Name: Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Découvrez comment optimiser l'incorporation d'acides aminés non canoniques dans des cellules de mammifères pour cartographier les interactions protéiques et marquer les récepteurs de surface.

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Ce travail a été fondé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au titre de subventions CO822/2-1 (programme Emmy Noether) et CO822/3-1 à c. i.

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Le protocole décrit une analyse simple et fiable pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales pour l’incorporation de l’ANAC protéines exprimées dans des cellules de mammifères. Le principal avantage de cette méthode en ce qui concerne les tests couramment issu des FACS est qu’il permet la préparation simultanée et la mesure d’un plus grand nombre d’échantillons et fournit des données qui sont analysées facilement à l’aide d’un logiciel ordinaire. La disponibilité d’une méthode de débit moyen pour analyser des paire...

L’incorporation génétique des sondes chimiques dans les protéines est une méthode puissante pour faciliter l’étude des aspects structurels et dynamiques de la fonction des protéines directement dans le contexte autochtone de la cellules vivantes. De nos jours, des centaines d’amino-acides non canoniques (ANAC) équipés de groupes chimiques plus disparates peuvent être relativement incorporés dans les protéines par biosynthèse1,2,3,4. Entre eux, on trouve photosensibles ANAC comme photo-agents réticulants5, mis en cage-photo6,7,8,9 et photo-commutable acides aminés10, 11, acides aminés portant tendues alcènes et alcynes pour bioorthogonal sans catalyseur chimie2,12,13,14,15,16 ,,17acides aminés transportant dansyl18, coumarine9,19et fluorophores21 prodan20,et acides aminés équipés d’autres sondes biophysiques comme Bien que le post traductionnelle modifications1,2,3,4,22,23,24,25.
Le codage génétique d’un ncAA est activé par un dédié amino-acyl--synthétase de tRNA (RAA) couplé à un suppresseur-tRNA apparenté, qui incorpore la ncAA en réponse à un codon stop ambre pendant la synthèse ribosomique ordinaire. paires de ncAARS/ARNt sont conçus afin d’être orthogonal dans l’organisme hôte, c'est-à-dire pas la diaphonie avec les paires endogènes. La technique est bien établie en hôtes procaryotes et eucaryotes et cellules facilement applicables aux mammifères. Paires pour l’incorporation de la ncAA en cellules mammifères reposent sur trois principaux systèmes orthogonaux : le système de tyrosyl, qui combine la TyrRS d’e. coli26 avec un suppresseur de tyrosyl ambre de b. stearothermophilus27 (Ec TyrRS / paire YamBst), l’e. coli leucyl système (EcLeuRS/ARNtLeuCUA paire)6,18,28 et le système de pyrrolysyl d’archaea (PylRS/ARNt Pyl paire)3, auquel cas l’ARNtPyl est un suppresseur de l’ambre naturel. En général, chaque ncAA est reconnu par un ncAARS spécialisées. Selon la structure de la ncAA, le ncAARS est obtenu par évolution dirigée de la TyrRS, LeuRS ou PylRS, bien que certains synthétases peuvent accepter plusieurs ncAA.
La paire orthogonale est importée dans les cellules en utilisant simplement un vecteur plasmidique. Plus efficaces et communes de plasmides sont bicistronique et codent pour la synthétase et l’ARNt formant la paire orthogonale29. Un deuxième plasmide codant pour la protéine d’intérêt portant un codon ambre sur le site désigné pour la modification est co-transfectée. La ncAA est simplement ajouté au milieu de croissance cellulaire. Cependant, différents groupes spécialisés utilisent souvent les différentes variantes de constructions de plasmide même pour l’incorporation de la ncAA même. Constructions diffèrent par l’arrangement des gènes dans le vecteur, le type de la synthétase, l’utilisation de codon dans le gène de la synthétase, l’utilisation de promoteur, la variante de l’ARNt et le nombre de cassettes d’expression ARNt. En outre, l’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut varier considérablement en raison de l’efficacité catalytique différente les synthétases différentes, la qualité de l’ARNt et autres facteurs30. Par conséquent, il est important de disposer d’une méthode rapide et fiable pour évaluer l’efficacité d’une paire orthogonale, à choisir le système le plus approprié pour une application souhaitée tant pour effectuer certaines étapes d’optimisation qui améliorent l’expression protéique globale rendements.
Nous avons établi une analyse axée sur la fluorescence simple et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales29 (Figure 1). Dans l’essai, les cellules sont transfectées conjointement avec le plasmide codant pour la paire orthogonale, ainsi que d’un plasmide de journaliste bicistronique codant pour la protéine fluorescente verte portant un codon d’arrêt ambre à une position permissive (EGFPTAG) et la gène mCherry. Fluorescence rouge et verte de lysats de cellules entières sont interprétées dans des canaux séparés sur un lecteur dans une plaque à 96 puits. L’intensité de la fluorescence verte est directement en corrélation avec l’efficacité de la répression ambre, alors que l’intensité de la fluorescence rouge donne une estimation directe de la taille de l’échantillon