Name: Un protocole pour laboratoire logement de Turquoise cyprinodonte (Nothobranchius furzeri) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez un protocole d'élevage du killifish turquoise Nothobranchius furzeri pour étudier le vieillissement. Cette méthode standardisée permet des recherches à haut débit sur les maladies liées à l'âge.

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Nous remercions Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar et tous les membres du laboratoire Valenzano à l’Institut Max Planck pour la biologie du vieillissement pour contribuer aux différents aspects le protocole actuel de l’élevage barrés au fil des ans.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

Tous les auteurs déclarent sans intérêts financiers et non financiers concurrents.

Les auteurs décrivent un protocole d’élevage de laboratoire de killifish turquoise, y compris la collecte des embryons, incubation, ainsi que logement poissons adultes, d’élevage et d’alimentation. Notre protocole est expressément conçu pour les laboratoires qui effectuent la recherche axée sur les poissons adultes, en particulier dans les études expérimentales sur le vieillissement et la durée de vie. Fondule barré turquoise peut être déclenché sur une installation standard de poisson-zèbre ; Cependant, des aspects importants de ressources pétrolières barrés diffèrent du poisson-zèbre standard soins16. Ces rajustements comprennent la transition précoce d’un seul régime d’artémia à un régime additionné de ver de sang riche en protéines, mais aussi des mesures concrètes d’incubation de l’embryon, consistant en une étape d’incubation liquides et solides.
Étapes critiques au sein du protocole comprennent des embryons expédition 8-30 ° C plage de températures. En cas de reproduction, fécondité dépend de l’alimentation fréquence et qualité des aliments ; par conséquent, nous recommandons au moins deux tétées par jour et par reproduction de réservoir pour augmenter le rendement des embryons (voir la section 5.6.). Au cours de l’embryon de blanchiment, ne s’étendent pas d’incubation embryon dans la solution de blanchiment. Cela peut endommager le chorion de l’oeuf et la mortalité des embryons accrue. Lors de l’incubation des embryons avec le bleu de méthylène, ne pas prolonger l’incubation des embryons de prêt-à-trappe pendant plus de 2 semaines que leur viabilité sera considérablement réduite. À couver turquoise barrés, basse température de la solution acide humique améliore l’éclosion et immersion complète des embryons dans la solution permet de synchronisé à couver. Aération insuffisante durant les résultats de l’incubation des taux élevés d’alevins pas en mesure de remplir la vessie natatoire (phénotype « ventre-slider », voir les notes relatives à la section 5.1).
Limitation du protocole pour la reproduction comprend l’utilisation du substrat sable quels défis de poses à filtration systèmes centralisés et devraient être remplacés par des méthodes alternatives à l’avenir. Des solutions de rechange possibles pourraient être l’utilisation du poisson-zèbre, réservoirs de reproduction. Embryon de blanchiment pourrait provoquer des changements physiques et chimiques majeurs dans le chorion de l’oeuf qui pourrait résulter en physiologie chorion altérée et le succès de l’éclosion. L’exposition constante des embryons au bleu de méthylène peut induire des changements à long terme dans la physiologie des poissons adultes. Élevage de poissons adultes dans les réservoirs individuels pour les études de cohortes de survie peut affecter négativement la comportement du poisson et la santé. Logement de groupe pour les études de cohortes de survie ajoute cependant, des facteurs de confusion importantes due à l’établissement de la domination sociale et territoires mâles, conduisant à des hiérarchies sociales strictes. Par conséquent, nous jugeons que l’isolement des poissons mâles pour des études de survie constitue un compromis raisonnable. Alimentation laboratoire barrés colonies avec des aliments vivants provenant de sources non contrôlées ajoute un risque de contamination externe des parasites et des communautés microbiennes potentiellement pathogènes. À l’avenir, une alimentation de type poisson stérile ad hoc devrait être développée.
Les améliorations futures à ce protocole mettra l’accent sur une alimentation contrôlée, non vivants, qui mène toujours à achever la maturation sexuelle dans 3-4 semaines. En résumé, notre protocole offre l’accessibilité aux barrés turquoise laboratoire mise en culture d’une communauté scientifique.

