Name: Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Découvrez l'extraction des hémocytes de larves de Drosophila melanogaster pour visualiser l'invasion microbienne en 3D. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires in vivo et ex vivo par microscopie confocale.

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Nous sommes reconnaissants à m. Robert Heinzen pour fournir des stocks d’exprimant le mCherry Coxiella burnetii. Nous remercions le Dr Luis Teixeira prévoyant la fourniture stocks de mouche de virus iridescent d’invertébrés 6 et le centre de Stock de Bloomington. Ce projet a été financé en partie par les NIH grant R00 AI106963 (à A.G.G.) et de la Washington State University.

1. ex vivo de l’infection
<ol><li>Moyens et équipements<ol>
<li>Dans des conditions stériles, préparer fraîches Drosophila hémocytes isolant moyen (DHIM) contenant de 75 % Schneider Drosophila moyen avec 25 % sérum bovin fœtal (SVF) et filtre à stérilisent.</li>
		<li>Couche 2-3 morceaux de pellicule de paraffine de 10 cm x 10 cm sous un stéréomicroscope.</li>
		<li>Préparer le capillaire de verre. Régler le chauffage extracteur capillaire à 55 % du maximum. Tirez le tube capillaire d’une pointe acérée d’environ 10 µm.</li>
		<li>Remblayer le capillaire à l’huile minérale.</li>
		<li>Assembler le tube capillaire rempli sur la nanoinjector (Figure 1A), puis ouvrez le bout de tube capillaire fusionnés en brisant l’extrémité avec une pince (Figure 1B). Le diamètre extérieur de la pointe devrait être de 100 µm pour une absorption facile des hémocytes.</li>
		<li>Éjecter autant de pétrole que possible de l’extrémité du tube capillaire, puis remplir avec Simon. Pour faciliter la visualisation de la frontière de l’hémolymphe aspiré vers le haut et l’huile, inclure une bulle d’air entre le pétrole et le DHIM (Figure 1B").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraction de l’hémolymphe<ol>
<li>Choisissez 3rd stades de larves de drosophile par l’intérieur mur d’aliments fioles délicatement à l’aide de pinces et rangez-les dans un filtre à 100 µm (Figure 1C). 3rd stade larvaire se trouvent 3-6 jours après la ponte fertile par une femelle adulte. Remarque : Ces expériences utilisé le génotype, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= SAMU-2xEGFP} AH2, puisque les hémocytes provenant de ces animaux expriment la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) pour faciliter l’identification des cellules au microscope.</li>
		<li>Verser 5 mL d’eau stérile sur les larves et agiter la passoire pendant 5 s. Place la crépine sur la lingette spéciale enlever l’excès d’eau (Figure 1C').</li>
		<li>Transférer les larves dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Les anesthésier avec CO2 gaz pendant 5 s (Figure 1D).</li>
		<li>Placez les larves sur la pellicule de paraffine sous le stéréomicroscope, face dorsale-vers le haut (Figure 2A).</li>
		<li>Lieu le verre capillaire légèrement sur le corps postérieur larvaire de maintenir en place et de perturber la cuticule postérieure ouvert à l’aide de fines pinces pointues (Figure 2B).</li>
		<li>Permettre l’hémolymphe s’écouler sur le film de paraffine (Figure 2C).</li>
		<li>Faire un bassin de l’hémolymphe, y compris les hémocytes de 20-50 larves à la fois sur le film de paraffine.</li>
		<li>Prenez hémolymphe regroupée en utilisant le verre capillaire sur le nanoinjector (Figure 2D). Remarque : Il devrait y avoir environ 10-20 µL de l’hémolymphe.</li>
		<li>Éjectez l’hémolymphe dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 500 µL de DHIM (Figure 2E).</li>
		<li>Répétez les étapes 1.2.4) - 1.2.9) pour chaque lot de larves.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dénombrer les hémocytes.<ol>
<li>Pipetter 5 µL de solution de bleu de Trypan 0,4 % dans un tube de microcentrifuge de 0,6 mL de colorer les cellules mortes. Doucement, mélanger la DHIM et les hémocytes dans le tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et transférer 5 µL de DHIM y compris les hémocytes dans le tube de microcentrifuge de 0,6 mL et mélanger doucement.</li>
		<li>Dans l’hémocytomètre, déposer 10µl de cellules à partir du mélange de bleu : hémocytes Trypan 1:1.</li>
		<li>Dénombrer les hémocytes vivants qui ne sont pas souillées avec Trypan blue dans chacun des domaines 4 coin de la hemocytomter et de calculer la concentration des hémocytes par millilitre, à l’aide de la formule : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> où X est la concentration de hemocytes direct par millilitre ; a, b, c et d sont le nombre de cellules vivantes (tel que déterminé par le bleu Trypan exclusion) dans chaque 4 des champs compté dans l’hémocytomètre. Division par 2 du nombre total de cellules comptées est due à la dilution de 1:1 des cellules avec le bleu Trypan. Les cellules colorées au Trypan bleus sont considérés comme morts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex vivo Infections<ol>