mesuré et l’efficacité de transfection. En ce qui concerne des études similaires basées sur la fluorescence assistée cellule triant (FACS) lecture31,32, le test donne une évaluation immédiate et complète de l’expression protéique dans la population de cellules entières, ce qui est plus représentatives des conditions expérimentales usuelles et propose une acquisition de données plus facile et le traitement avec le logiciel standard. Dans l’ensemble, le principal avantage du dosage est qu’un support pour un grand nombre d’échantillons peut être analysé en parallèle. À l’aide de ce test, nous avons projeté une bibliothèque conçue rationnellement des ARNt-suppresseur pour améliorer l’efficacité du système orthogonal Pyl30. Cet ouvrage décrit le protocole expérimental pour effectuer ce test et montrent des exemples de son application, y compris l’optimisation de la paire orthogonale pour l’incorporation de la photo-réticulation ncAA p-azido-L-phénylalanine (Azi) et la comparaison des efficacité de l’incorporation de différents acides aminés (Figure 2).
Au cours des dernières années, outils de ncAA sont sont avérées très puissants pour étudier la structure et les aspects fonctionnels de la G-protéine couplée récepteurs (RCPG)33,34,35,,du3637 , 38. chez les humains, les RCPG forment une grande famille de récepteurs membranaires (800 membres) et représentent les principales cibles des médicaments thérapeutiques. Il est toujours difficile de directe caractérisation structurale des RCPG et méthodes biochimiques complémentaires sont très nécessaires pour leur enquête. Nous avons mis au point l’utilisation de photo-réticulation ANAC pour cartographier les surfaces GPCR et découvrez le ligand liant poches34. Est-ce que nous en utilisant notre système optimisé pour l’incorporation de l’Azi, systématiquement intégrées Azi dans tout le domaine de juxtamembrane entier d’un RCPG directement dans les cellules de mammifères vivants. Lors de l’irradiation UV, Azi forme une espèce de nitrène fortement réactif qui capte par covalence molécules voisines. Quand le ligand est ajouté au système, Azi sert une sonde de proximité à révéler quels postes du récepteur se rapprochent du ligand lié. De cette façon, le mode de liaison de l’hormone de neuropeptide urocortine I (Ucn1) sur le récepteur de la classe B GPCR corticotropin-releasing-factor de type 1 (CRF1R)33 a d’abord été dévoilé. Dernièrement, nous avons divulgué modes de liaison distincte des agonistes et antagonistes sur les mêmes récepteurs38. Une approche similaire a été appliquée par les autres pour révéler des orthosteric et des sites de liaison allostérique d’autres peptides et des ligands de petites molécules autres RCPG39,40,41,42. Ce manuscrit décrit le protocole expérimental appliqué dans notre laboratoire photo-réticulation cartographie des surfaces des RCPG. La méthode est relativement rapide, simple et ne nécessite pas d’aucun équipement spécial, afin qu’elle s’applique dans les laboratoires de biochimie standard. Ce qui est important, l’approche fournit un outil précieux non seulement pour identifier les sites de liaison de ligand où les données structurales 3D sont rares, mais aussi pour compléter les données in vitro existantes avec les informations de récepteurs entièrement post-traductionnellement modifiées dans le environnement physiologique de la cellule en direct.
Le développement récent de nouveaux ANAC portant sur les côté chaîne des groupes chimiques convenant ultra-rapide sans catalyseur bioorthogonal chimie a ouvert la possibilité d’installer des fluorophores de dernière génération pour l’imagerie de Super-résolution en protéines directement sur la vie des cellules de2,43. Ces ancrages chimiques comprennent tendue cyclooctyne SCOK14, nonyne bicyclo [6.1.0] BCNK12,17et trans-cyclooctènes de TCO * K13,15,17 entre autres ANAC héberger un norbornène16,17,44 ou le cyclopropène45,46 portion. ANAC encombrants pour la chimie de bioorthogonal est intégrées par une variante de le PylRS généralement décrit comme PylRSAF (indiquant la mutation Y271A et Y349F en PylRS de M. barkeri ), ainsi que par d’autres ad hoc a évolué de ncAARSs17 , 44. les ancres bioorthogonal réagissent avec tetrazine réactifs47 par cycloaddition de Diels-Alder inverse électron-demande pour donner des rendements élevés et étiquetage dans quelques minutes43,48. Cependant, application de cette approche puissante pour étiquette RCPG a été difficile en raison d’une faible efficacité globale du système orthogonal ncAA incorporation. En utilisant notre système amélioré de Pyl, nous avons récemment démontré incorporation de haut rendement de ces acides aminés dans les RCPG et ultrarapide GPCR étiquetage sur la surface des cellules de mammifères vivants30. Récepteurs marqués étaient encore fonctionnels, car ils physiologiquement intériorisé dès l’activation du récepteur avec un agoniste. Le protocole expérimental pour l’incorporation de bioorthogonal ancres dans les RCPG et les étapes suivantes d’étiquetage sont décrites ici. Équiper les RCPG avec des fluorophores lumineux petits est la première étape fondamentale vers l’étude de la dynamique des structures RCPG dans les cellules vivantes par l’intermédiaire de techniques de microscopie avancées.

