Name: Un protocole simple à haut rendement pour lisolement des îlettes pancréatiques des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Découvrez un protocole simplifié d'isolement des îlots pancréatiques chez la souris utilisant une injection de collagénase et un gradient de densité unique. Cette méthode permet d'obtenir 250 à 350 îlots fonctionnels de haute qualité par animal.

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Nous sommes extrêmement reconnaissants à Mme Jennifer Munguia pour son illustration artistique du diagramme schématique. Nous remercions M. Michael R. Honig de la station de radio publique communautaire KPFT de Houston pour son aide éditoriale. Cette étude a été soutenue par l'American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS), et NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Ce travail a également été soutenu par l'USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1010840 (YS) et R01 DK095118 (SG).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux (ACUC) de l'Université Texas A et M. Les outils chirurgicaux nécessaires sont indiqués à la figure 1 et le diagramme schématique de la procédure est indiqué dans la figure 2.
1. Solutions
<ol><li>Préparer la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) en ajoutant 100 ml de 10X HBSS (à partir du stock) à 900 ml d'eau distillée pour faire 1 L HBSS (1X).</li>
	<li>Préparer la solution STOP (doit être fraîche et doit être utilisée dans un délai de 1 h) en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal de 100X (FBS) à 450 ml de glace 1X HBSS; cela rend la solution STOP de 500 mL. Maintenez la solution STOP à 4 oC.</li>
	<li>Préparer la solution P de collagène (doit être fraîche dans un délai de 1 h après avoir été utilisée) en ajoutant 1 mg/ml de collagène P à la glace froide 1X HBSS; utiliser 6 mL/souris.<ol>
<li>Ajouter 0,05 % (w/v) d'albumine de sérum bovin (BSA) à la solution de collagène P (ce qui fournit des nutriments aux îlots isolés). Par exemple, utilisez 3 mg de BSA dans la solution P de collagène de 6 ml. Garder sur la glace.</li>
		<li>Calculer et préparer la quantité de collagène P nécessaire pour toutes les souris dans un tube de 50 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer rpMI 1640 moyen complet en ajoutant 10% FBS, 100 U/mL pénicilline, 100 streptomycine sténopage g/mL, supplément cellulaire INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium et 0,05 mM 2 mercaptoéthanol) à 500 mL RPMI 1640 media contenant 5,5 mM de glucose à utiliser pour la culture du jour au lendemain et l'incubation.</li>
</ol>2. Préparation
<ol><li>Remplir trois tubes de 50 ml d'une solution inhibitrice rNase de 25 ml, 70 % d'éthanol ou de H2O distillé. Ces solutions seront utilisées pour le nettoyage des outils chirurgicaux avant et pendant l'intervention.</li>
	<li>Faire tremper les pointes des outils dans la solution inhibitrice RNase pendant 30 minutes avant de commencer le protocole; cela élimine toute RNase potentielle sur les outils.</li>
	<li>Pré-coupetampons absorbants à 6 dans x 6 dans la taille pour une utilisation pendant la chirurgie.</li>
	<li>Préparer la solution 1X HBSS à l'avance et le conserver à 4 oC. Préparer la solution STOP avant la chirurgie. Conserver à 4 oC.</li>
	<li>Préparer la solution de collagène P immédiatement avant la chirurgie et conserver sur la glace. REMARQUE: Cela doit être utilisé dans les 2 heures suivant la préparation.</li>
	<li>Étiqueter les tubes de 50 ml pour la digestion et la purification; préparer 2 tubes pour chaque souris, l'un pour la digestion et l'autre pour la purification des îîaux. Assurez-vous que l'iD animal est sur les deux tubes.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de solution P de collagène dans le premier tube de 50 ml. Les 3 ml restants de collagène P seront injectés.</li>
	<li>Dessiner les 3 ml restants de solution de collagène dans une seringue de 3 ml montée avec 30 G 1/2 dans l'aiguille. Placez la seringue sur la glace.</li>
</ol>3. Procédure
<ol><li>Retirez tous les outils de la solution inhibitrice de la RNase, puis trempez-les d'abord dans le tube avec 70 % d'éthanol, puis dans le tube contenant du H2O distillé, puis séchez à l'air sur du papier essuie-tout propre.</li>
	<li>Placez la souris dans une chambre contenant 0,5 ml d'isoflurane jusqu'à ce que la souris soit profondément anesthésiée.</li>
	<li>Retirez la souris de la chambre et vérifiez l'état d'anesthésie en pinçant un coussinet avec des forceps. L'anesthésie profonde est basée sur l'observation que la respiration devient régulièrement lente et que la souris n'est pas réactive au pincement des pieds. Après avoir confirmé que la souris est profondément anesthésié, euthanasier la souris avec la dislocation cervicale, puis placer la souris sur le tampon absorbant.<ol>
<li>Placez la souris anesthésié sur son estomac, en appliquant une pression sur le cou et en disloquant la colonne vertébrale du cerveau en tirant la queue.</li>
	</ol></li>
	<li>Tapez les membres de la souris en position de supine sur le tampon absorbant, vaporisez le corps avec 70 % d'éthanol et essuyez l'excès d'éthanol.</li>
	<li>Utilisez des forceps en verre de couverture et des ciseaux chirurgicaux incurvés pour faire des incisions. D'abord faire une incision horizontale sur la peau de la région abdominale (3 cm), tirer la peau grande ouverte pour exposer la paroi abdominale. Ensuite, faites une incision verticale (3 à 4 cm) sur le péritoine abdominal pour exposer pleinement le pancréas dans la cavité abdominale (Figure 3).</li>
