Name: Zygotiques Fluorescence Recovery After blanchiment Photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Découvrez la méthode zFRAP pour évaluer la décondensation de la chromatine dans les zygotes sans compromettre leur développement jusqu'à terme. Cette technique permet d'étudier la biologie du développement embryonnaire.

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Nous remercions Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura et Kana Kishida pour fournir des commentaires critiques et support technique. Ce travail a été financé en partie par le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science and Technology programme pour promouvoir la réforme des universités nationales de M.O. ; la société japonaise pour la Promotion des sciences (16H 02593), Asada Science Foundation et la Fondation de la Science de Takeda à T.W. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

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<li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li>
<li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725(2013).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme l’a révélé dans cette étude, l’analyse de zFRAP ne provoque pas de dégâts critiques au développement à terme, suggérant que cette méthode est un outil très utile pour révéler le lien entre les événements moléculaires et le potentiel de développement embryonnaire. Au cours de la reprogrammation, dans les deux cellules comme état de cellules ES, par lequel le différentiel potentiel de ces cellules devient plus élevé que celui des embryons au stade de deux cellules, relâchement de la chromatine se transforme en qui co...

Après la fécondation, la structure de la chromatine est modifiée dynamiquement, et structure de la chromatine zygotique est puis finalement établie1,2. Durant cette période, dans les pronucléus paternels, la protéine dominante de la chromatine est passée de protamine en histone. La chromatine qui en résulte est extrêmement différente de celle des spermatozoïdes et des ovocytes féminins en plusieurs points (par exemple, composition variant d’histone, modification des histones). Ainsi, formé de chromatine zygotique est considérée comme important pour le développement ultérieur de l’embryon. Cependant, malgré les efforts pour révéler les détails de la structure de la chromatine zygotiques sur de longues périodes, des méthodes pour évaluer la qualité des zygotes ou pour prédire leur développement à terme au stade unicellulaire en analysant leur structure de la chromatine n’ont jamais été mis en place.
Dans l’étude précédente, il est découvert que les zygotes ont une structure de chromatine extrêmement desserré3. Actuellement, la chromatine desserrement ou une ouverture est censé être un important facteur de différenciation cellulaire potentielle de cellules souches embryonnaires (ES)4. ES cellules ne présentent pas d’homogénéité dans la nature, mais sont assez hétérogènes ; dans les colonies de cellules ES, certains acquièrent transitoirement un potentiel plus élevé de différenciation comparable à blastomères des embryons au stade de deux cellules. Au cours de cette transition dans les deux cellules comme État, relâchement de la chromatine dans ES cellules change dans ce qui est comparable avec le stade de deux cellules d’embryons5. Relâchement de la chromatine semble donc être important pour le potentiel de différenciation cellulaire et il est possible qui s’ouvrent largement la chromatine dans les zygotes est utile pour l’évaluation du potentiel de développement zygotique.
L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse étant donné que cette méthode permet le développement ultérieur et même à terme développement6. Parmi les méthodes d’imagerie live, FRAP analyse a été utilisé pour examiner le relâchement de la chromatine dans les embryons préimplantatoires et ES cellules3,4,5. Si le relâchement de la chromatine zygotiques peut être analysée sans un effet néfaste sur le développement à terme par FRAP analyse, il peut être un outil précieux pour l’évaluation de la qualité des embryons au stade unicellulaire. Toutefois, les effets sur le développement à terme par cette méthode expérimentale n’ont pas été examinés. Récemment, un système d’expérimentation à l’aide de FRAP pour évaluer le relâchement de la chromatine zygotique a été développé. Parce qu’il s’agissait d’un nouveau système d’observation pour les zygotes, il a été appelé comme FRAP zygotique (zFRAP). zFRAP n’a rien à terme développement critique et a été signalée ailleurs7. Dans ce rapport, le protocole de cette méthode expérimentale est décrit.

<table><tbody><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 peut également être utilisé pour l’analyse FRAP (référence #7)</td></tr><tr><td>Plaque thermique</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Micro manupilateur</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze Micro Micromanipulateur</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture de 35 mm</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>style 35 x 100 mm ; pour FIV</td></tr><tr><td>Boîte de culture de 60 mm</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>style 60 x 15 mm ; pour culture d’embryons</td></tr><tr><td>Boîte de culture de 50 mm</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>style 50 x 9 mm ; pour manipulation sur la scène</td></tr><tr><td>Boîte à fond en verre de 50 mm</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>de 50 mm, 27 mm et taille du trou ; pour analyse FRAP</td></tr><tr><td>Huile minérale</td> Produits <td>chimiques de spcéialité organique</td><td>625071</td><td>Pour l’analyse FRAP sur les plats à fond en verre</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>Pour la FIV et la culture embryonnaire</td></tr><tr><td>capillaire en verre</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Pour la manipulation des zygotes de souris</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>Pour la micro-injection d’ARNm</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Instrument de sutter</td><td>P-97/IVF</td><td>Pour la préparation de l’injection ou du neadle de maintien (diamètre extérieur : 80 & micro ; m, diamètre intérieur : 10 & micro ; m)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>&nbsp ; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Kit de transcription</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Poly (A) kit de résidus</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>solution PVP 10 % (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES tamponné HTF contenant 10 %</td></tr><tr><td>PVP Sodium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide matrice pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>pour l’ARNm eGFP-H2B (référence #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Chargement de l’échantillon Colorant&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>Pour l’électrophorèse d’ARNm transcrit in vitro</td></tr><tr><td>Phénol chloroforme isamylique</td><td>alcool nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp ; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Capteur de puissance otical</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp ; Capteur de puissance pour microscope stéréométrique laser</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

