Name: Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Découvrez une méthode d'électrophysiologie pour identifier les connexions monosynaptiques chez Drosophila en utilisant des canaux sodiques résistants à la tétrodotoxine. Cette technique révèle la nature chimique des synapses.

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Nous tenons à remercier Joshua Singer, Jonathan Schenk, ainsi que réfléchies évaluateurs pour commentaires sur le manuscrit. Nous tenons également à remercier Ben White et Harold Zakon pour des discussions sur la technique. Jonathan Schenk a fourni les données de la Figure 3 a. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de Whitehall et une R21 NIH au QG.

1. préparer les mouches et identifier GAL4 promoteur lignes
<ol><li>Sélectionnez une ligne de promoteur de GAL4 et traversez-la avec mouches transporter le transgène SAMU-NaChBac et un transgène d’optogenetic pour l’activation. Remarque : SAMU-CsChrimson11 est sélectionné en raison de sa conductivité élevée et la facilité avec laquelle il active les potentiels d’action induite par le NaChBac. Les SAMU-NaChBac et SAMU-CsChrimson sont disponibles depuis le référentiel de Stocks de Bloomington.</li>
	<li>Préparer le rétinal all-trans comme une solution dans l’éthanol (35 mM) et de conserver la solution dans le congélateur à-20 ° C.</li>
	<li>Mix 28 µL de ce stock dans environ 5 mL de pomme de terre réhydraté nourriture de flocon et ajouter ce mélange à la partie supérieure d’un flacon de milieu conventionnel de drosophile .</li>
	<li>Augmenter les mouches adultes exprimant le csChrimson de l’alimentation humaine contenant 0,2 mM tout-trans-rétinal pour 1 à 3 jours,11.</li>
</ol>2. préparer le Stock TTX
<ol><li>Créer une solution de 1 mM TTX dans l’eau distillée ou désionisée. Conserver cette solution dans un réfrigérateur de laboratoire pendant plusieurs mois. Vérifiez les politiques des institutions concernant le stockage de TTX comme classent les nombreuses institutions TTX comme une substance dangereuse ou contrôlée.</li>
</ol>3. préparer les mouches pour l’électrophysiologie
<ol><li>Recueillir des jour 1 – 3 mouches adultes vieux qui sont déclenchés sur la nourriture avec all-trans-rétinal. Remarque : Reportez-vous à Murthy et Turner en 2013 pour une description détaillée du patch serrage Drosophila neurones12,13.</li>
	<li>Mettre les mouches dans un flacon en verre de scintillation. Placer le flacon sur la glace pendant 1 min immobiliser les mouches.</li>
	<li>Grosses pinces permet d’insérer une mouche dans une chambre d’enregistrement sur mesure. La chambre se compose d’un 3 ½" cercle découpées au laser de 1/16" en acrylique. Découpez un trou de ¾" est dans le centre où il est attachée une feuille personnalisée avec 2 parties époxy. La grille contient une triangulaire en forme d’espoir que la mouche est insérée dans.</li>
	<li>Appliquer une cire ou époxy durcissable UV autour de l’animal pour le fixer solidement au sein de la chambre d’enregistrement.</li>
	<li>Illuminer la préparation avec une fibre optique à col de cygne pour la visualisation sous un stéréomicroscope. Réglez les fibres du col de cygne pour éclairage oblique en ajustant leur afin qu’ils illuminent la volée directement sur le côté.</li>
	<li>Ajuster le niveau de luminosité plus faible réglage possible qui permet encore une visualisation claire de la mouche. Cette intensité lumineuse varieront d’expériences individuelles. Remarque : Ce protocole peut être adapté à l’aide d’un in situ cerveau explantation méthode14.</li>
	<li>Récupérer un enregistrement externe saline. La solution saline contient en mM : 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxyméthyl) l’acide méthyl-2-aminoéthanethiol-sulfonique, tréhalose 8, glucose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2et 4 MgCl2 (270-275 mΩ ajustée). La solution saline est propagée avec 95 % O25 % CO2 (carbogen) et a un pH ajusté à 7,315.</li>
	<li>Recouvrir la préparation mouche de 4 à 6 gouttes de solution saline enregistrement extracellulaire. À ce stade, augmenter le niveau de lumière au microscope la dissection pour une meilleure visibilité.</li>
