures de réseau formées par les différents échantillons sont statistiquement différentes et, le cas échéant, à quels moments. L’analyse cinétique de la vasculogenèse permet de traiter efficacement des expériences time-lapse impliquant un grand nombre d’images. Une fois maîtrisés, l’acquisition, le post-traitement et l’analyse des images peuvent être réalisés en deux jours si tous les systèmes fonctionnent correctement.