Des cristaux de protéine croissante avec des Dimensions distinctes à l’aide d’automatisé cristallisation couplée avec In Situ diffusion dynamique de la lumière

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cristallisation des protéines, telles que le point temporel de la nucléation, le mécanisme de croissance des cristaux ou la préparation de nano/micro-cristaux, comme l’a étudié le Centre d’imagerie ultrarapide de Hambourg. Le principal avantage de cette technique est le suivi de l’évolution de l’échantillon en temps réel, permettant l’acquisition d’informations précieuses, telles que la distribution radiale des particules en solution à différents stades de cristallisation. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la micro-cristallisation des protéines, elle peut également être utilisée pour les protéines utilisées pour la cristallographie classique ou pour la croissance de gros cristaux de protéines à utiliser pour la diffraction des neutrons.

La démonstration visuelle de cette méthode est importante, car elle montre le principe de fonctionnement d’un dispositif de cristallisation unique. Pour commencer, filtrez 16 millilitres de solution de tartrate de sodium 1,2 molaire et 16 millilitres d’eau distillée, à l’aide d’un filtre à seringue stérile de 2 microns. Remplissez le précipitant et les bouteilles d’eau avec cinq millilitres de solutions filtrées.

Montez ensuite les bouteilles dans les porte-pompes de la chambre expérimentale. Dans la fenêtre du logiciel, configurez les paramètres expérimentaux avec une température de 20 degrés Celsius, une humidité relative de 20 et de l’eau comme solvant. Ouvrez la porte avant de la chambre d’expérimentation et retirez le support de lamelle.

Placez une lamelle propre et siliconée sur le support et remettez-la dans l’appareil. Fermez la chambre d’expérimentation pour garantir les conditions environnementales. Allumez la pompe zéro, en utilisant les principales caractéristiques de la pompe trouvées dans le protocole texte et créez un jet d’eau.

Ajustez le jet d’eau en orientant la position vers le centre de la lamelle en actionnant manuellement sa vis de réglage désignée. Éteignez la pompe zéro, puis allumez la pompe un et créez un flux de liquide, comme précédemment. Ajustez la position du jet de la pompe un vers la position fixée pour la pompe zéro.

Après avoir éteint la première pompe, remplacez la lamelle usagée par une nouvelle lamelle propre pour l’expérience de cristallisation. Créez un nouveau fichier expérimental à l’aide du progiciel. Dans le dossier expérimental, entrez la protéine Thaumatin, de Thaumatococcus daniellii ; la concentration en protéines est de 14 milligrammes par millilitre, celle du précipitant est celle du tartrate de sodium et celle du précipitant est de 1,2 molaire.

Après avoir chargé le nouveau fichier d’expérience pour activer ces informations, marquez la position sur la gouttelette de protéine en ajoutant une petite goutte d’eau, à l’aide de Pump Zero. Appuyez sur le bouton Tara' pour remettre la microbalance à zéro. Ouvrez le couvercle supérieur de la chambre expérimentale et pipetez 8 microlitres de solution de Thaumatin sur le point de repère de l’eau.

Pour enregistrer le nouveau drop de Thaumatin, cliquez d’abord sur le bouton New Drop' pour attribuer les conditions initiales du fichier expérimental. Cliquez ensuite sur le bouton Constant' pour compenser l’évaporation naturelle de l’eau de la gouttelette. Utilisez la caméra CCD pour vérifier si la pompe zéro vise la chute de protéines.

Réajustez la position de la pompe zéro si le jet d’eau vise l’extérieur de la goutte. Allumez le laser DLS et placez le faisceau laser dans la chute de protéines à l’aide des vis de réglage. Entrez les paramètres DLS avec une durée de mesure de 60 secondes, un temps d’attente entre deux mesures de 10 secondes et un nombre de mesures de 300.