zygotiques fluorescence recovery after blanchiment photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse. Récemment, la chromatine desserrement ou une ouverture s’est avéré être impliqués dans le potentiel de différenciation cellulaire des cellules souches embryonnaires pluripotentes. Il a été rapporté précédemment que comparé avec les cellules souches embryonnaires, zygotes hébergent une structure de la chromatine extrêmement desserrées, suggérant sa liaison avec leur totipotence. Toutefois, jusqu'à présent, il n'a pas été traitée si cette structure de la chromatine extrêmement relâché/ouvrir est importante pour les potentialités de développement embryonnaire. Dans la présente étude, afin d’examiner cette hypothèse, un système expérimental dans lequel zygotes qui ont été analysés par fluorescence récupération après blanchiment photo peut se développer à terme sans aucun dommage significatif a été développé. Ce qui est important, ce système expérimental a besoin seulement un chauffage de la thermos-plaque en plus un confocal laser scanning microscope. Les conclusions de cette étude suggèrent que le rétablissement fluorescence après que blanchiment photo analyse (PAF) de l’analyse peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires dans la chromatine zygotique sont importants pour le développement à terme.

zFRAP analyse avec eGFP-H2B
Produit correctement ARNm codant pour eGFP-H2B, qui est considéré comme un groupe décalé posés par poly une traînée (Figure 2 a), a été injecté dans le cytoplasme des zygotes avec un 2ème globule polaire à 1-3 h après l’insémination (Figure 2 b). 8 à 12 h après l’insémination, les zygotes avec 2 pronucléi montrant l’expression de H2B-eGFP ont ét...

Relâchement de la chromatine semble être impliquée dans le développement potentiel des blastomères. Cependant, on ne sait pas si le relâchement de la chromatine peut être utilisé comme un indice fiable pour le potentiel de développement pour les embryons. Ici, on a décrit un système expérimental dans lequel les zygotes-Evaluation de relâchement de la chromatine peuvent développer à terme.

Zygotiques Fluorescence Recovery After blanchiment Photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