	<li>Aiguiser un fil de tungstène par électrolyse. Pour rendre le fil, préparer une solution saturée de KNO3 et appliquer environ 20 volts de courant tout en trempant l’extrémité du fil dans la solution 20 fois pour chaque 100 ms jusqu'à ce que la pointe est aiguisée. Utilisez le fil de tungstène affûté pour supprimer la cuticule sur la tête de la mouche et exposant ainsi le cerveau.</li>
	<li>Exposer davantage le cerveau en supprimant la trachée et les corps gras qui l’entourent. Si accédant les lobes antennaires, utiliser un fil de tungstène courbé ou un outil similaire pour rentrer doucement antennes sous la feuille d’enregistrement chambre pour augmenter la visibilité. Forte pince permet d’arracher délicatement l’enveloppe gliale couvrant la zone d’intérêt où les enregistrements seront fera.</li>
	<li>Transfert de la chambre d’enregistrement au banc d’essai électrophysiologie. Immédiatement le début de perfusion avec du sérum physiologique enregistrement externe barboter avec carbogen pour préserver le cerveau. Le réservoir de solution saline est placé au-dessus de la platine du microscope et est alimenté par gravité à la préparation. Utiliser une ligne vide et une fiole d’Erlenmeyer de 2 L pour recueillir la déchets saline.</li>
</ol>4. obtention de l’enregistrement de la cellule entière
<ol><li>Tirer les pipettes de patch sur un extracteur de pipette commerciale. Consulter le manuel des paramètres atteindre une pipette appropriée avec une résistance à la pointe près de 7 mΩ.</li>
	<li>Ajouter 4 µL de solution d’enregistrement interne dans une pipette de patch. La solution saline interne se compose de 140 aspartate de potassium, 10 HEPES, MgATP 4, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA et 1 KCl en mM.</li>
	<li>Mis en place l’amplificateur pince patch pour l’enregistrement de la cellule entière. Zéro de décalage de l’amplificateur et configurer l’amplificateur afin de fournir les impulsions d’essai. Ici, un amplificateur de pince AM systèmes Patch 2 400 est utilisé.</li>
	<li>Appliquez une pression positive par le biais de la pipette et approche de la cellule. Utilisez un micromanipulateur pour diriger la pipette et contacter la cellule. Relâcher la pression positive. Ensemble le potentiel de maintien de la membrane à -60 mV. La pipette doit former un joint de gigaohm avec la membrane de la cellule comme en témoigne une basse sub-picoamp tenant actuel. NOTE : Si à l’aide de GFP guidé ciblant les cellules, essayer de minimiser l’utilisation de la lumière épifluorescente prévient-on ChR2 activation et potentielle synaptique dépression. Aussi, attendez quelques minutes avant d’appliquer l’étape 5.</li>
	<li>Configurer l’amplificateur afin de fournir les impulsions d’essai de -50 mV à -60 mV. Ce paramètre est standard sur les amplificateurs de patch clamp. Impulsions de test révélera un grand transitoire capacitif qui représente le courant nécessaire pour recharger la pipette. Enlever capacitif transitoires en ajustant les boutons de compensation de capacité sur l’AM 2400 ou amplificateur similaire.</li>
	<li>Appliquer de brèves impulsions de pression négative pour rupture de la membrane cellulaire et obtenir la configuration cellule entière. Remarque : Une configuration cellule entière est observée lorsqu’il y a une forte augmentation dans les transitoires capacitif montrant la capacitance du neurone. Une légère augmentation de l’exploitation actuelle (de base) sans doute aussi on remarquera. Régler l’amplificateur à l’actuel mode de pince et potentiel de la cellule de -50 à -60 mV.</li>
</ol>5. Testez la connectivité synaptique
<ol><li>Configurer le système d’acquisition (DAQ) de données pour déclencher un pilote de LED pour générer des impulsions de lumière. Ici, un système DAQ de National Instruments est utilisé avec Matlab pour fournir un signal analogique à un conducteur de LED. L’intensité des LED est réglée via le signal analogique pour le conducteur. La LED est 620-630 nm longueur d’onde LED.</li>