	<li>Poussez les lobes du foie supérieurement pour exposer le canal biliaire, il apparaîtra comme un tube rose pâle (Figure 3).</li>
	<li>Déplacez soigneusement les intestins de la bonne région lombaire/iliaque de la cavité abdominale vers la droite, en exposant le canal biliaire et l'artère hépatique (Figure 3).</li>
	<li>Serrez soigneusement le conduit biliaire commun à l'aide du Schwartz micro serrefines (Figure 1) aussi près que possible du foie.</li>
	<li>Identifier l'ampulla de Vater, qui est situé à la papille duodénale, formée par l'union du conduit pancréatique et le canal biliaire commun. L'ampulla de Vater semble gonflé lorsqu'il est vu sous un microscope de dissection qui est le point d'entrée du canal biliaire commun (Figure 4). REMARQUE : L'ajustement de l'intensité/angle de lumière du microscope de dissection peut faciliter la localisation.</li>
	<li>Insérer la seringue avec 3 ml de la solution de collagène P dans l'ampulla de Vater. Poussez l'aiguille dans le conduit pendant environ 1/4 de la longueur du conduit biliaire commun (ampulla conduit dans le conduit) comme indiqué dans la figure 5.</li>
	<li>Une fois que l'aiguille est dans l'ampulla, assurez-vous que l'orientation de l'aiguille est telle qu'elle est parallèle avec le conduit.</li>
	<li>Stabiliser l'aiguille en serrant avec des micro-forceps Adson pour l'empêcher de perforer le conduit (Figure 5).</li>
	<li>Injecter lentement et régulièrement 3 mL de la solution P de collagène de la seringue dans le canal biliaire commun (assez pour ressentir une résistance) comme le montre la figure 6. Le but est de créer une pression de retour pour forcer la collagène à entrer dans le canal pancréatique. L'injection est considérée comme réussie si la tête, le cou, le corps et la queue du pancréas sont tous entièrement gonflés. REMARQUE : Le rendement des îlettes sera faible si le pancréas n'est pas complètement gonflé, ou si la zone splénique n'est pas complètement gonflée. La zone splénique contient le plus grand nombre d'îlots6. L'inflation peut être confirmée par l'apparition d'espaces ouverts entre les tissus pancréatiques qui sont remplis de solution.</li>
	<li>Disséquez soigneusement le pancréas gonflé et placez-le dans un tube de digestion de 50 ml contenant 3 ml de solution P de collagène glacée.<ol>
<li>Enlever le pancréas à l'aide de 2 forceps (courbé et Micro Adson; Voir Figure 1) ( (à partir de la rate, tirer le pancréas loin de la rate et continuer à enlever de l'estomac et le long du duodénum. REMARQUE: Aucune incision requise.</li>
		<li>Hacher le pancréas pendant 3 à 5 s dans le tube de digestion avec 3 ml de solution de collagène P glacée à l'aide de ciseaux chirurgicaux fins (Figure 7A).</li>
	</ol></li>
	<li>Fixer le tube sur une grille dans un bain d'eau de 37 oC et secouer à 100 à 120 tr/min pendant environ 12 à 13 minutes.</li>
	<li>Après l'incubation, secouer doucement les tubes à la main pour perturber le tissu jusqu'à ce que la solution de digestion de collagène P devienne homogène (Figure 7B). L'homogénéité est confirmée par une apparence de sable de particules fines du pancréas. Environ 30 s de doux tremblement de main est généralement suffisant. Tenir le tube à la lumière pour examiner si le tissu est bien homogénéisé; secouer pendant un autre 15 s si nécessaire.</li>
	<li>Une fois digérés, placez immédiatement les tubes sur la glace et ajoutez 40 ml de solution STOP glacée pour mettre fin à la digestion enzymatique. REMARQUE: À ce stade, les tubes de digestion peuvent être laissés sur la glace jusqu'à 2 h, si vous travaillez sur plusieurs souris.</li>
	<li>Centrifuger le tube dans une centrifugeuse à seau oscillant à 300 x g pour 30 s (la température de la centrifugeuse est flexible). REMARQUE : Utilisez une centrifugeuse à seau oscillant de sorte que la pastille de tissu soit formée au fond du tube de 50 ml et non sur la paroi du tube; c'est essentiel pour un meilleur rendement des islets.</li>
	<li>Décanter et répéter la centrifugation avec la solution STOP 2 fois de plus, en décantant la solution après chaque rotation. Utilisez 20 ml de solution STOP pour chaque lavage ultérieur.<ol>
<li>Avant chaque rotation, perturber la pastille en secouant doucement la pastille tissulaire dans le tube de 50 ml dans la solution STOP de 20 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Suspendre à nouveau la pastille de tissu avec 40 ml de HBSS froid glacé et la centrifugeuse à 300 x g pour 30 s.</li>
	<li>Décanter et répéter la centrifugation à l'aide d'une centrifugeuse à seau oscillant avec la solution HBSS deux fois de plus, en décantant la solution après chaque vrille. Utilisez 20 ml de HBSS pour chaque lavage.<ol>
<li>Avant chaque vrille, perturber la pastille, pour la détacher du fond du tube en secouant doucement le tube contenant une solution HBSS de 20 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Après la dernière centrifugation, retirez tous les HBSS.</li>
	<li>Ensuite, ajoutez 5 ml de gradient de densité de température ambiante au tube de 50 ml contenant la pastille. Vortex brièvement à basse vitesse jusqu'à homogénéisation.</li>
