Un protocole Facile à générer des protéines relativement acétylées chez Escherichia Coli

Dans ce travail, nous démontrerons un protocole facile pour produire des protéines acétylées homogènes à des sites spécifiques en utilisant E. coli comme hôte d’expression. L’acétylation réversible de la lysine des protéines est l’une des modifications post-traductionnelles les plus abondantes dans la nature. Il joue un rôle important dans un large éventail de processus biologiques, notamment la transcription des gènes, la réponse au stress, la différenciation cellulaire et le métabolisme.

La génération de protéines purement acétylées aux positions de conception est très utile pour étudier l’acétylation des protéines. Cependant, c’est difficile pour la plupart des méthodes classiques. Ce défi a été résolu par la technique d’expansion du code génétique.

Il utilise une variable pyrrolysyl-ARNt synthétase modifiée pour charger l’ARNt-Pyl avec de l’acétyllysine, puis utilise la machinerie translationnelle de l’hôte pour supprimer le codon stop UAG dans l’ARNm, et dirige l’incorporation de l’acétyllysine dans la position de conception de la protéine cible. Tout d’abord, le codon stop ambré doit être introduit dans la position correspondante dans le gène cible par mutagenèse dirigée par site. Amplifiez le plasmide matrice contenant le gène des protéines de type sauvage, et insérez la mutation du codon stop des amorces par la réaction PCR.

Après la PCR, le matériau amplifié est ajouté directement au mélange d’enzymes kinase-ligase-Dpn1 pendant une heure à température ambiante pour la circularisation et le retrait de la matrice. Ajoutez cinq microlitres du mélange dans le tube de 25 microlitres de cellules E.coli compétentes décongelées. Feuilletez délicatement le tube pour mélanger et placez le mélange sur de la glace pendant 30 minutes.

Choquez le mélange à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes et placez-le sur de la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Pipeter 600 microlitres de milieu SOC à température ambiante dans le mélange. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes en secouant.

Étalez 100 microlitres sur l’assiette avec l’antibiotique correspondant et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le plasmide de la colonie unique est envoyé pour le séquençage. La deuxième étape consiste à exprimer et à purifier des protéines acétylées spécifiques au site.

Prélevez une seule colonie sur la plaque, qui contient le gène cible muté contenant le TAG et le système d’incorporation de l’acétyllysine. Inoculer dans un milieu frais de 15 millilitres avec les antibiotiques correspondants pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Transférez la culture de nuit de 15 millilitres dans un milieu frais de 300 millilitres avec des antibiotiques et incubez à 37 degrés Celsius.

Ajouter de l’acétyllysine de cinq millimolaires et du nicotinamide de 20 millimolaires comme concentrations finales dans les milieux de croissance lorsque l’absorbance atteint 5 à 600 nanomètres. Cultivez des cellules pendant une heure supplémentaire à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite l’inducteur pour l’expression des protéines et faites pousser des cellules à 25 degrés Celsius pendant la nuit.

Prélever les cellules par centrifugation à 3 000 g pendant 15 minutes. Jetez le surnageant et stockez les pastilles de cellules à moins 80 degrés. Décongelez les pastilles cellulaires congelées sur de la glace et mettez-les en suspension avec 15 millilitres de tampon de lyse, cinq microlitres de bêta-mercaptoéthanol et un microlitre de nucléase.

Les cellules sont brisées par la sonication. Centrifuger l’extraction brute à 20 000 g pendant 25 minutes à quatre degrés. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à membrane de 45 micromètres.

Chargez l’échantillon filtré dans une colonne contenant un millilitre de résine de nickel NTA, équilibrée avec 20 millilitres de tampon de lyse. Lavez la colonne avec 20 millilitres de tampon de lavage. La protéine cible est éludée avec deux millilitres de tampon d’élution.

La protéine purifiée est dessalée par la colonne-10 en ajoutant un échantillon de 2,5 millilitres et un échantillon dessalé est collecté avec un tampon de dessalage de 3,5 millilitres. La prochaine étape consiste à caractériser biochimiquement les protéines acétylées purifiées. Dénaturez les protéines avec le tampon d’échantillon SDS au-dessus de 100 degrés pendant cinq minutes.

Centrifugez le mélange, chargez-le sur le gel SDS-PAGE et faites-le fonctionner à 200 volts pendant 30 minutes. Lavez le gel à l’eau distillée et secouez-le doucement. Pour fabriquer le sandwich pour le western blot, de la cathode à l’anode, il y a une éponge, du papier filtre, un tampon de transfert, du gel SDS-PAGE trempé, une membrane PVDF activée au méthanol, un autre papier filtre, retirez les bulles dans le sandwich et une autre éponge.

Mettez la pile dans le réservoir de transfert. Fonctionne à un courant constant de 350 milliampères pendant 45 minutes. Lavez la membrane PVDF avec un tampon TBST de 25 millilitres pendant cinq minutes en secouant doucement.

Bloquez la membrane avec 5 % BSA et le tampon TBST pendant une heure à température ambiante. Incuber la membrane avec un anticorps acétyllysine dilué conjugué à HRP à température ambiante pendant une heure ou quatre degrés pendant la nuit en secouant doucement. Lavez la membrane avec un tampon TBST de 20 millilitres pendant cinq minutes en secouant doucement.

Répétez cette étape quatre fois. Appliquez le substrat de chimiluminescence sur la membrane pendant une minute. Capturez le signal avec un imageur de caméra CCD.

Les mêmes volumes de fractions d’élution et de purification des protéines ont été chargés sur le gel SDS-PAGE. Le rendement de la protéine acétylée est d’environ la moitié de celui de la protéine de type sauvage, ce qui est très efficace, et la même souche d’expression sans acétyllysine et milieu de croissance ne peut pas produire de protéines en quantité détectable, ce qui indique une grande pureté de la protéine acétylée puisqu’il n’y a pas d’acides aminés canoniques incorporés à cette position spécifique. Le Western blot a montré qu’il n’y a pas d’acétylation détectable dans les protéines de type sauvage, ce qui indique le faible bruit de fond d’acétylation non spécifique de ce système d’expression, tandis que les protéines acétylées avaient une bande claire.

spectrométrie de masse en tandem a confirmé que l’acétylation se produit au bon endroit dont la position correspondante dans le gène a été mutée en codon stop. Pour obtenir de bons rendements et la pureté des protéines acétylées, le système d’incorporation optimisé de l’acétyllysine doit être utilisé à la fois pour une efficacité élevée et une grande pureté. Les cellules BL21(DE3) doivent être utilisées pour une acétylation à faible bruit de fond et non spécifique afin d’augmenter la pureté.

Le système d’incorporation génétique pourrait être utilisé dans les systèmes eucaryotes pour des applications plus larges.