Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

L’objectif global de cette expérience est de mesurer les changements dans la synthèse de l’ARN par marquage de la bromouridine et immunoprécipitation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme de l’ARN en mesurant si un changement dans les niveaux d’ARN est causé par des changements dans la synthèse de l’ARN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée sur n’importe quel type de culture cellulaire préféré et que les matériaux utilisés sont facilement accessibles.

Pour commencer le protocole, ensemencez 3,5 fois 10 à la sixième HEK293T cellules dans une boîte de Pétri de 10 centimètres dans 10 millilitres de milieu de croissance pour obtenir un total de plus de 40 microgrammes d’ARN lors de l’extraction 48 heures plus tard. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2,48 heures après l’ensemencement, aspirez huit millilitres de milieu de croissance et laissez deux millilitres derrière vous pour éviter que les cellules ne se dessèchent. Ajoutez deux millimoles de bromouridine et de traitement dans le milieu de croissance, et retirez les deux millilitres résiduels des cellules avant de réappliquer les huit millilitres de milieu de croissance contenant de la bromouridine.

Ensuite, incubez les cellules pendant une heure. Après l’incubation, lavez les cellules dans cinq millilitres de tampon de Hank et essayez les cellules avec deux millilitres de trypsine à 0,05 % pendant cinq minutes. Ajoutez huit millilitres de milieu de croissance pour arrêter la réaction, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules pendant deux minutes à 1 000 fois g.

Ensuite, retirez le surnageant et extrayez l’ARN total de la pastille cellulaire à l’aide d’un kit d’isolement d’ARN, puis éluez l’ARN dans de l’eau sans RNase. Cette technique est très sensible, et il est donc important de travailler avec des ARN de haute qualité. L’extraction de l’ARN est donc une étape critique, mais elle est également facilement réalisée avec les kits d’extraction d’ARN d’aujourd’hui.

Préparez les billes en un seul lot pour le nombre d’échantillons à analyser, plus une supplémentaire pour tenir compte des pertes lors du pipetage et du mélange par tourbillon. Remettez en suspension les billes magnétiques IgG anti-souris en les mélangeant et prélevez 20 microlitres de billes par échantillon dans un tube de 1,5 millilitre sans RNase. Placez le tube de 1,5 millilitre dans un support magnétique pendant 20 secondes pour que les billes s’accumulent sur le côté.

Retirez le surnageant, retirez le tube du support magnétique et remettez les billes en suspension dans 40 microlitres de tampon une fois bromouridine-IP par pipetage. Faites tourner le tube pendant deux secondes dans une centrifugeuse de table, remettez-le dans le support magnétique et retirez le surnageant. Ensuite, bloquez la liaison non spécifique aux billes à l’aide d’héparine.

Remettez les billes en suspension dans un millilitre d’une fois la bromouridine-IP plus un milligramme par millilitre de tampon d’héparine, et tournez le tube pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les perles une fois. Remettez les billes en suspension dans un millilitre de tampon bromouridine-IP et ajoutez 1,25 microgramme par échantillon d’anticorps anti-alpha-bromodéoxyuridine.

Incuber les billes pendant une heure en tournant. Après l’incubation, lavez les perles trois fois. Remettez en suspension les billes lavées dans 50 microlitres par échantillon d’un tampon bromouridine-IP complété par une millimoracine millimolaire, et laissez les billes tourner pendant 30 minutes.

Après la rotation, lavez les billes trois fois et remettez les billes en suspension dans 50 microlitres par échantillon d’un tampon bromouridine-IP. Mesurez les concentrations d’ARN dans les extraits d’ARN à l’aide de la spectrophotométrie ultraviolette-visible et diluez 40 microgrammes d’ARN de chaque échantillon dans de l’eau exempte de RNase jusqu’à un volume total de 200 microlitres. Après avoir dénaturé l’ARN pendant deux minutes à 80 degrés Celsius, faites tourner brièvement les échantillons dans une centrifugeuse de table.

Après l’essorage, ajoutez 200 microlitres de deux fois la bromouridine-IP plus BSA, inhibiteur de la RNase. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de billes remises en suspension et préparées à chaque échantillon, et faites pivoter les échantillons pendant une heure. Après l’incubation, lavez les perles quatre fois.

Remettez les billes en suspension dans 200 microlitres de tampon d’élution pour éluer l’ARN, et ajoutez rapidement 200 microlitres de phénol pH 6,6 pour éliminer toutes les molécules non ARN de l’échantillon. Faites tourner l’échantillon pour le mélanger et faites-le tourner pendant trois minutes à 25 000 fois g dans une centrifugeuse de table. Ensuite, aspirez autant de phase supérieure que possible, environ 190 microlitres, et déplacez-la dans un tube contenant 200 microlitres de phénol-chloroforme de pH 6,6.

Assurez-vous d’aspirer la même quantité sur tous les échantillons. Faites tourner l’échantillon et faites-le tourner. Après l’essorage, effectuez l’extraction du chloroforme en aspirant la phase supérieure aqueuse, environ 180 microlitres, et transférez-la dans un tube contenant 200 microlitres de chloroforme.

Tourbillonnez puis faites tourner l’échantillon. Aspirez la phase supérieure aqueuse, environ 170 microlitres, et transférez-la dans un tube contenant 17 microlitres d’acétate de sodium à trois pH molaires et six pour neutraliser et précipiter l’ARN de la solution aqueuse. Ensuite, ajoutez deux microlitres de glycogène, qui précipitera avec l’ARN et rendra la pastille plus visible.

Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 96 % pour augmenter la liaison entre les ions sel et l’ARN, et mélangez en inversant le tube plusieurs fois. Laissez le tube toute la nuit à moins 20 degrés Celsius ou pendant 15 minutes sur de la glace sèche. Faites tourner l’échantillon réfrigéré, jetez le surnageant sans déranger la pastille et lavez la pastille dans 185 microlitres d’éthanol à 75 % pour éliminer tout sel résiduel.

Ensuite, faites tourner l’échantillon à 25 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez complètement le surnageant sans déranger la pastille et laissez sécher la pastille pendant cinq à 10 minutes avec le couvercle ouvert. Remettre en suspension la pastille dans 10 microlitres d’eau sans RNase appliquée sur le côté du tube pour éviter de déranger la pastille.

Les cellules AsPC-1 ont été traitées avec de la bromouridine pendant zéro, une, deux et 4,5 heures, suivies d’une extraction de l’ARN total et de la bromouridine-IP. GAS5 et GAPDH ont été mesurés dans l’ARN bromouridine-IP, ce qui a démontré qu’une heure de marquage était suffisante pour atteindre un changement de neuf et 44 fois par rapport au bruit de fond. Deux millimoles de traitement à la bromouridine n’ont induit aucun changement morphologique dans les cellules HEK293T pendant une heure ou pendant le traitement plus long de quatre heures.

L’inhibition de PLK-2 a provoqué une augmentation de l’ARNm de l’alpha-synucléine à la fois dans l’entrée et la bromouridine-IP, suggérant que l’augmentation de l’ARN à l’état d’équilibre est causée par une augmentation de la synthèse de l’ARN. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer l’ARN nouvellement synthétisé avec de la bromouridine et d’effectuer une immunoprécipitation ultérieure de la bromouridine et de l’ARN marqué.