	<li>Ajouter un autre 5 ml du gradient de densité de température ambiante au tube de 50 ml. Ne pas vortex/mix. REMARQUE : Il est essentiel de rester stable et de permettre à un meilleur gradient de se former sans interruption.</li>
	<li>Pipette 10 ml de tampon HBSS à température ambiante dans le tube (contenant le gradient de densité), goutte par goutte doucement et lentement pour permettre à un gradient de se former. Utilisez un canon pipette avec une pipette de 10 ml pour ajouter HBSS dropwise.</li>
	<li>À l'aide d'une centrifugeuse à seau oscillant, les tubes de rotation à 1700 x g pendant 15 min. Assurez-vous de changer la vitesse de l'accélération/décélération au réglage le plus bas pour maintenir le gradient (figure 7C).</li>
	<li>Après le spin, retirez soigneusement les tubes sans perturber le gradient. À l'aide d'un canon à pipette pré-wetted avec HBSS froid (pipette HBSS de haut en bas), pipette sur la couche d'îlots (5 à 10 ml) formé entre le gradient de densité et HBSS dans le nouveau tube de collecte des îlots de 50 mL. REMARQUE : Il est utile de mouiller la pipette avec le HBSS froid avant de pipetting les îlots pour empêcher les îlots de coller aux parois intérieures de la pipette.<ol>
<li>Dans le cas où la séparation est incomplète, les îlots seraient visibles dans la couche de gradient de densité, pipette sur l'ensemble de 10 ml du gradient de densité (couche inférieure) avec la couche d'îlots formé à l'interface (seulement pour laisser environ 8 à 10 ml de la couche supérieure HBSS derrière). REMARQUE : La collecte de la couche d'îf et de la couche de gradient de densité (couche inférieure) peut entraîner la collecte de débris qui peuvent allonger le temps de cueillette des înles, mais aucune autre étape ne sera modifiée. La collecte de ces deux couches n'est pas nécessaire lorsque la couche d'islet est bien formée.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter 20 ml de HBSS glacé au nouveau tube de 50 ml contenant des îlots, puis centrifuger à 350 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse à seau oscillant.</li>
	<li>Après le spin, soigneusement pipette (nepas décanter) sur le supernatant (laisser 3 ml au fond) sans déranger la boulette contenant les îlots au fond. Jetez le supernatant.</li>
	<li>Répéter le lavage et le centrifuage au moins 3 fois. Ajouter 20 ml de HBSS à chaque fois, et assurez-vous de suspendre le granule avant chaque vrille.</li>
	<li>Chauffer la bouteille de support complète RPMI-1640 dans un bain d'eau à 37 oC avant de l'utiliser. Après la dernière centrifugation, retirez tout le HBSS et ajoutez 4 ml de milieux RPMI-1640 complets préalablement préparés (contenant FBS, SUPPLÉMENT de cellules INS-1 et pénicilline/streptomycine) à la pastille.</li>
	<li>Déloger la pastille en faisant tourbillonner doucement le tube et verser immédiatement le support RPMI-1640 dans un plat Petri de 100 mm. Ajouter un autre 5 ml de support RPMI-1640 au tube et le faire tourbillonner doucement pour laver les îlots restants, puis aussi verser le support dans le même plat Petri.<ol>
<li>Sous un microscope à dissection, choisissez des îlots sains du plat Petri à l'aide d'une pipette de 20 l et placez-les dans un nouveau plat Petri contenant 10 ml de support RPMI 1640 complet. Lorsqu'ils sont vus sous un microscope de dissection, les îlots devraient apparaître de couleur sphérique/oblongue et brun doré avec une surface lisse par rapport au tissu exocrine relativement transparent et vaporeux. REMARQUE : Le grossissement du microscope de dissection est habituellement réglé à 12.5-16x. Le rendement des islets varie en fonction de divers facteurs, y compris la tension, l'âge et le sexe de la souris. Ce protocole donne habituellement 250-350 îlots sains de l'âge sain de souris de C57BL/6J 4-10 mois.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber les îlots dans un incubateur stérile à 37 oC avec 5 % d'infusion de CO2 et 95 % d'air humidifié pendant la nuit pour des expériences le lendemain, ou congeler les îlots pour l'analyse souhaitée à une date ultérieure.<ol>
<li>Une fois que les îlots sont congelés, ils ne peuvent pas être utilisés pour des analyses de sécrétion, seulement l'ARN ou la quantification des protéines. Pour recueillir les cellules à congeler, placez-les dans le tampon HBSS, collectez tous les îlots dans une solution tampon de 200 à 500 l, transférez-les dans un tube de 1,5 mL, centrifugeuse 350 x g pendant 1 x 2 min, retirez le supernatant ne laissant pas plus de 30 à 40 l, placez-le dans -20 oC pour le stockage à court terme ( plusieurs jours) ou -80 oC pour un stockage à long terme.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).</li>
<li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374(1987).</li>
<li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+filtration%3A+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li>
<li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li>
<li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole comprend la perfusion et la digestion du collagène, suivie s'il y a purification des îlots. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'injection efficace et la perfusion complète du pancréas1,4,7. La méthode d'administration de ce protocole permet à l'enzyme de traverser les voies anatomiques pour mieux digérer le tissu exocrine entourant les îlots1. En outre, cette technique est bi...