<table><tbody><tr><td><fort>Produits chimiques</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acryamide/Bisacrylamide 30 % (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-Azidophénylalanine (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>réactif de chimiluminescence amélioré (ECL)&nbsp ;</td><td></td><td>10 mg/l de luminol dans 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l&nbsp ; acide p-coumarique dans le DMSO ; 30 % H2O2 (1 000 : 100 : 0,3)</td>EDTA Carl Roth 8043.1 EGTA Carl Roth 3054.1 endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)Sichem SC-8014 FBS Thermo Fisher (<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Carl Roth</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&uuml ; ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acide p-coumarique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-chlorhydrate de lysine</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (FDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazine-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>trans-Cyclooctène-L-lysine (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 2.5</td><td> %Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30 %)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cells</td><td>Collection allemande de Micro-organismes et cultures cellulaires GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 tubes de 8 watts</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp ;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Plasmides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide E2AziRS</td><td>Le gène huminisé de E2AziRS a été synthétisé par Geneart (Life Technologies)</td><td></td><td>Plasmide contenant 4 copies en tandem de l’ARNt suppresseur Bst-Yam piloté par le promoteur U6 humain et une copie d’un gène humanisé pour la variante améliorée de l’Azi-tRNA synthétase (EAziRS) pilotée par un promoteur</td></tr> <tr><td>PGKplasmides mutants POI-TAG</td><td>Plasmide codant pour le POI piloté par le promoteur CMV, fusionné C-terminalement au FLAG-tag, portant un codon TAG à la position souhaitée&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>Cloné dans le MCS de pcDNA3.1</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>Cloné dans le MCS de pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td><td>synthétisé par Genart (Life Technologies)</td><td></td><td>Cloné dans le MCS de pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 conjugué&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&nbsp ;</td><td>monoclonal, produit dans le clone de souris M2</td></tr><tr><td>Anticorps anti-HRP de chèvre</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CRF de lapin</td><td>PBL #rC69</td><td>polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., et Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ucn1 de lapin</td><td>PBL</td><td>#5779</td><td>polyclonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., et Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr></tbody></table>

optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans rcpg pour photo-réticulation cartographie et de la chimie de bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

