L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

L’objectif global de cette procédure est de démontrer l’utilisation d’une plate-forme de diagnostic multiplexée au point de service qui ne nécessite pas de préparation d’échantillon approfondie et d’instrumentation coûteuse, et qui est utilisée dans une variété d’échantillons biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diagnostic au point d’intervention, telles que la détection de différentes cibles dans un seul tube réactionnel. En utilisant une amplification isotherme médiée par boucle couplée à des sondes de déplacement de brin spécifiques à la cible, trois virus différents peuvent être détectés efficacement.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise l’amplification isotherme au lieu de la PCR et qu’elle nécessite une préparation minimale de l’échantillon et peut être appliquée à une gamme d’échantillons cliniques. Commencez par découper des feuilles de papier Q en petits rectangles de trois millimètres sur quatre millimètres à l’aide d’une perforatrice. Ensuite, à l’aide d’un micro-pilon, écrasez les moustiques femelles Aedes aegypti potentiellement infectées par le virus Zika sur chaque papier.

Pipeter 20 microlitres d’une solution aqueuse molaire d’ammoniac sur chaque feuille de papier. Après cinq minutes, lavez chaque papier avec 20 microlitres d’éthanol à 50 %, suivis de 20 microlitres d’eau sans nucléase. Faites sécher le papier à l’air libre dans une enceinte de biosécurité BSL-2 pendant environ une heure.

Après séchage, à l’aide d’une pince à épiler, immergez complètement chaque papier dans 100 microlitres de mélange réactionnel RT-LAMP et incubez à 65 à 68 degrés Celsius pendant 45 minutes. Lisez et enregistrez la fluorescence résultant du virus Zika à l’aide d’une boîte d’observation imprimée en 3D avec une source lumineuse LED et un filtre orange ou jaune. Commencez par ajouter 90 microlitres de tampon de réhydratation 1,1 fois à chaque tube réactionnel contenant des réactifs RT-LAMP lyophilisés et dissolvez-les en agitant.

Puis tournez brièvement vers le bas à 1 000 fois la gravité. Après la centrifugation, ajouter 10 microlitres d’échantillon d’urine enrichi d’ARN viral dans les tubes de réaction et mélanger par pipetage. Si vous testez des moustiques, ajoutez un rectangle de papier Q contenant des carcasses de moustiques ainsi que 10 microlitres d’eau purifiée au lieu d’urine.

Placez les tubes fermés dans un bloc de chaleur préréglé à 65 à 68 degrés Celsius et incubez pendant 30 à 45 minutes. Après l’incubation, garder les tubes fermés pour éviter la contamination des futurs essais et les placer dans la boîte d’observation. Allumez l’interrupteur situé à l’arrière du boîtier d’observation.

Observez l’échantillon à travers le filtre orange et capturez l’image à l’aide d’une caméra de téléphone portable qui est maintenue à une distance où l’image remplit 80 % du champ de vision. Une fois la visualisation terminée, désactivez l’interrupteur. Conservez les tubes scellés dans l’obscurité, de préférence avec une réfrigération si une visualisation ultérieure est nécessaire.

Dans les cas de singleplex et de multiplex, les produits RT-LAMP apparaissent comme une lettre de concatéméraires lorsqu’ils sont exécutés sur du gel d’agarose. Les échantillons de contrôle négatif contenant de l’eau comme échantillon n’ont donné que les bandes pour les amorces elles-mêmes, y compris le témoin cible non spécifique où l’acide nucléique total extrait d’un moustique femelle non infecté a été utilisé comme modèle. La fluorescence verte est observée pour le Zika à l’aide de sondes sous forme de cinq NT premiers marqués avec FAM.

Une fluorescence jaune vert clair est attribuée au Chikungunya où la sonde est à cinq NT de premier ordre marqués avec HEX. Une fluorescence rouge orangé est utilisée pour la dengue-1 où sa sonde est cinq premiers NT marqués avec TAMRA. Deux papiers contenant des moustiques ont été directement immergés dans le mélange RT-LAMP et après une incubation à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes, une fluorescence vert vif a été observée en présence du virus Zika.

En utilisant neuf volumes de tampon de réhydratation et un volume d’échantillon d’urine, une fluorescence verte visible peut être générée en 30 minutes et l’image peut être capturée par n’importe quelle caméra de téléphone portable. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du diagnostic clinique pour explorer les plateformes au point de service pour détecter les virus transmis par les moustiques dans l’urine, le sang, la salive ou les carcasses de moustiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un système d’amplification isotherme, dans ce cas il s’agit d’une lampe, pour détecter Zika et d’autres arbovirus de manière multiplex dans une variété d’échantillons biologiques.