Il y a deux méthodes communes dans la littérature pour l'isolement pancréatique d'îcle. Il faut l'exciser le pancréas et le découper en petits morceaux à l'aide de ciseaux chirurgicaux, puis le digérer dans une solution de collagène1,2,3. Une autre méthode plus précise est d'utiliser le réseau de conduits présents dans le pancréas pour introduire l'enzyme digestive. Les sites suivants ont été utilisés pour l'injection d'enzymes digestives: la jonction de la bile et le conduit cystique, la vésicule biliaire dans le canal biliaire commun, ou le canal biliaire commun lui-même1,4,5. On sait que les îlots ne sont pas répartis uniformément dans le pancréas; la région splénique contient le plus d'îlots6. Alors que la deuxième méthode utilisant des voies anatomiques pour délivrer des enzymes digestives permet une perfusion plus complète du pancréas, y compris la région splénique, cette procédure nécessite souvent le serrage ou la suture de l'ampulla de Vater qui est techniquement qui met au défi. En termes de purification des îlots, des gradients de densité multiples, ainsi que des passoires cellulaires et une rétraction magnétique ont été utilisés pour purifier les îlots3,7. L'utilisation de ces gradients peut prendre du temps et les gradients Ficoll peuvent entraîner des dommages toxiques des îlots8.
Le protocole actuel est construit sur la méthode décrite par Li et al.7, avec des modifications supplémentaires ajoutées basées sur l'expérience de nous-mêmes et d'autres1,4. Les étapes les plus critiques de notre protocole sont le serrage du canal biliaire commun près de l'extrémité du foie, l'injection de collagène P via l'ampulla de Vater pour digérer le tissu exocrine, puis en utilisant un bain d'eau secouant pour accélérer la digestion mécaniquement1, 4,7. Par la suite, une solution «STOP» est appliquée pour inhiber la digestion des îlots; HBSS est utilisé pour laver la solution restante de collagène P et STOP. Lorsque la méthode Ficoll a été utilisée pour purifier les îlots humains, le rendement a été signalé comme étant deux fois plus élevé que les îlots ayant une plus grande capacité fonctionnelle (p. ex., sécrétion d'insuline) par rapport à l'utilisation des gradients Percoll9. Cependant, des études ont remis en question l'utilisation du gradient Ficoll en raison de son effet toxique sur les îlots1,10. Il a été rapporté que le gradient Histopaque fournit la cinétique optimale de purification pour l'isolementd'îlots de souris, qui produit le bon rendement des îlots de haute qualité avec des étapes plus simples et le coût inférieur 1. Dans notre protocole, Histopaque-1077 est utilisé pour purifier les îlots d'autres tissus résiduels8,11. Les îlots récoltés peuvent être cultivés dans des milieux COMPLETs RPMI-1640, ou directement utilisés dans la quantitation d'ARN/protéines.
Notre protocole, utilisant une combinaison de digestion de P de collagène et d'une étape simple de purification de gradient, est plus simple que d'autres protocoles édités. Notre méthode ne nécessite pas d'interventions chirurgicales exigeantes et n'a que quelques étapes simples. Plus important encore, ce protocole produit constamment un bon rendement des îlots fonctionnels de haute qualité (250-350/mouse) comme nous l'avons rapporté12.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 3 mL</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Hoding de la collagénase P</td></tr><tr><td>Pince de protection</td><td>VWR</td><td>82027-396</td><td>Maintien de la peau de la souris pour faciliter la procédure d’incision</td></tr><tr><td>Pince incurvée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168696</td><td>Maintien des tissus pendant l’ablation du pancréas</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>B13B16A</td><td>Pour anesthésier les souris avant une intervention chirurgicale</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 100 mm</td><td>VWR</td><td>30-2041</td><td>Utilisé pour la culture d’îlots de Langerhans</td></tr><tr><td>30 G. &frac12 ; aiguille</td><td>BD</td><td>305106</td><td>Pour la pénétration de l’ampoule de la cuve pour délivrer de la collagénase P - cette jauge est utilisée car elle s’adapte bien à la plupart des CBD Tube de</td></tr><tr><td>50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Contenant du tissu pancréatique digéré, de la collagénase P et des îlots purifiés</td></tr><tr><td>Coussinets absorbants avec barrière contre l’humidité imperméable</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Pour absorber le sang des procédés syriques</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810R avec godet pivotant et capacité de décélération</td><td>Eppendorf</td><td>5811FJ478114</td><td>Utilisation pour les tissus en granulation, la pastille est formée au fond du tube conique - une centrifugeuse à godet pivotant est nécessaire. La fonction de décélération est également importante pour former les couches de dégradé.</td></tr><tr><td>Collagénase P- 1g</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11249002001</td><td>Pour la digestion du pancréas exocrine</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux incurvés</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13-804-21</td><td>Pour couper l’abdomen ouvert de souris</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Utilisé pour l’identification des structures anatomiques clés afin d’administrer avec précision la collagénase dans le pancréas</td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank 10x</td><td>Corning</td><td>20-023-CV</td><td>Cellules de lavage</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>RNBF5100</td><td>Pour la formation de gradients</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Leeds</td><td>LR92240</td><td>Amélioration de la visibilité du microscope</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM9780</td><td>Pour l’élimination de la RNase</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Média sans L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td>Îlots de culture</td></tr><tr><td>Schwartz micro serrefines (Pince microvasculaire)</td><td>Outils de sciences fines</td><td>18052-01</td><td>Clampage du canal cholédoque et de l’artère hépatique</td></tr><tr><td>Bain d’eau agité</td><td>Boekel/Grant</td><td>8R0534008</td><td>Important pour la digestion mécanique du tissu exocrine</td></tr><tr><td>Petits ciseaux chirurgicaux</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Tissu de drainage qui s’attache au pancréas</td></tr></tbody></table>