Compte tenu de leur courte durée de vie et le cycle de vie rapide, barrés turquoises croissent rapidement comme un prometteur nouvel organisme modèle en biologie1,2,3. Cette espèce se caractérise par un cycle de vie unique pour un téléostéen, consistant en diapause embryonnaire, la maturation sexuelle rapide et une longue durée de vie post-reproductive Etape4,5. Des travaux récents ont contribué à élucider la biologie de cette espèce en captivité et en les sauvages6,7. Turquoises barrés vivent dans des plans d’eau douce saisonniers qui se forment pendant la saison des pluies dans la savane africaine au Zimbabwe et au Mozambique. Pendant la saison sèche, les embryons survivent dans la boue sèche en l’absence d’eau en vertu d’un stade de résistance au stress de la vie appelé la diapause.
Les cartes génétiques de cette espèce ont été généré8,9, et récemment leur génome a été séquencé et monté de10,11. Plusieurs souches de poissons de laboratoire consanguines ont été développés, et la transgénèse et génome édition via CRISPR/Cas9 sont apparues chez cette espèce, qui fait promotion turquoise fondule barré comme un organisme modèle vertébrés de laboratoire concurrentiel 12,13,14.
Même si un protocole de laboratoire a déjà été publié pour cette espèce15, dans le présent protocole, nous développons une liste exhaustive des directives du laboratoire expérimental qui visent spécifiquement les études qui examinent le vieillissement et la survie. Le présent protocole permet aux chercheurs déjà familiers avec l’élevage de poisson-zèbre et chez les sujets exposés à devenir versé dans l’élevage turquoise barrés en adoptant un certain nombre d’ajustements clés. Dans le même temps, ce protocole prévoit des chercheurs sans expérience préalable dans l’élevage de poissons avec les outils essentiels pour élever une colonie prospère de turquoise barrés.

<table><tbody><tr><td>Solution tampon d’étalonnage de sonde pH = 7,0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>Solution tampon 1L pH = 7,0 pour étalonner le système d’eau pH-électrode Solution tampon</td></tr><tr><td>d’étalonnage de sonde pH = 4,0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>Solution tampon 1L pH = 4,0 pour étalonner le système d’eau pH-électrode</td></tr><tr><td>Étalon de conductivité</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL Étalon de conductivité 1 413 uS/cm pour étalonner le système d’eau électrode de conductivité</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>Bandelettes de test pour la détermination des valeurs de chlore de l’eau du système Test d’ammoniac</td></tr><tr><td></td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>Test pour déterminer la teneur en ammoniac de l’eau du système</td></tr><tr><td>Sel de la mer Rouge Mer</td><td>Rouge</td><td></td><td>22 kg seau de 22 kg</td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>Acide humique</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>Nouveau HUFA Enrichissement Artemia</td><td>ZM Systems UK Bouteille de</td><td></td><td>75g</td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30 % (w/w)</td></tr><tr><td>Fibre de coco</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>GE healthcare</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol pur</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100 %</td></tr> <tr><td>sable de silice</td><td>animalerie locale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia Eggs Premium Grade</td><td>Sanders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ver de vase</td><td>distributeur</td><td></td> local <td>Poseidon Aquakultur Allemagne</td></tr><tr><td>dNTPs solution mix</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq ADN polymérase</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/uL</td></tr><tr><td>PCR 10x Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8.0 solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37 %</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Aquariums</td><td>Volume d’aquaérisation</td><td></td><td>: 0,8 L, 2,8 L, 9,5 L ; équipé de déflecteurs, de mailles d’alevinage et de couvercles</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>modèle 5000</td></tr><tr><td>Incubateur microbiologique</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>modèle IMC18 ; pour le stockage des embryons en phase liquide, réglé à t=27-28&deg ; C</td></tr><tr><td>Incubateur réfrigérant</td><td></td><td>9020-0209</td><td>modèle KT115 ; pour le stockage des embryons en phase solide, réglé à t=27-28&deg ; C</td></tr><tr><td>Incubateur d’éclosion</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>modèle OGS180 ; pour l’éclosion des embryons, réglé à t=27-28&deg ; C</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td></td><td>modèle M80</td></tr><tr><td>Sable d’élevage/boîtes d’éclosion</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur jetable en plastique</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2 ml ; Pour l’alimentation des poissons avec des vers de vase, ou la sélection d’embryons, coupez l’extrémité pour ouvrir 3-4mm de diamètre</td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50mL</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>Passoire</td><td></td><td></td> en métal <td>finesse < 1 millimètre ; pour la collecte d’embryons</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>type5/45 ; pour transfert d’embryons</td></tr><tr><td>25 L Éclosoir d’artémias</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>Éclosoir principal</td></tr><tr><td>500 mL Éclosoir d’artémias</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>modèle Artemio 1 ; éclosoir de secours</td></tr><tr><td>Filets à poissons à mailles étroites</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bécher à sable</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000mL</td></tr><tr><td>Bécher de séparation des crevettes de saumure</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>Sac en plastique à fermeture éclair</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>pour le stockage des poissons morts</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>modèle Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’air</td><td></td><td>www.zajac.de AQ380</td><td>4-6 mm diamètre</td></tr><tr><td>1 L Bouteille en verre</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L Bouteille en verre</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Bouteille compressible</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>pour l’alimentation des poissons avec des artémias</td></tr><tr><td>120-&#956 ; passoire pour artémias Florida</td><td>Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>pour la collection d’artémias / vers de vase</td></tr><tr><td>Finition chaussettes filtrantes</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956 ; m</td></tr><tr>Système <td></td><td></td><td>de filtration centrale pour poissons</td><td>Aquaneering, Techniplast, Habitats aquatiques, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