L’objectif global de ce FRAP zygotique ou zFRAP est d’examiner l’association entre le relâchement de la chromatine zygotique et le potentiel de développement embryonnaire à terme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que le développement embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet au zygote analysé de se développer jusqu’à terme sans dommages significatifs.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de l’analyse zFRAP sont difficiles à apprendre car le réglage et le fonctionnement des conditions expérimentales de cette analyse sont très complexes. Après avoir préparé l’ARN eGFP-H2B selon le protocole de texte, utilisez de l’eau sans nucléase pour le diluer à 250 nanogrammes par microlitre. Dans une parabole de 60 millimètres, placez deux à trois gouttes de PVP-HTF, cinq à six gouttes de CZB tamponné à Hepes et d’ARNm eGFP-H2B.Ensuite, utilisez de l’huile minérale pour couvrir les gouttes. À l’aide d’un extracteur de pipette, tirez le verre borosilicaté. Après avoir cassé la pointe, utilisez une microforge pour plier la pipette en verre à environ 30 degrés.Avant la micro-injection, vérifiez que la plaque chauffante sur la platine du micromanipulateur est éteinte pour éviter de tuer les zygotes lors de l’injection d’ARNm. Ensuite, avec 10 % de PVP-HTF, lavez et enduisez l’intérieur des aiguilles d’injection. Ensuite, à partir des extrémités, remplissez les capillaires en verre avec l’ARNm eGFP-H2B dilué.Récupérez les zygotes fécondés avec un deuxième corps polaire et transférez-en 20 à 25 dans la chambre de la platine du microscope. Ensuite, à l’aide d’une pipette de maintien, tenez le zygote et brisez la zone pellucide et la membrane cytosolique à l’aide d’un entraînement piézoélectrique. Injectez environ 10 picolitres d’ARNm dans le cytoplasme de chaque zygote.Terminez les injections dans les 10 minutes pour éviter les dommages causés par la culture des zygotes à l’extérieur de l’incubateur. 10 minutes après la micro-injection, lavez les zygotes dans au moins trois gouttes de CZB et cultivez-les à 38 degrés Celsius jusqu’à l’analyse FRAP. Une heure avant l’analyse zFRAP, allumez le laser et la plaque chauffante fixés à la platine du microscope confocal.Réglez la température à 38 degrés Celsius. Sur une boîte à fond de verre de 60 millimètres, pipetez six à 10 microlitres de milieu CZB tamponné à Hepes et recouvrez-le d’huile minérale. Ensuite, réchauffez le plat sur le feu jusqu’à ce qu’il recueille le zygote.Pour faciliter la recherche du zygote avec le microscope confocal, il est important de placer les gouttes au centre de la parabole. Huit à 12 heures après l’insémination, prélever cinq à 10 zygotes exprimant l’eGFP-H2B et les transférer dans une goutte de six à 10 microlitres de milieu CZB tamponné à l’Hepes préchauffé. Pour effectuer une analyse quantitative précise, il est important de placer le zygote vers le centre des gouttes de CZB tamponnées par Hepes.Réglez les conditions de blanchiment et d’imagerie selon les instructions du fabricant. Par exemple, sous Paramètre d’acquisition, définissez la vitesse de numérisation sur quatre microsecondes par pixel et la taille sur cinq cent douze. Augmentez le zoom numérique à cinq, ouvrez le DyeList"et choisissez eGFP"Ensuite, réglez le temps d’observation à un point six secondes et le nombre de photos à 12.Ensuite, démarrez le panneau Paramètres de stimulus"et sur UseScanner"cliquez sur Principal"Réglez la vitesse de balayage à 10 microsecondes par pixel. Cliquez sur Activation en série"Régler la préactivation » sur trois images et le temps d’activation sur cinq secondes. Ensuite, cliquez sur Focus x2"et cliquez sur Arrêter"Sous le panneau de réglage du stimulus, cliquez sur Clip Rect"Réglez le ROI sur 40 par 40 pixels.Cliquez sur Temps"et XY"Ensuite, utilisez un wattmètre optique pour accéder à la puissance laser. Il est important d’éteindre les lumières lors de la mesure du laser. Après avoir ajusté la jauge laser pour régler la puissance laser de blanchiment et d’imagerie, dans la barre d’outils, cliquez sur En direct, puis démarrez Tracé en direct, placez l’huile sur la lentille de l’objectif.Placez la chambre sur la scène, puis trouvez les zygotes dans les gouttes. Après avoir trouvé des zygotes, déterminez la position du retour sur investissement en cliquant sur Focus x2", puis dans la fenêtre Tracé en direct, ajustez la jauge de puissance HT pour l’intensité de fluorescence du canal eGFP à environ 2 000. Pour démarrer l’analyse zFRAP, cliquez sur XY"Après l’analyse FRAP, cliquez sur Série terminée"Obtenez les données analysées FRAP, puis cliquez sur Enregistrer sous"pour enregistrer le fichier 2D View image"en tant que fichier nommé préféré.Utilisez Copier « ROI » et Coller"ROI pour préparer une région de référence et un arrière-plan respectivement. Ensuite, sélectionnez ROI, REF et BG, puis dans la fenêtre d’image Vue 2D, cliquez sur Analyse de série, puis dans la fenêtre Tracé en direct, cliquez sur le bouton Enregistrer. Effectuer des calculs de données selon le protocole texte.Huit à 12 heures après l’insémination, des zygotes avec deux pronucléaïs montrant l’expression de eGFP-H2B" » ont été collectés et soumis à une analyse zFRAP. Après le blanchiment, l’intensité du signal fluorescent eGFP-H2B s’est légèrement rétablie en raison de l’afflux d’eGFP-H2B dans le ROI à partir de la zone non blanchie dans le nucléoplasme. Les courbes de récupération révèlent que les pronuclées mâles se sont rétablis plus rapidement et avec plus de fractions mobiles que les pronuclées femelles.Comme le démontrent ces images et ce graphique, après l’analyse zFRAP, les zygotes lavés et cultivés dans le milieu CZB se sont développés jusqu’au stade de blastocyste sans dommages significatifs. Pour analyser le développement à terme, des embryons au stade bicellulaire ont été transférés dans les ovoducs de mères pseudo-enceintes. Comme l’indique ce tableau, le taux de natalité des embryons analysés par zFRAP était légèrement, mais significativement inférieur, à celui des embryons intacts, mais était le même que celui des embryons sans zFRAP.De plus, les chiots dérivés des zygotes analysés par zFRAP semblaient en bonne santé et pleinement développés. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’attendre l’autre extension. Toute l’objectorance budgétaire pour éviter la dérive de l’attention.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser le relâchement de la chromatine dans les zygotes.

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