	<li>Positionner la haute puissance LED rouge directement sous la préparation. Régler l’intensité lumineuse afin que 0,238 mW/mm2 atteigne la volée.</li>
	<li>Activer les neurones présynaptiques pendant l’enregistrement de la cellule postsynaptique d’intérêt. Atteindre la cellule d’activation optogenetically, pharmacogentically, ou par l’intermédiaire de la stimulation nerveuse. Ici, csChrimson et brèves impulsions de lumière rouge sont appliquées. NOTE : Les connexions synaptiques peuvent être surveillées en pince ampèremétrique comme EPSPs ou bride de tension comme EPSCs. Une connexion synaptique devrait être visible avant d’appliquer le TTX en réponse à une impulsion lumineuse de 40 ms. Si aucune connexion n’est observée, il est peu probable que les neurones sont synapses connectés soit mono - ou polysynaptically. Le potentiel de maintien peut être ajusté pour mettre l’accent sur des connexions excitatrices ou inhibitrices en conséquence.</li>
	<li>Si une connexion est observée dans un soluté physiologique, TTX s’ajoute le système de perfusion pour obtenir une concentration finale de 1 µM. utiliser une pompe de recirculation pour capturer et réutiliser la solution saline pour conserver la TTX. La pompe péristaltique va tirer la solution saline de la baignoire et remettez-le dans le réservoir de solution salin.</li>
	<li>Ajuster la vitesse de la pompe pour fournir un vide constant fort qui ne permet pas à ce niveau de sérum physiologique dans le bain pour montent et descendent. Remarque : L’application de TTX devrait entraîner la cessation de l’activité dans le neurone qui est surveillé à germes entiers de fortification. Cela confirme qu’assez TTX a été ajouté à la solution saline.</li>
	<li>Appliquez de nouveau brèves impulsions de lumière rouge (40 ms pour chaque impulsion). À ce stade, toute connexion synaptique qui reste est probablement monosynaptiques. Ajouter antagonistes pharmacologiques à la saline de recirculation pour tester la nature chimique des connexions synaptiques qui restent dans la TTX. Remarque : Lors de la combinaison optogenetics et fluorescent ciblant des neurones, il peut être important de ne pas activer constamment la population présynaptique des neurones tout en essayant d’obtenir un enregistrement. Cela peut conduire à la dépression synaptique et il est difficile de voir les connexions. Parce que csChrimson a une bande longue excitation qui s’étend largement dans la gamme de protéine fluorescente verte, un fluorophore rouge peut être utilisé pour visualiser les neurones et channel2rhodopsin (Ch2R) peut être utilisé pour exciter les populations cellulaires. Cela requiert génétique spécifique et un cube de filtre personnalisé. Pour générer des mouches appropriés, faire des mouches qui expriment le fluorophore rouge (DP ou mCherry) sous les systèmes d’expression binaire système LexA ou Q. Ceux-ci devront être croisé avec mouches exprimant un promoteur Gal4 et gènes effecteurs SAMU-Ch2R et SAMU-NaChBac. Le cube filtre optimal pour épifluorescence aura une gamme étroite d’excitation pour exciter le fluorophore rouge, mais pas exciter la Ch2R. en outre, l’ensemble du filtre devrait inclure un filtre d’émission longue passe pour collecter autant de lumière émise. Nous avons utilisé un filtre personnalisé de chrominance qui comprenait la partie numéros et580/25 x et t600lpxr (à partir de l’ensemble 49306), mais avec un filtre d’émission/barrière d’et610lp.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Analyse de la TERPS complimente les techniques actuelles utilisées pour circuit fissuration en permettant la détection des synapses entre les neurones. Plus précisément, l’approche indique monosynaptiques connexions par largement faire taire les potentiels d’action avec TTX tout en rétablissant l’excitabilité dans une population de sélectionner des neurones avec canal sodique insensibles à la TTX NaChBac. Libération synaptique est induite par la stimulation de l’optogenetic, tandis que les événements postsynaptiques sont...