un protocole pour laboratoire logement de turquoise cyprinodonte (nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

Le développement de pratiques d’élevage en laboratoire non-modèle poissons utilisés à des fins expérimentales a grandement bénéficié de la mise en place des poissons de référence systèmes modèles, comme le poisson-zèbre et chez les sujets exposés. Ces dernières années, un poisson émergent – le cyprinodonte turquoise (Nothobranchius furzeri) – a été adopté par un nombre croissant de groupes de recherche dans les domaines de la biologie du vieillissement et de l’écologie. Avec une durée de vie en captivité de 4 à 8 mois, cette espèce est le vertébré microcebu élevé en captivité et permet à la communauté scientifique d’essai – en peu de temps – interventions expérimentales qui peuvent entraîner des modifications du rythme de vieillissement et l’espérance de vie. Compte tenu de la biologie particulière de cette espèce, caractérisée par la diapause embryonnaire, la maturation sexuelle explosive, marquée morphologique et comportemental dimorphisme sexuel - et leur durée de vie adulte relativement courte - spécial élevage pratiques soient urgents demande. Ce protocole indique un ensemble de mesures clés de l’élevage qui permettent aux barrés turquoise optimale soins de laboratoire, permettant à la communauté scientifique à adopter cette espèce comme un modèle animal de laboratoire puissant.

Bon élevage des barrés turquoise se traduit par survie médiane allant de 12 à 18 semaines chez la souche GRZ (par exemple la Figure 4 a). Variations de la durée médiane de survie dépendent diet, fréquence des repas et logement à des conditions de température. Résultats élevage pauvres en présentant des courbes de survie ont augmenté la mortalité précoce et répétitifs, brusques gouttes de survie pendant toute période, caractérisée par plusieurs points d’inflexion (Figure 4 b).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> Figure 1 : des stades de développement embryonnaires représentatifs avec substrat respectifs d’incubation. (A) fraîchement recueillies des embryons, incubés dans une solution de bleu de méthylène dans l’incubateur à 28 ° C. (B) les embryons prêts à être transférés sur milieu solide, filtre soit fibre de papier ou de la noix de coco. (C) embryons prêts à hachurer, affichage typiques Iris dorés. La barre d’échelle est égale à 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> Figure 2 : étapes de turquoise barrés développement après l’éclosion. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> Figure 3 : étiquette d’identification de poisson représentatif pour le poisson dès phase 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> Figure 4 : courbe de survie représentatif pour 70 cyprinodonte turquoise mâle. (A) courbe de survie typique pour cyprinodonte turquoise élevés en laboratoire. (B) une comparaison des courbes de survie provenant de poissons élevés dans des conditions optimales d’élevage (noir) et de l’élevage pauvre (rouge et bleu). La ligne horizontale rouge pointillée indique 50 % de survie, courbe de survie qui se croisent à la longévité médiane (indiquée sur l’axe des abscisses). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Primer avant</td>
			<td colspan="2">Inverser l’apprêt</td>
			<td>Classe de grandeur (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">* - des marqueurs de détermination du sexe</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Les amorces de génotypage pour l’identification de la souche.