un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Les îlots pancréatiques, également appelés les îlots de Langerhans, sont un groupe de cellules endocriniennes qui produit des hormones pour la régulation du glucose et d'autres fonctions biologiques importantes. Les îlots se composent principalement de cinq types de cellules sécrétrices d'hormones : les cellules sécrètent le glucagon, les cellules sécrètent l'insuline, les cellules sécrètent la somatostatine, les cellules sécrètent la ghréline et les cellules PP sécrètent du polypeptide pancréatique. Soixante à 80 % des cellules des îlots sont des cellules d'A, qui sont la population cellulaire la plus importante pour étudier la sécrétion d'insuline. Les îlots pancréatiques sont un système modèle crucial pour étudier la sécrétion d'insuline ex vivo. L'acquisition d'îlots de haute qualité est d'une grande importance pour la recherche sur le diabète. La plupart des procédures d'isolement d'înet exigent techniquement difficile d'accéder au site de l'injection de collagène, des procédures dures et complexes de digestion, et des étapes multiples de purification de gradient de densité. Cet article comporte une méthode simple d'isolement d'îlet de souris à haut rendement avec des descriptions détaillées et des démonstrations réalistes, montrant les étapes spécifiques suivantes : 1) injection de collagène P à l'ampulla de Vater, une petite zone joignant le conduit pancréatique et le canal biliaire commun, 2) la digestion enzymatique et la séparation mécanique du pancréas exocrine, et 3) une seule étape de purification de gradient. Les avantages de cette méthode sont l'injection d'enzyme digestive en utilisant l'ampulla plus accessible de Vater, une digestion plus complète en utilisant la combinaison d'approches enzymatiques et mécaniques, et une étape de purification de gradient unique plus simple. Ce protocole produit environ 250 à 350 îlots par souris; et les îlots conviennent à diverses études ex vivo. Les mises en garde possibles de cette procédure sont des îlots potentiellement endommagés en raison de la digestion enzymatique et/ou de l'incubation prolongée de gradient, qui peuvent toutes être en grande partie évitées par la justification d'annonces soigneuses du temps d'incubation.