Un objectif majeur des neurosciences consiste à mapper les connexions entre les neurones pour comprendre comment l’information circule à travers des circuits. Nombreuses approches et les ressources sont devenues disponibles pour tester la connectivité fonctionnelle entre les neurones dans une gamme de systèmes de modèle1,2. Pour générer les schémas de câblage plus précis à l’aide d’électrophysiologie, il est important de résoudre si connexions observées entre deux cellules sont directs et monosynaptique versus indirecte et polysynaptiques. Un étalon-or pour faire cette distinction dans les neurones chez les mammifères est de mesurer la latence entre unique action potentials dans les cellules présynaptiques et l’apparition de courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) dans le deuxième neurone. Connexions monosynaptiques devraient avoir courts temps de latence de quelques millisecondes et faible variabilité3. Cette approche peut être compliquée dans les neurones d’invertébrés comme les synapses peuvent être chez leurs dendrites loin du site d’enregistrement somatique, provoquant des retards dans la détection en raison des distances longues électrotonique entre conductances postsynaptiques et l’enregistrement électrode. Ces retards peuvent introduire des ambiguïté concernant poly-par rapport aux cotisations monosynaptiques. En outre, petits événements synaptiques peut se désintégrer avant d’atteindre le site d’enregistrements somatique et conduire plus forte activité présynaptique, est susceptibles de recruter des événements polysynaptiques.
Diverses techniques ont été développés pour tester les connexions monosynaptiques chez les invertébrés. Une approche utilise des solutions de haute cation divalent (Hi-Di) contenant des excès de Mg++ et Ca++. Cette solution bloque les connexions polysynaptiques par probabilité de libération réductrice et croissant seuil de potentiel d’action pour favoriser la détection de monosynaptique entrée4,5. Déterminer le rapport précis entre la Mg++ ca++ nécessaire, cependant, n’est pas trivial et polysynaptiques contributions peuvent persister pendant une stimulation même modeste6. Une approche alternative appelée Reconstitution GFP entre partenaires synaptiques (GRASP) profite de la proximité entre les membranes préalables et postsynaptiques trouvé au niveau des synapses d’inférer une connexion monosynaptique 7. Ici, une composante de la protéine fluorescente verte (GFP) s’exprime dans un neurone, et le fragment complémentaire de la molécule est exprimé dans un partenaire postsynaptique putatif. La présence de fluorescence indique que les deux neurones sont très suffisamment proches pour permettre la reconstitution de la molécule GFP et implique l’existence d’une synapse. GRASP peut signaler les synapses faussement, cependant, si deux cellules ont étroitement accolées des membranes, comme dans un nerf ou fascicules. Variantes du GRASP éliminent ces faux positifs en attachant le fragment présynaptique de GFP directement à synaptobrévine, permettant ainsi la reconstitution qu’au synapses actives8. Tandis que le GRASP et ses variantes ont grandement contribués à établir la connectivité fonctionnelle chez la drosophile CNS, certaines connexions ne peuvent pas rendues visibles par emprise si les distances entre les partenaires de pré- et post-synaptiques est relativement importante. Ceci est particulièrement pertinent dans l’évaluation de la transmission de volume associée à la neuromodulation9 ou de l’inhibition GABAergique10.