Logement de laboratoire de turquoise barrés peuvent être transposés à la maison et de sensibiliser efficacement des milliers de poissons dans un système de filtration d’eau centralisée, utilisant la même infrastructure utilisée pour les installations standard de poisson-zèbre. Ici, nous détaillons une liste de procédures normalisées qui permettent aux barrés efficace entretien.

Un protocole pour laboratoire logement de Turquoise cyprinodonte (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

L’objectif global de ce protocole est de réussir à élever une colonie de killi turquoise en laboratoire pour étudier le vieillissement et les maladies liées à l’âge de manière rapide et à haut débit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du vieillissement, par exemple si des mutations génétiques uniques ou des interventions environnementales peuvent moduler le processus de vieillissement chez les espèces de vertébrés. Le principal avantage de cette technique est qu’en suivant nos protocoles de base, plusieurs laboratoires peuvent maintenant réaliser des expériences avec des killifish turquoise.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’élevage du killifish présente des caractéristiques uniques. Par exemple, les embryons sont élevés sur un substrat sec avant l’éclosion, ce qui est très différent des modèles de poissons canoniques tels que le poisson-zèbre. Pour commencer, installez des bassins d’élevage de 9,5 litres chacun avec un mâle de cinq semaines et deux femelles de six à sept semaines.Remplissez ensuite un récipient en plastique avec du sable autoclavé d’environ deux à trois centimètres de profondeur et placez le bac à sable au centre du réservoir d’élevage. Laissez le killifish turquoise se reproduire en continu et récoltez les embryons une fois par semaine pour l’incubation des embryons. Pour récolter des embryons au stade cellulaire à utiliser pour l’injection et la génération de lignées transgéniques, installez un réservoir d’élevage avec un poisson mâle et deux poissons femelles, comme nous venons de le démontrer.Deux jours avant le prélèvement des embryons, transférez le mâle dans un réservoir individuel et maintenez-le en contact visuel avec les femelles adultes. Le jour de la collecte, ajoutez le mâle et un bac à sable dans le bassin d’élevage et laissez les poissons frayer pendant deux heures. Après avoir fait apparaître et retiré le bac à sable du réservoir, videz le bac à sable dans une passoire et utilisez l’eau du système pour le rincer.Ensuite, immergez partiellement la passoire dans l’eau du système et faites-la tourner doucement pour que les embryons se regroupent au centre. À l’aide d’une pipette Pasteur de deux millilitres, prélevez les embryons et transférez-les dans une boîte de Pétri de 90 millimètres avec environ 40 millilitres d’eau du système. À l’aide d’un microscope optique, inspectez les embryons dans la boîte de Pétri et retirez ceux qui présentent une rupture du châtion et des signes de dommages.Après avoir blanchi les embryons conformément au protocole textuel, inspectez et retirez tous les embryons morts qui seraient tachés de bleu. Une fois que les embryons ont été laissés incuber dans une solution fraîche de bleu de méthylène, vérifiez que les embryons développés ont des yeux noirs visibles. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur jetable ou d’une pince à épiler fine et incurvée, transférez les embryons sur une assiette en papier filtre.Conservez tous les embryons non développés dans du bleu de méthylène et surveillez-les quotidiennement. Une fois que les yeux noirs se sont développés, transférez-les dans un substrat solide. À l’aide d’une pince, espacez les embryons d’environ cinq millimètres jusqu’à 100 embryons par plaque de 90 millimètres.Ensuite, utilisez de la paraffine pour sceller la boîte et incubez les embryons à 28 degrés Celsius pendant deux à trois semaines jusqu’à ce qu’ils aient complètement développé des iris dorés et soient prêts à éclore. Pour un