La constitution génétique des acides aminés non canoniques (ANAC) via la suppression de codon stop ambre est une technique puissante pour installer des sondes artificiels et réactives moitiés sur protéines directement dans les cellules vivantes. Chaque ncAA est constituée par deux (RAA) orthogonal dédié suppresseur-/ amino-acyl-ARNt-synthétase de tRNA qui est importé dans l’organisme hôte. L’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut diffèrent grandement et insatisfaisante dans certains cas. Orthogonaux paires peuvent être améliorées en manipulant les RAA ou l’ARNt. Cependant, évolution dirigée des ARNt ou RAA à l’aide de grandes bibliothèques et les méthodes de sélection morts/vivants ne sont pas réalisables dans les cellules de mammifères. Est présenté ici, un essai basés sur la fluorescence facile et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales en cellules mammifères. Le test permet de dépistage des dizaines ou des centaines de variantes de RAA/ARNt avec un effort modéré et dans un délai raisonnable. Utilisation de ce test pour générer de nouveaux ARNt qui améliorent considérablement l’efficacité du système orthogonal pyrrolysine est décrite, ainsi que l’application de l’ANAC à l’étude des protéines G récepteurs couplés (RCPG), qui contestent les objets de la ncAA mutagenèse. Tout d’abord, en intégrant systématiquement les une ncAA photo-réticulation tout au long de la surface extracellulaire d’un récepteur, les sites de liaison des ligands différents sur le récepteur intact sont mappés directement dans les cellules vivantes. Deuxième, incorpore un RCPG de dernière génération ANAC, ultrarapide récepteur sans catalyseur marquage avec un colorant fluorescent est démontrée, qui exploite bioorthogonal cycloaddition contrainte-favorisé inverse Diels Alder (SPIEDAC) sur les cellules vivantes. ANAC peut être généralement appliquée à n’importe quelle protéine indépendamment sur sa taille, la méthode est d’intérêt général pour un certain nombre d’applications. En outre, incorporation de ncAA ne nécessite pas d’aucun équipement spécial et est facilement effectuée dans les laboratoires de biochimie standard.

Les grandes lignes de l’essai de fluorescence sont représenté dans la Figure 1. Le dosage est utilisé dans trois applications. En premier lieu, un certain nombre de variantes de l’ARNt pour incorporation de Lys(Boc) par la paire orthogonale Pyl est examiné. Lys(BOC) est un acide aminé stériquement semblable à Pyl. Pyl n’étant pas disponible dans le commerce, Lys(Boc) est couramment utilisé comme substrat standard pour la PylRS. Les ARNt filtré sont basées sur...