L'achèvement approprié de cette procédure exige une certaine compréhension de l'anatomie de la souris dans la cavité abdominale. Cela permet d'identifier correctement l'ampulla de Vater et le serrage du canal biliaire commun. L'ensemble de la procédure prend normalement 1/2 h. Il est plus efficace d'isoler les îlots de 4 à 6 souris en même temps, de sorte que plusieurs échantillons peuvent être centrifuges ensemble. Le temps de la cueillette des îlots varie en fonction du nombre d'îlots et de l'efficacité de la digestion...

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Ce protocole exige l’utilisation d’un gradient de densité unique le rendant sensiblement moins laborieux et plus rentable comparé aux méthodes conventionnelles plus complexes d’isolement d’îlot. Le principal avantage de ce protocole est que l’enzyme est livrée directement au pancréas, ce qui entraîne une digestion accrue des tissus et une augmentation du rendement des îlots. Commencez par enregistrer les membres de la souris en position supine et pulvériser le corps avec 70% d’éthanol.À l’aide de forceps en verre de couverture et de ciseaux chirurgicaux incurvés, faites une incision abdominale horizontale d’environ trois centimètres de la peau et ouvrez la peau pour exposer la paroi abdominale. Faire une incision verticale de trois à quatre centimètres sur le péritoine abdominal pour exposer complètement le pancréas et placer la souris sous un microscope disséquant. Poussez le lobe hépatique de façon supérieure pour exposer le canal biliaire qui apparaît comme un tube rose pâle et déplacez doucement les intestins de la région lombaire et iliaque droite à droite de la cavité abdominale pour exposer le canal biliaire et l’artère hépatique.Utilisez les micro serrefines Schwartz pour s

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Une description détaillée de la souris îlot isolement est décrit en utilisant la technique de la ponction du pancréas in situ canalaire et la perfusion d'une combinaison de collagénase purifiée et la protéase neutre.

Souris îlot de Langerhans isolement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de la collagénase purifiée et protéase neutre

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

La transplantation d’îlots pancréatiques est une façon d’atteindre la normoglycémie dans le diabète de type 1. Cet article se concentre sur la technique de transplantation la voie intraporte de maintenir une glycémie normale chez des souris diabétiques.

Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Ce protocole décrit l’isolement de cellules endothéliales de souris à partir de pancréas entier.

Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez un protocole simplifié d'isolement des îlots pancréatiques chez la souris utilisant une injection de collagénase et un gradient de densité unique. Cette méthode permet d'obtenir 250 à 350 îlots fonctionnels de haute qualité par animal.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

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