Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant

L’objectif global de cette technique est d’identifier électrophysiologiquement les connexions monosynaptiques chez la drosophile à l’aide de canaux sodiques résistants aux tétrodotoxines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et qu’elle peut révéler la nature chimique des synapses. Il convient également à l’étude du volume ou de la transmission en vrac.

Généralement, dans les vidéos novices de cette méthode, nous avons du mal à cause de la difficulté de la dissection. Cependant, en comprenant simplement la méthode, la logique est facilement transférable à d’autres systèmes modèles tels que les souris. Pour les enregistrements, ayez des pipettes patch pour la résistance proche de sept mégaohms.

De plus, faites aérer en continu une solution saline d’enregistrement externe avec un pH de 7,3 ou moins avec du carbogène contenant 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Pour les sujets, avoir une crosse de mouches exprimant csChrimson, se propageant sur des aliments contenant 0,2 millimolaire de tous trans-rétiniens. Pour les enregistrements, sélectionnez des adultes âgés d’un à trois jours.

Chargez-les dans un flacon à scintillation en verre et immobilisez-le en utilisant une minute d’exposition à des conditions glaciales. Ensuite, abaissez le niveau de lumière sur la lunette de dissection et la pince grossière pour charger une mouche anesthésiée dans la chambre d’enregistrement sur mesure. Fixez la mouche à la chambre en l’entourant de cire ou d’époxy durcissable aux UV.

Positionnez-le côté dorsal vers le haut avec la feuille à peu près à mi-hauteur du thorax. La clé pour obtenir une bonne préparation est d’avoir le trou coupé dans le foil pour qu’il soit juste de la bonne taille, afin que la mouche ne soit pas pressée ni capable de tomber à travers. Éclairez la préparation avec des lampes à fibre optique de chaque côté et maintenez-les aussi sombres que possible.

Ensuite, couvrez la préparation avec quatre à six gouttes de sérum physiologique. Ensuite, affûtez le fil ou le filament de tungstène pour la dissection. Appliquez environ 20 volts de courant alternatif à une solution saturée de nitrate de potassium et trempez à plusieurs reprises l’extrémité du fil très rapidement dans la solution.

Après 20 trempages, la pointe sera tranchante. Maintenant, ajustez les lumières pour fournir juste assez de visibilité pour utiliser le fil aiguisé pour exposer le cerveau en enlevant la cuticule, suivie de la trachée et des corps adipeux. Pour accéder aux lobes antennaires, utilisez un fil de tungstène plié pour glisser doucement l’antenne sous le bouclier en aluminium.

Ensuite, à l’aide d’une pince tranchante, vous arrachez doucement la gaine gliale qui recouvre la zone d’intérêt. Transférez maintenant la préparation sur le banc d’électrophysiologie pour effectuer des enregistrements. Sur la plate-forme, commencez immédiatement à perfuser la préparation avec de la solution saline d’enregistrement, bouillonnée de carbogène.

Utilisez un réservoir de solution saline alimenté par gravité placé au-dessus de la platine du microscope. Pour collecter les déchets salins, utilisez une conduite à vide et une fiole de 2 litres. Ensuite, chargez la pipette patch avec 4 microlitres de solution d’enregistrement interne et fixez la pipette à un micromanipulateur.

Ensuite, mettez à zéro le décalage de l’amplificateur et réglez l’amplificateur pour qu’il délivre des impulsions de test. Ensuite, ajustez l’éclairage oblique IR afin d’obtenir une vue claire du cerveau. Maintenant, tout en appliquant une pression positive sur la pipette, approchez-vous de la cellule avec la pipette.

Lorsqu’il est en contact avec la cellule, relâchez la pression positive pour sceller la pipette à la membrane. Ensuite, réglez le potentiel de maintien de la membrane à moins 60 millivolts. Et la pipette doit former un joint gigaohm avec la membrane cellulaire.

