Un protocole pour laboratoire logement de Turquoise cyprinodonte (Nothobranchius furzeri)

L’objectif global de ce protocole est de réussir à élever une colonie de killi turquoise en laboratoire pour étudier le vieillissement et les maladies liées à l’âge de manière rapide et à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, par exemple si des mutations génétiques uniques ou des interventions environnementales peuvent moduler le processus de vieillissement chez les espèces de vertébrés. Le principal avantage de cette technique est qu’en suivant nos protocoles de base, plusieurs laboratoires peuvent maintenant réaliser des expériences avec des killifish turquoise.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’élevage du killifish présente des caractéristiques uniques. Par exemple, les embryons sont élevés sur un substrat sec avant l’éclosion, ce qui est très différent des modèles de poissons canoniques tels que le poisson-zèbre. Pour commencer, installez des bassins d’élevage de 9,5 litres chacun avec un mâle de cinq semaines et deux femelles de six à sept semaines.

Remplissez ensuite un récipient en plastique avec du sable autoclavé d’environ deux à trois centimètres de profondeur et placez le bac à sable au centre du réservoir d’élevage. Laissez le killifish turquoise se reproduire en continu et récoltez les embryons une fois par semaine pour l’incubation des embryons. Pour récolter des embryons au stade cellulaire à utiliser pour l’injection et la génération de lignées transgéniques, installez un réservoir d’élevage avec un poisson mâle et deux poissons femelles, comme nous venons de le démontrer.

Deux jours avant le prélèvement des embryons, transférez le mâle dans un réservoir individuel et maintenez-le en contact visuel avec les femelles adultes. Le jour de la collecte, ajoutez le mâle et un bac à sable dans le bassin d’élevage et laissez les poissons frayer pendant deux heures. Après avoir fait apparaître et retiré le bac à sable du réservoir, videz le bac à sable dans une passoire et utilisez l’eau du système pour le rincer.

Ensuite, immergez partiellement la passoire dans l’eau du système et faites-la tourner doucement pour que les embryons se regroupent au centre. À l’aide d’une pipette Pasteur de deux millilitres, prélevez les embryons et transférez-les dans une boîte de Pétri de 90 millimètres avec environ 40 millilitres d’eau du système. À l’aide d’un microscope optique, inspectez les embryons dans la boîte de Pétri et retirez ceux qui présentent une rupture du châtion et des signes de dommages.

Après avoir blanchi les embryons conformément au protocole textuel, inspectez et retirez tous les embryons morts qui seraient tachés de bleu. Une fois que les embryons ont été laissés incuber dans une solution fraîche de bleu de méthylène, vérifiez que les embryons développés ont des yeux noirs visibles. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur jetable ou d’une pince à épiler fine et incurvée, transférez les embryons sur une assiette en papier filtre.

Conservez tous les embryons non développés dans du bleu de méthylène et surveillez-les quotidiennement. Une fois que les yeux noirs se sont développés, transférez-les dans un substrat solide. À l’aide d’une pince, espacez les embryons d’environ cinq millimètres jusqu’à 100 embryons par plaque de 90 millimètres.

Ensuite, utilisez de la paraffine pour sceller la boîte et incubez les embryons à 28 degrés Celsius pendant deux à trois semaines jusqu’à ce qu’ils aient complètement développé des iris dorés et soient prêts à éclore. Pour un stockage à long terme jusqu’à un an, après une incubation dans une solution de bleu de méthylène pendant trois jours, transférez les embryons sur des plaques de substrat solide comme nous venons de le démontrer et incuberez-les à 17 degrés Celsius. Pour faire éclore les poissons, utilisez une pince à épiler fine et incurvée pour transférer soigneusement 50 à 100 embryons développés dans la boîte d’éclosion et immergez-les complètement dans une solution d’acide humique ne dépassant pas deux centimètres de profondeur à quatre degrés Celsius.

Une étape essentielle de ce protocole est l’éclosion des embryons de fondules, ce qui est réalisé en transférant les embryons incubés sur un substrat sec dans une solution d’éclosion contenant de l’acide humique pourvue d’une aération suffisante. Couvrez la boîte d’éclosion avec un couvercle et incubez-la à 28 degrés Celsius dans un incubateur d’éclosion. Pour fournir une aération suffisante, connectez le boîtier à une alimentation en air avec un tube.

Pour maintenir une qualité d’eau adéquate dans la boîte d’éclosion, une fois par jour à partir du lendemain de l’éclosion, remplissez la boîte avec un rapport de un pour un d’eau du système autoclave en maintenant une profondeur finale de deux centimètres. Transférez tous les embryons non éclos dans le substrat solide et essayez d’éclore une semaine plus tard. Pour élever des poissons juvéniles et adultes cinq jours après l’éclosion, déplacez les juvéniles vers le système de recirculation de l’eau à l’aide de pipettes en plastique jetables ou d’une cuillère en plastique pour transférer soigneusement cinq juvéniles par réservoir de 0,8 litre équipé d’un tamis à alevins de 400 micromètres.

À l’âge de 14 jours, transférez les poissons juvéniles dans un réservoir de 2,8 litres équipé d’un tamis à alevins de 850 micromètres. À partir de ce moment, étiquetez chaque aquarium avec un identifiant de poisson.Pour les tests de survie, hébergez individuellement chaque poisson dans un seul réservoir. Les poissons élevés pour des tests de survie sont également logés individuellement dans un réservoir de 2,8 litres.

Pendant les sept jours suivants, nourrissez les juvéniles deux fois par jour avec cinq millilitres d’artémias complétés par un à trois vers de sang vivants. À l’âge de quatre semaines, nourrissez chaque poisson deux fois par jour avec des artémias et un millilitre de vers de sang. À ce stade, assurez-vous que le poisson atteint sa maturation sexuelle complète en vérifiant la présence de grandes nageoires dorsales, anales et caudales avec des signes de coloration chez les mâles et des abdomens ronds remplis d’œufs chez les femelles.

Voici une courbe de survie représentative de 70 killifish turquoise mâles. Un bon élevage entraîne une survie médiane allant de 12 à 28 semaines dans la souche GRZ. Les variations de la survie médiane dépendent du régime alimentaire, de la fréquence des repas et des conditions de température du logement.

La courbe de survie des poissons élevés dans des conditions d’élevage médiocres révèle une augmentation de la mortalité précoce et des baisses soudaines répétées de la survie au fil du temps par rapport aux poissons élevés dans des conditions d’élevage optimales. Tout en suivant ce protocole, il est important de surveiller de près l’état de l’eau et l’excès de nourriture des alevins fraîchement éclos, car il est essentiel qu’ils soient conservés dans un environnement propre. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les manipulations expérimentales chez le killifish turquoise, notamment la transgenèse, l’édition du génome et les manipulations alimentaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élever avec succès le killifish turquoise en laboratoire et d’utiliser ce modèle pour explorer la biologie du vieillissement chez le vertébré à la durée de vie la plus courte qui peut être élevé en captivité.