Cliquez sur le bouton Start' pour lancer les mesures DLS. Vérifiez la qualité de l’échantillon en sélectionnant l’une des représentations graphiques DLS. Entrez les conditions de l’étape d’évaporation dans la table de planification, comme indiqué dans le protocole texte.

Activez ensuite l’étape d’évaporation de l’échantillon en cliquant sur le bouton Automatisation. Cliquez sur le bouton Stop' lorsque l’étape d’évaporation de l’échantillon est terminée. Activez le bouton constant pour maintenir le poids de la gouttelette constant.

Cette caractéristique compensera l’éventualité d’une évaporation naturelle de l’échantillon et garantira qu’aucun changement de concentration ne peut avoir lieu jusqu’à ce que d’autres mesures soient prises. Entrez ensuite les conditions de l’étape d’ajout précipité dans la table de planification, comme indiqué dans le protocole de texte. Activez l’étape d’ajout précipité en cliquant sur le bouton Automatisation.

Pour suivre l’évolution de la gouttelette de cristallisation au fil du temps, vérifiez l’apparence des cristaux de Thaumatine à l’aide de la caméra CCD. Vérifiez la distribution granulométrique à l’aide des représentations graphiques DLS. Vérifiez également l’évolution du poids et des paramètres expérimentaux à l’aide de la fenêtre d’affichage.

Toutes les informations affichées dans cette fenêtre sont calculées et affichées en temps réel, en fonction des changements de poids pendant la cristallisation, qui sont enregistrés en ligne par la balance ultrasensible. Enduisez une assiette Terasaki standard propre en ajoutant 3 millilitres d’huile de paraffine dans la plaque. Versez l’huile de paraffine sur les puits de la plaque en déplaçant doucement la plaque à différents angles afin que l’huile recouvre les 72 puits.

Retirez l’excès d’huile de paraffine en versant toute huile qui flotte sur la plaque. Cliquez sur le bouton Stop' pour terminer l’expérience de cristallisation. Retirez avec précaution le support d’échantillon contenant la gouttelette de cristallisation.

À l’aide d’une pipette, placez deux aloquots d’un microlitre de la goutte de cristallisation dans les puits de la plaque Terasaki. En récupérant la goutte de cristallisation dans une plaque sous huile, la stabilité de l’échantillon lors de la croissance cristalline peut être vérifiée périodiquement à l’aide d’un microscope ou d’autres techniques diolistes qui fonctionnent avec des plaques Terasaki. Voici une distribution de rayon montrant la croissance de la taille des particules dans la chute de la protéine pendant tout le processus de cristallisation, de la protéine monomère à la formation de noyaux, de nanocristaux et de micro-cristaux.

Ici, les graphiques représentent l’évolution dans le temps du poids de la gouttelette de protéine, ainsi que la concentration calculée en protéines et la concentration du précipitant. Voici une photographie enregistrée de microcristaux de thaumatine à la fin de l’expérience. La gouttelette montre une quantité très abondante de petits microcristaux saturés dans une solution protéique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure et 30 minutes, si elle est bien faite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important que vous ajustiez le laser DLS dans les systèmes de microdosage dans la gouttelette de protéine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler facilement ce dispositif de cristallisation afin de cristalliser avec succès un échantillon de protéines.

Cette méthode est possible grâce à la diffusion dynamique de la lumière in situ qui est directement couplée à la gouttelette de cristallisation. Cela nous permet de surveiller tous les changements dans la distribution du rayon et, par conséquent, nous pouvons identifier certains modèles de distribution de la cristallisation ou de la précipitation des protéines. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cryo-microscopie électronique ou la diffraction des électrons peuvent être appliquées pour répondre à des questions supplémentaires et pour vérifier l’état cristallin de particules de taille submicrométrique en solution.

Les implications de cette technique s’étendent à la théorie en deux étapes de la nucléation, car les cartes DLS montrent un modèle clair d’une distribution de deux tailles de particules en solution, qui sont antérieures à la croissance cristalline.