Le courant de maintien doit descendre à un niveau inférieur à celui du picoampère. Pour obtenir des joints gigaohm constants, assurez-vous de garder votre pipette propre en maintenant une pression positive et évitez de heurter les tissus ou de vous approcher de vos cellules. Pour continuer, réglez l’amplificateur pour qu’il délivre des impulsions de test de moins 50 à moins 60 millivolts.

Les impulsions de test révéleront un important transitoire capacitif représentant le courant nécessaire pour charger la pipette patch. Pour supprimer les transitoires capacitifs, ajustez les boutons de compensation de capacité sur l’amplificateur. Maintenant, appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre la membrane cellulaire et obtenir la configuration complète de la cellule.

Une forte augmentation de la fugacité capacitive indique le succès. Une légère augmentation du courant de maintien doit également être observée. Ensuite, réglez l’amplificateur sur le mode de pince de courant.

Et ajustez le potentiel de la cellule entre moins 50 et moins 60 millivolts. En préparation, configurez le système d’acquisition de données comme indiqué dans le protocole du technicien. Le système nécessite une LED rouge haute puissance positionnée sous la préparation, positionnée pour éclairer la mouche à 0,238 milliwatt par millimètre carré.

Maintenant, activez les neurones présynaptiques de manière optogénétique, en utilisant la lumière rouge pulsée dans l’expression de csChrimson. D’autres méthodes peuvent également être utilisées. Avant d’appliquer la tétrodotoxine, une connexion synaptique doit être visible en réponse à une impulsion lumineuse de 40 millisecondes.

L’absence de réponse signifie qu’une connexion est peu probable. Le potentiel de maintien peut être ajusté pour mettre l’accent sur les connexions excitatrices ou inhibitrices, en conséquence. Une fois qu’une connexion est vérifiée, mettez en place la profusion saline pour la recirculation au niveau de la solution saline.

Réglez la pompe de manière à ce que le niveau de salinité dans le bain reste stable. Ensuite, ajoutez suffisamment de tétrodotoxine au système pour obtenir une concentration finale d’une micromolaire. Cela devrait arrêter l’activité de pointe du neurone patché.

Sinon, ajoutez plus de tétrodotoxine au système. Maintenant, appliquez de brèves impulsions de lumière rouge pour activer ce qui est probablement une connexion monosynaptique. Ensuite, procédez à l’ajout d’antagonistes pharmacologiques à la solution saline en recirculation pour tester la nature chimique des connexions synaptiques.

L’expression transgénique de la tétrodotoxine dans le canal sodique sensible sauve l’excitabilité dans les neurones et entraîne un potentiel de plateau important. Les interneurones du lobe antennaire réagissent aux odeurs. Cependant, les courants post-synaptiques excitateurs ne sont pas facilement résolus au niveau du soma.

Alors, les réponses proviennent-elles directement de l’entrée des neurones du récepteur olfactif ? L’utilisation de tERP révèle que les neurones récepteurs olfactifs établissent des connexions directes avec les interneurones locaux. La stimulation des neurones sérotoninergiques dans le lobe antennaire entraîne un mélange d’excitation et d’inhibition dans les interneurones locaux.

L’application de méthysergide, un antagoniste large des récepteurs 5HT, a bloqué une hyperpolarisation lente, mais n’a eu aucun effet sur la dépolarisation, tandis que la mécamylamine bloque la dépolarisation rapide. Cela suggère que la stimulation est cholinergique. Les tERP ont été utilisés pour résoudre la transmission de volume extrasynaptique qui se produit avec le GABA ou les neuromodulateurs.

Dans un exemple, l’application de tétrodotoxine n’a pas supprimé un signal inhibiteur dans l’interneurone local. Cette inhibition a été bloquée à l’aide de l’antagoniste de la sérotonine, le méthysergide, suggérant un signal direct d’un neurone sérotoninergique spécifique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des enregistrements de cellules entières à partir de neurones de drosophile et d’évaluer leur conductivité à l’aide de tERP.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être patient et de pratiquer la dissection difficile à plusieurs reprises. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est exécutée correctement. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la pharmacologie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la nature de la synapse chimique.

N’oubliez pas que travailler avec de la tétrodotoxine peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et le travail avec de petits volumes, doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.