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

L’objectif global de ce protocole est d’améliorer le taux d’incorporation d’acides aminés non canoniques dans les cellules de mammifères afin de répondre à des questions biologiques dans des contextes de cellules vivantes, notamment la cartographie des surfaces d’interaction protéine-protéine et le marquage bioorthogonal des récepteurs de surface. En utilisant la suppression des codons ambrés, différents acides aminés non canoniques sont incorporés avec des efficacités différentes. Nous avons mis au point un test de fluorescence pour comparer facilement les taux d’incorporation d’acides aminés non canoniques dans les cellules de mammifères dans un court laps de temps.L’incorporation systématique d’acides aminés photo-réticulés et non canoniques à travers nos surfaces GPCR permet de cartographier les sites de liaison des ligands et fournit des informations précieuses sur le récepteur d’admission directement à partir de la cellule vitale. En incorporant des acides aminés non canoniques de dernière génération pour la chimie bioorthogonale, nous obtenons un marquage spécifique au site, super rapide et sans catalyseur des RCPG avec de petits fluorophores brillants pour des applications d’imagerie haut de gamme dans des cellules de mammifères vivants. Tout d’abord, ensemencez 600 000 cellules HEK 293 dans deux millilitres de milieu de croissance complet par puits dans deux plaques à six puits.Préparez autant de puits que le nombre d’échantillons et deux puits supplémentaires pour l’EGFP de type sauvage et un échantillon transfecté fictif respectivement. Une heure avant la transfection, ajouter la quantité appropriée de solution mère d’acides aminés non canoniques fraîchement préparée dans tous les puits pour une concentration finale d’acides aminés de 0,25 à 0,5 millimolaire. Pour transfecter les cellules, mélangez un microgramme d’ADN plasmidique et la paire d’ARN-t de la synthétase à tester avec un microgramme d’ADN plasmidique rapporteur dans un tube de microcentrifugation.Dans des tubes séparés, préparez une transfection identique en utilisant la référence de type sauvage EGFP et une transfection simulée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution saline tamponnée au lactate dans chaque tube contenant l’ADN. Après avoir brièvement mélangé, ajoutez six microlitres d’un microgramme par microlitre d’IPE et une solution saline tamponnée au lactate dans chaque tube.Agitez immédiatement, puis incubez à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Transférez 400 microlitres de milieu cellulaire de chaque puits dans le mélange d’ADN PEI pour neutraliser le pH. Ensuite, versez le mélange d’ADN sur les cellules.Récoltez les cellules 48 heures après la transfection en aspirant le milieu et en rinçant les cellules une fois avec deux millilitres de PBS préchauffé. Ajoutez 800 microlitres de PBS complété par 0,5 millimolaire d’EDTA et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, détachez et suspendez les cellules en pipetant de haut en bas.Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation contenant 200 microlitres de PBS complétés par cinq millimolaires de chlorure de magnésium. Centrifugez les échantillons pendant deux minutes à 800 fois la gravité. Lorsque vous avez terminé, jetez le surnageant.Maintenant, ajoutez 100 microlitres de tampon de trilyse aux granules cellulaires et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Pour faciliter la lyse, agitez le vortex toutes les cinq minutes. Faites tourner les débris de la cellule pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et 14 000 fois la gravité.Transférez 90 microlitres de surnageant dans des plaques noires à 96 puits. Ensuite, mesurez la fluorescence EGFP et mCherry à l’aide d’un lecteur de plaques équipé du module de fluorescence. Semez 500 000 293 lymphocytes T dans deux millilitres de milieu de croissance complet par puits dans deux plaques à six puits.Pour chaque position à cribler, préparez un puits par ligand, plus un puits pour le contrôle de liaison. Une heure avant la transfection, ajoutez le photo-réticulant, la p-azidophénylalanine, ou Azi, à tous les puits jusqu’à une concentration finale de 0,5 millimolaire. Transfectez une quantité totale de deux microgrammes d’ADN par puits en utilisant un microgramme de plasmide et codant pour le GPCR marqué par un drapeau portant un codon de marquage à la position souhaitée, et un microgramme du plasmide et codant pour la paire orthogonale dédiée à Azi.48 heures après la transfection, préparer une solution mère de ligand 1 000x en dissolvant le ligand peptidique à une concentration de 100 micromolaires dans du DMSO. Diluer la solution mère de ligand un à 1 000 dans un tampon de liaison. Remplacez le milieu cellulaire par un millilitre de solution de ligand et incubez les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante.Après l’incubation, irradiez les cellules pendant 20 minutes dans un réticulant UV à 365 nanomètres et à cinq centimètres de distance des cellules. Une fois terminé, détachez les cellules par pipetage et transférez-les dans un tube de microcentrifugation. Granulez les cellules pendant trois minutes à 800 fois la gravité.Après avoir jeté le surnageant, remettez les granules cellulaires en suspension dans 50 microlitres de tampon de dissociation HEPES, ou HDB, contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, congelez les cellules dans de l’azote liquide. Ensuite, décongelez les cellules dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 secondes, puis faites un bref vortex.Granulez les membranes pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et 2500 fois la gravité. Lorsque vous avez terminé, jetez le surnageant qui contient la majeure partie des protéines cytosoliques. Remettez soigneusement les granulés en suspension dans 50 microlitres de tampon de lyse HEPES à l’aide d’une pipette.Ensuite, lysez les cellules pendant 30 minutes sur de la glace, en tourbillonnant toutes les cinq minutes. Ensuite, faites tourner les débris cellulaires pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et 