Ici, une technique nouvelle et complémentaire est démontrée pour tester les connexions directes de monosynaptiques chez la drosophile CNS. Cette méthode, appelée tétrodotoxine Engineered résistance pour sonder Synapses (TERPS), fonctionne par la co-expression de la tétrodotoxine (TTX)-canal sodique résistant, NaChBac et un activateur d’optogenetic dans une cellule présynaptique pendant l’enregistrement de putatif partenaires postsynaptique9. En présence de TTX, toute l’activité induite par le potentiel d’action est supprimée dans les cellules autres que celles exprimant NaChBac. Le canal de NaChBac restaure sélectivement excitabilité dans les cellules présynaptiques ciblées, permettant la transmission synaptique évoquée par la lumière. Cette méthode permet de forte activation des neurones présynaptiques, telles que les connexions peuvent être résolues postsynaptique par somatique enregistrement tout en réduisant la probabilité de recrutement circuits polysynaptiques. Ce qui est important, cette technique permet l’étude de la transmission de volume et révèle la propagation du transmetteur libéré d’un neurone unique tout au long d’un circuit. En outre, les TERPS peut révéler la nature chimique de la connexion par le biais de pharmacologie traditionnelle. TERPS est adapté pour une utilisation dans n’importe quel système de modèle qui permet l’expression transgénique des canaux de sodium insensibles à la TTX.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Utilisé comme activateur neuronal</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Résotores excitabilité dans les cellules du TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxine</td><td>Tochris</td><td>1078</td> Une <td>autorisation spéciale peut être nécessaire pour acheter du TTX car il s’agit d’une substance contrôlée</td></tr><tr><td>tout trans-rétinien</td><td>Sigma-Aldrichall trans-rétinien</td><td>R2500</td><td>Nécessite un cofacteur pour la canalrhodopsine</td></tr><tr><td>Soudable Acier inoxydable 321&nbsp ; Feuille,&nbsp ; 0,002"&nbsp ; Épais,&nbsp ; 10"&nbsp ; Large</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Utilisé pour fabriquer un porte-mouche personnalisé. La feuille personnalisée peut être découpée au laser à pololu.com à partir du fichier PDF fourni</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Utilisé pour la dissection de la préparation</td></tr><tr><td>Cire</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Utilisé lors de la dissection pour fixer la mouche dans la feuille</td></tr><tr><td>Cire de paraffine</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Utilisé avec la pince</td></tr><tr><td>à épiler Numéro 5</td><td>Outils de science fine</td><td>#5CO</td><td>Utilisé pour la dissection et le dégainage</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outils de science fine</td><td>15001-08</td><td>Utilisé pour enlever des parties de la cuticule lors de la dissection</td></tr><tr><td>Fil de tungstène</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Utilisation avec l’électrolyse pour fabriquer des aiguilles aiguisées pour la dissection</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique réciculante</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>pour la recirculation</td></tr><tr>Contrôleur de vitesse TTX<td>pour pompe péristaltique</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Contrôleur de gradation pour lumières LED ou ruban, 12 Volt 8 ampères, Interrupteur de lumière à luminosité réglable Contrôleur de gradateur DC12V 8A 96W pour bande lumineuse à LED B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp ; Régulateur d’air comprimé de précision</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Pour l’application d’une pression positive pendant le patching</td></tr><tr><td>Boîtiers en verre</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>Pour pipettes patch</td></tr><tr><td>Manomètre polyvalent</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Manomètre pour régulateur de pression</td></tr><tr><td>Caméra d’électrophysiologie</td><td>Dage MTI&nbsp ;</td><td>IR-1000</td><td>Tout appareil photo qui fonctionne dans la plage IR (850 nm) fonctionnera. Vous ne souhaitez pas utiliser l’éclairage rouge car cela peut activer csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&nbsp ;</td><td>M850F2</td><td>Pour fibre optique à éclairage oblique</td></tr><tr><td>pour LED IR</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Couple à lentille d’objectif LED IR</td></tr>&<tr><td>nbsp ;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Cela peut être utilisé sur la plupart des microscipes et fonctionne bien pour visualiser les neurones des mouches.