stockage à long terme jusqu’à un an, après une incubation dans une solution de bleu de méthylène pendant trois jours, transférez les embryons sur des plaques de substrat solide comme nous venons de le démontrer et incuberez-les à 17 degrés Celsius. Pour faire éclore les poissons, utilisez une pince à épiler fine et incurvée pour transférer soigneusement 50 à 100 embryons développés dans la boîte d’éclosion et immergez-les complètement dans une solution d’acide humique ne dépassant pas deux centimètres de profondeur à quatre degrés Celsius.Une étape essentielle de ce protocole est l’éclosion des embryons de fondules, ce qui est réalisé en transférant les embryons incubés sur un substrat sec dans une solution d’éclosion contenant de l’acide humique pourvue d’une aération suffisante. Couvrez la boîte d’éclosion avec un couvercle et incubez-la à 28 degrés Celsius dans un incubateur d’éclosion. Pour fournir une aération suffisante, connectez le boîtier à une alimentation en air avec un tube.Pour maintenir une qualité d’eau adéquate dans la boîte d’éclosion, une fois par jour à partir du lendemain de l’éclosion, remplissez la boîte avec un rapport de un pour un d’eau du système autoclave en maintenant une profondeur finale de deux centimètres. Transférez tous les embryons non éclos dans le substrat solide et essayez d’éclore une semaine plus tard. Pour élever des poissons juvéniles et adultes cinq jours après l’éclosion, déplacez les juvéniles vers le système de recirculation de l’eau à l’aide de pipettes en plastique jetables ou d’une cuillère en plastique pour transférer soigneusement cinq juvéniles par réservoir de 0,8 litre équipé d’un tamis à alevins de 400 micromètres.À l’âge de 14 jours, transférez les poissons juvéniles dans un réservoir de 2,8 litres équipé d’un tamis à alevins de 850 micromètres. À partir de ce moment, étiquetez chaque aquarium avec un identifiant de poisson.Pour les tests de survie, hébergez individuellement chaque poisson dans un seul réservoir. Les poissons élevés pour des tests de survie sont également logés individuellement dans un réservoir de 2,8 litres.Pendant les sept jours suivants, nourrissez les juvéniles deux fois par jour avec cinq millilitres d’artémias complétés par un à trois vers de sang vivants. À l’âge de quatre semaines, nourrissez chaque poisson deux fois par jour avec des artémias et un millilitre de vers de sang. À ce stade, assurez-vous que le poisson atteint sa maturation sexuelle complète en vérifiant la présence de grandes nageoires dorsales, anales et caudales avec des signes de coloration chez les mâles et des abdomens ronds remplis d’œufs chez les femelles.Voici une courbe de survie représentative de 70 killifish turquoise mâles. Un bon élevage entraîne une survie médiane allant de 12 à 28 semaines dans la souche GRZ. Les variations de la survie médiane dépendent du régime alimentaire, de la fréquence des repas et des conditions de température du logement.La courbe de survie des poissons élevés dans des conditions d’élevage médiocres révèle une augmentation de la mortalité précoce et des baisses soudaines répétées de la survie au fil du temps par rapport aux poissons élevés dans des conditions d’élevage optimales. Tout en suivant ce protocole, il est important de surveiller de près l’état de l’eau et l’excès de nourriture des alevins fraîchement éclos, car il est essentiel qu’ils soient conservés dans un environnement propre. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les manipulations expérimentales chez le killifish turquoise, notamment la transgenèse, l’édition du génome et les manipulations alimentaires.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élever avec succès le killifish turquoise en laboratoire et d’utiliser ce modèle pour explorer la biologie du vieillissement chez le vertébré à la durée de vie la plus courte qui peut être élevé en captivité.

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Biology

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