14 000 fois la gravité. Transférez immédiatement chaque surnageant dans un tube de réaction frais pour l’analyse par transfert Western.Lorsque le RCPG est glycosylé et que les bandes faibles ou frottées posent un problème dans l’analyse par transfert Western, déglycosylez les échantillons avec la PNGase F pour augmenter l’intensité du signal et affiner les bandes. Ensuite, résolvez les échantillons sur la page SDS standard et transférez les protéines par transfert sur une membrane PVDF. Après avoir bloqué la membrane, sondez-la avec un anticorps anti-ligand pour détecter l’apparition d’une réticulation.Pour détecter le niveau d’expression de l’Azi-GPCR, sondez la membrane avec un anticorps anti-drapeau commercial. Après avoir lavé la membrane, trempez-la dans une solution de chimiluminescence améliorée et visualisez les signaux dans l’obscurité. Grainez 100 000 cellules T HEK 293 dans 600 microlitres de DMEM complet sans colorant par puits d’une lame de microscopie équipée de quatre puits.Une heure avant la transfection, préparez une solution mère fraîche de 100 millimolaires de TCOK et d’hydroxyde de sodium à 0,2 molaire et de DMSO à 15 %. Mélangez trois microlitres de la solution mère TCOK avec 12 microlitres d’une molaire, pH 7,4 tampon HEPES. Ajoutez doucement la solution dans chaque puits pour une concentration finale de TCOK de 0,5 millimolaire.Dans un tube de microcentrifugation, diluez 200 nanogrammes du plasmide et codant pour le récepteur contenant le codon ambré et 200 nanogrammes du plasmide et codant pour la paire orthogonale dans 50 microlitres de milieu. Diluez 1,25 microlitre de lipofectamine 2 000 dans 50 microlitres de milieu sans colorant, sans sérum et sans antibiotique, et ajoutez la solution à la solution d’ADN. Agitez immédiatement et laissez incuber pendant cinq à 10 minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez les complexes lipidiques de l’ADN aux cellules. 24 heures après la transfection, transférez 100 microlitres de fluide de chaque puits dans un tube à réaction de 1,5 millilitre. Ajoutez 1,8 microlitre d’une solution mère de tétrazine de colorant fluorescent orange et 0,3 microlitre d’une solution mère de colorant de coloration de l’ADN.Transférez le milieu contenant les colorants dans le puits et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Aspirez le milieu et rincez doucement les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’excès de colorant. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de milieu de croissance préchauffé et complet sans colorant aux cellules.Maintenant, visualisez les récepteurs marqués sous un grossissement de 63x à l’aide de filtres appropriés pour le colorant fluorescent orange GFP et le colorant de coloration de l’ADN. Après avoir ajouté une solution mère d’agonistes peptidiques aux cellules, observez l’internalisation au microscope à l’aide des filtres susmentionnés et prenez des photos après l’apparition clairement détectable de l’internalisation. Différents ARNt donnent une efficacité de suppression différente, ce qui se reflète clairement dans la quantité de fluorescence mesurée.L’incorporation d’Azi dans CRF1R a été fortement améliorée lors de l’utilisation du gène Azi-tRNA synthétase optimisé pour les codons par rapport au gène natif, montrant que même une amélioration modérée pour une protéine soluble peut avoir un impact plus important sur le niveau d’expression des protéines membranaires plus difficiles. Le système optimisé pour l’incorporation d’Azi, y compris le gène humanisé E2 Azi RS, a été déployé pour cartographier la poche de liaison du CRF1R et pour trouver les voies de liaison de cinq ligands. Une bande de la bonne taille du produit de réticulation dans le western blot révèle que la position se trouve à proximité du ligand dans le complexe ligand-récepteur.De multiples coups de réticulation avec tous les ligands testés ont révélé des modèles de liaison distincts pour les agonistes et les antagonistes peptidiques. Les données de fluorescence et de western blot suggèrent que TCOK est l’acide aminé non canonique de la chimie bioorthogonale qui est incorporé avec la plus grande efficacité de la variante AF de l’ARNt synthétase paralysine. TCOK a été incorporé dans une protéine de fusion EGFP CRF1R et a permis l’installation d’un petit fluorophore brillant sur le récepteur.Après l’ajout d’un peptide Agaonist, des compartiments fluorescents ont été observés dans tout le cytosol, révélant le processus physiologique d’internalisation des RCPG. Pour faire un test de fluorescence, nous vous présentons ici un outil simple et efficace pour évaluer et optimiser l’efficacité d’une synthétase TI et API dans des cellules de mammifères. Des taux d’incorporation élevés sont cruciaux pour l’application d’acides aminés non canoniques à l’étude de questions biologiques difficiles.L’incorporation très efficace d’acides aminés non canoniques réticulés permet une cartographie de surface étendue de pratiquement toutes les protéines, y compris les récepteurs membranaires ou les protéines à bandes basses. La méthode révèle la topologie des interfaces d’interaction qui peuvent être analysées plus en détail pour obtenir des modèles moléculaires précis. L’efficacité d’incorporation élevée des acides aminés non canoniques de dernière génération pour la chimie bioorthogonale nous permet d’équiper les RCPG de petits fluorophores brillants, ouvrant ainsi la voie à l’étude de la dynamique structurale des RCPG dans les cellules vivantes via des techniques de microscopie avancées.

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En employant une résolution spectrale à deux photons système d'imagerie microscopique, au niveau des pixels des cartes de transfert de Förster Resonance Energy (FRET) efficacités sont obtenues pour des cellules exprimant des récepteurs membranaires hypothèse de former des homo-oligomères complexes. Depuis le FRET cartes d'efficacité, nous sommes en mesure d'estimer l'information sur le complexe stoechiométrique oligomère à l'étude.

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