</td></tr><tr><td>LED ambrée</td> Thorlabs <td>M590L3d</td><td>Pour visualiser l’appel d’offres et la LED bleue mCherry</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>Pour visualiser le</td>jeu de</tr><tr><td>filtres GFP GFP</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>Pour visualiser la GFP ou le canal stimulant2rhodopsin</td></tr><tr><td>Jeu de filtres mCherry personnalisé</td><td>Chroma</td><td>&nbsp ; ET580/25X et T600LPXR (à partir de l’ensemble 49306) mais avec une optique de barrière/émission ET610LP</td><td>À utiliser uniquement si vous souhaitez patcher les neurones identifiés avec channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic pour combiner des LED ambrées et</td><td>bleues Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Utilisez uniquement un patch sous mCherry et excitez channel2rhodopsin avec de la lumière bleue.</td></tr><tr><td></td><td>LED rougesSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Utilisé pour piloter csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Utilisé pour piloter les LED pour la stimulation optogénétique</td></tr><tr><td>Manipulateur</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Utilisé pour positionner la pipette pendant les enregistrements</td></tr><tr><td>Amplificateur Patchclamp</td><td>A-M Systems</td><td>Modèle 2400</td><td>Un amplificateur équivalent convient</td></tr><tr><td>Filtre Bessel Warner</td><td>Instruments&nbsp ;</td><td>LPF 202A</td><td>Filtre auxiliaire utilisé pour filtrer la trace de courant vers l’oscilloscope pendant le patching.</td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données&nbsp ;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 781044-01</td><td>Utilisé pour enregistrer des données de l’amplificateur à l’ordinateur</td></tr><tr><td>Bloc de connexion - Borne BNC BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Utilisé pour connecter l’amplificateur à la carte DAQ.</td></tr><tr><td>Feuille d’acier&nbsp ;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Feuille d’acier pour chambre d’enregistrement personnalisée</td></tr><tr><td>Aimants</td><td>K& J Magnetics</td><td>D42</td><td>Pour fixer la chambre d’enregistrement au support d’anneau</td></tr><tr><td>1/16" Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Utilisé pour fabriquer une chambre d’enregistrement personnalisée. L’acrylique peut être découpé au laser à pololu.com partir du fichier PDF fourni</td></tr></tbody></table>

examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Ici, une nouvelle technique appelée Tetrotoxin (TTX) Engineered résistance des Synapses à sonder (TERPS) est appliquée pour tester la monosynaptiques connexions entre les neurones de la cible. La méthode s’appuie sur la co-expression d’un activateur transgénique avec canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac, dans un neurone présynaptique spécifique. Connexions avec les partenaires post-synaptiques putatifs sont déterminées par cellule entière enregistrements en présence de TTX, qui bloque l’activité électrique dans les neurones qui n’expriment pas de NaChBac. Cette approche peut être modifiée pour fonctionner avec un activateur ou imagerie calcique comme journaliste de connexions. TERPS ajoute à l’ensemble croissant des outils disponibles pour déterminer la connectivité au sein des réseaux. Cependant, les TERPS est unique en ce qu’elle rapporte aussi fiable en masse ou volume et transmission de débordement.

TERPS sert à distinguer les mono - et polysynaptiques contributions dans les connexions synaptiques entre les neurones. Alors que la stimulation faible d’une cellule peut être utilisée pour tester les connexions directes, une plus grande activité présynaptique de conduite souvent recrute polysynaptiques connexions (Figure 1 a). TERPS travaille en exprimant conjointement canal sodique insensibles à la TTX NaChBac et un activateur d’optogenetic et en testant le...

Cet article propose une méthode pour tester les connexions monosynaptiques entre neurones en employant la tétrodotoxine et canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac.

Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

L’objectif global de cette technique est d’identifier électrophysiologiquement les connexions monosynaptiques chez la drosophile à l’aide de canaux sodiques résistants aux tétrodotoxines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple et qu’elle peut révéler la nature chimique des synapses. Il convient également à l’étude du volume ou de la transmission en vrac.Généralement, dans les vidéos novices de cette méthode, nous avons du mal à cause de la difficulté de la dissection. Cependant, en comprenant simplement la méthode, la logique est facilement transférable à d’autres systèmes modèles tels que les souris. Pour les enregistrements, ayez des pipettes patch pour la résistance proche de sept mégaohms.De plus, faites aérer en continu une solution saline d’enregistrement externe avec un pH de 7,3 ou moins avec du carbogène contenant 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Pour les sujets, avoir une crosse de mouches exprimant csChrimson, se propageant sur des aliments contenant 0,2 millimolaire de tous trans-rétiniens. Pour les enregistrements, sélectionnez des adultes âgés d’un à trois jours.Chargez-les dans un flacon à scintillation en verre et immobilisez-le en utilisant une minute d’exposition à des conditions glaciales. Ensuite, abaissez le niveau de lumière sur la lunette de dissection et la pince grossière pour charger une mouche anesthésiée dans la chambre d’enregistrement sur mesure. Fixez la mouche à la chambre en l’entourant de cire ou d’époxy durcissable aux UV.Positionnez-le côté dorsal vers le haut avec la feuille à peu près à mi-hauteur du thorax. La clé pour obtenir une bonne préparation est d’avoir le trou coupé dans le foil pour qu’il soit juste de la bonne taille, afin que la mouche ne soit pas pressée ni capable de tomber à travers. Éclairez la préparation avec des lampes à fibre optique de chaque côté et maintenez-les aussi sombres que possible.Ensuite, couvrez la préparation avec quatre à six gouttes de sérum physiologique. Ensuite, affûtez le fil ou le filament de tungstène pour la dissection. Appliquez environ 20 volts de courant alternatif à une solution saturée de nitrate de potassium et trempez à plusieurs reprises l’extrémité du fil très rapidement dans la solution.Après 20 trempages, la pointe sera tranchante. Maintenant, ajustez les lumières pour fournir juste assez de visibilité pour utiliser le fil aiguisé pour exposer le cerveau en enlevant la cuticule, suivie de la trachée et des corps adipeux. Pour accéder aux lobes antennaires, utilisez un fil de tungstène plié pour glisser doucement l’antenne sous le bouclier en aluminium.Ensuite, à l’aide d’une pince tranchante, vous arrachez doucement la gaine gliale qui recouvre la zone d’intérêt. Transférez maintenant la préparation sur le banc d’électrophysiologie pour effectuer des enregistrements. Sur la plate-forme, commencez immédiatement à perfuser la préparation avec de la solution saline d’enregistrement, bouillonnée de carbogène.Utilisez un réservoir de solution saline alimenté par gravité placé au-dessus de la platine du microscope. Pour collecter les déchets salins, utilisez une conduite à vide et une fiole de 2 litres. Ensuite, chargez la pipette patch avec 4 microlitres de solution d’enregistrement interne et fixez la pipette à un micromanipulateur.Ensuite, mettez à zéro le décalage de l’amplificateur et réglez l’amplificateur pour qu’il délivre des impulsions de test. Ensuite, ajustez l’éclairage oblique IR afin d’obtenir une vue claire du cerveau. Maintenant, tout en appliquant une pression positive sur la pipette, approchez-vous de la cellule avec la pipette.Lorsqu’il est en contact avec la cellule, relâchez la pression positive pour sceller la pipette à la membrane. Ensuite, réglez le potentiel de maintien de la membrane à moins 60 millivolts. Et la pipette doit former un joint gigaohm avec la membrane cellulaire.Le courant de maintien doit descendre à un niveau inférieur à celui du picoampère. Pour obtenir des joints gigaohm constants, assurez-vous de garder votre pipette propre en maintenant une pression positive et évitez de heurter les tissus ou de vous approcher de vos cellules. Pour continuer, réglez l’amplificateur pour qu’il délivre des impulsions de test de moins 50 à moins 60 millivolts.Les impulsions de test révéleront un important transitoire capacitif représentant le courant nécessaire pour charger la pipette patch. Pour supprimer les transitoires capacitifs, ajustez les boutons de compensation de capacité sur l’amplificateur. Maintenant, appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre la membrane cellulaire et obtenir la configuration complète de la cellule.Une forte augmentation de la fugacité capacitive indique le succès. Une légère augmentation du courant de maintien doit également être observée. Ensuite, réglez l’amplificateur sur le mode de pince de courant.Et ajustez le potentiel de la cellule entre moins 50 et moins 60 millivolts. En préparation, configurez le système d’acquisition de données comme indiqué dans le protocole du technicien. Le système nécessite une LED rouge haute puissance positionnée sous la préparation, positionnée pour éclairer la mouche à 0,238 milliwatt par millimètre carré.Maintenant, activez les neurones présynaptiques de manière optogénétique, en utilisant la lumière rouge pulsée dans l’expression de csChrimson. D’autres méthodes peuvent également être utilisées. Avant d’appliquer la tétrodotoxine, une connexion synaptique doit être visible en réponse à une impulsion lumineuse de 40 millisecondes.L’absence de réponse signifie qu’une connexion est peu probable. Le potentiel de maintien peut être ajusté pour mettre l’accent sur les connexions excitatrices ou inhibitrices, en conséquence. Une fois qu’une connexion est vérifiée, mettez en place la profusion saline pour la recirculation au niveau de la solution saline.Réglez la pompe de manière à ce que le niveau de salinité dans le bain reste stable. Ensuite, ajoutez suffisamment de tétrodotoxine au système pour obtenir une concentration finale d’une micromolaire. Cela devrait arrêter l’activité de pointe du neurone patché.Sinon, ajoutez plus de tétrodotoxine au système. Maintenant, appliquez de brèves impulsions de lumière rouge pour activer ce qui est probablement une connexion monosynaptique. Ensuite, procédez à l’ajout d’antagonistes pharmacologiques à la solution saline en recirculation pour tester la nature chimique des connexions synaptiques.L’expression transgénique de la tétrodotoxine dans le canal sodique sensible sauve l’excitabilité dans les neurones et entraîne un potentiel de plateau important. Les interneurones du lobe antennaire réagissent aux odeurs. Cependant, les courants post-synaptiques excitateurs ne sont pas facilement résolus au niveau du soma.Alors, les réponses proviennent-elles directement de l’entrée des neurones du récepteur olfactif ? L’utilisation de tERP révèle que les neurones récepteurs olfactifs établissent des connexions directes avec les interneurones locaux. La stimulation des neurones sérotoninergiques dans le lobe antennaire entraîne un mélange d’excitation et d’inhibition dans les interneurones locaux.L’application de méthysergide, un antagoniste large des récepteurs 5HT, a bloqué une hyperpolarisation lente, mais n’a eu aucun effet sur la dépolarisation, tandis que la mécamylamine bloque la dépolarisation rapide. Cela suggère que la stimulation est cholinergique. Les tERP ont été utilisés pour résoudre la transmission de volume extrasynaptique qui se produit avec le GABA ou les neuromodulateurs.Dans un exemple, l’application de tétrodotoxine n’a pas supprimé un signal inhibiteur dans l’interneurone local. Cette inhibition a été bloquée à l’aide de l’antagoniste de la sérotonine, le méthysergide, suggérant un signal direct d’un neurone sérotoninergique spécifique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir des enregistrements de cellules entières à partir de neurones de drosophile et d’évaluer leur conductivité à l’aide de tERP.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’être patient et de pratiquer la dissection difficile à plusieurs reprises. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est exécutée correctement. Après cette procédure, d’autres méthodes comme la pharmacologie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la nature de la synapse chimique.N’oubliez pas que travailler avec de la tétrodotoxine peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et le travail avec de petits volumes, doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.

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