<li>Déterminer le nombre de puits pour l’ensemencement avec cellules basées sur des intervalles et biologiques réplique nécessaire pour chaque expérience. 5,0 × 104 hémocytes sont souhaitables pour la purification d’ARN et de protéine après l’infection.</li>
		<li>Calculer le volume de stock pathogène à diluer avec Simon pour l’infection à l’aide de la formule suivante : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> où la multiplicité d’infection (MOI) est le nombre de virus ou bactéries désiré par cellule. Remarque : MOI utilisé dépend de l’expérience individuelle et les analyses exécutées. Ici, 10 génomes (GE) / c. burnetii, 10 UFC/cellule de Listeriaou 1 TCID50virus de IIV6 a été utilisé.</li>
		<li>Préparer 500 µL de milieu pathogène pour chaque puits d’une plaque 24 puits en ajoutant le volume approprié de DHIM au volume viral ou bactériens dans un tube.</li>
		<li>Place un 12 mm ronde couvercle en verre (épaisseur n ° 1) dans un puits d’une plaque 24 puits.</li>
		<li>Diviser la DHIM y compris les hémocytes dans des puits d’une plaque 24 puits.</li>
		<li>Ajouter 500 µL de milieu pathogène à hémocytes dans un puits.</li>
		<li>Centrifuger la plaque à 1 000 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Incuber la plaque pendant 1 h à 28 ° C. Toutes les 15 min, incliner délicatement la plaque de l’arrière à l’avant, puis de gauche à droite pour 5 s à la main.</li>
		<li>Après 1 h d’étape de l’invasion/pièces jointes 1.4.8), doucement Pipetter hors milieu pathogène laver les hémocytes avec DHIM fraîche et remplissez-le avec 500 µL de DHIM fraîche.</li>
		<li>Incuber les hémocytes infectés pendant le temps désiré. Dans ces expériences, c. burnetii- ou hémocytes IIV6-infectés sont incubées pendant 24h et Listeria-hémocytes infectés sont incubés pendant 1, 2 ou 4 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. in vivo de l’infection
<ol><li>Infection<ol>
<li>Chaud, la plaque de gélose de jus de fruit drosophile à température ambiante pendant 15 min. plaques sont faites comme précédemment décrit20.<ol>
<li>Ajouter 30 g d’agar dans 700 mL d’eau et stériliser pendant 40 min.</li>
			<li>Dissoudre 0,5 g de méthyl paraben dans 10 mL d’éthanol absolu.</li>
			<li>Ajouter la solution de méthyl paraben à 300 mL de concentré de jus de fruits.</li>
			<li>Mélanger le concentré de jus dans la solution d’agar autoclavé et diluer 5 mL dans 10 × 35 mm Pétri rapidement.</li>
			<li>Une fois que les plaques ont refroidi pendant 15 min, les stocker à 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer des larves de stade 3rd suivant étapes 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Placer la pâte de levure sur une gélose. Faites une coupe fine dans la gélose où les larves peuvent migrer pour éviter le séchage (Figure 3A). Assembler une aiguille de pointes de tungstène de 0,001 mm avec holding pince à l’aide de paraffine film (Figure 3B, C).</li>
		<li>Distribuer 50 µL de haut-titre mCherry exprimant -c. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) sur la paraffine du film sous le microscope stéréo et placer les larves dans le pool des bactéries.</li>
		<li>Placer les larves dans le pool des bactéries. Piquer les larves avec une aiguille de tungstène (Figure 3D). Transférer les larves sur une gélose (Figure 3E).</li>
		<li>Transférer le milieu pathogène restants sur la gélose et sceller la plaque avec le film de paraffine.</li>
		<li>Garder les larves sur la plaque dans l’air humide jusqu'à ce que l’infection après heure désirée (Figure 3-F). Dans cette expérience, c. burnetii-larves infectées sont sur la plaque pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraction de l’hémolymphe et électrodéposition d’hémocytes<ol>
<li>Préparer le support et l’équipement suivant étape 1.1).</li>
		<li>Place un 12 mm ronde couvercle en verre (épaisseur n ° 1) dans un puits d’une plaque 24 puits. Pipeter 500 µL de Simon dans le puits.</li>
		<li>Extrait l’hémolymphe des larves infectées suivant étapes 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>L’hémolymphe d’éjection dans la suite bien étape 2.2.2).</li>
		<li>2.2.3 le répète) et 2.2.4) pour plusieurs lots de larves.</li>
		<li>Centrifuger la plaque à 1 000 x g pendant 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. visualisation
<ol><li>Fixation et coloration<ol>
<li>Après avoir laissé les hémocytes de s’installer sur le couvercle en verre rond dans le puits, retirez doucement le milieu de chaque puits.</li>
		<li>Doucement ajouter 200 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans chaque puits d’hémocytes sédentarisés. Incuber les hémocytes pendant 20 min à température ambiante.</li>
		<li>Enlever les 4 % PFA et doucement ajouter 200 µL de PBS contenant 0,1 % Triton X-100 et 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) dans chaque puits. Incuber les hémocytes pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Retirez le PBS et doucement ajouter 200 µL de 1 × 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans chaque puits. Incuber les hémocytes pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.</li>
		<li>Enlever la solution DAPI et ajouter doucement les PBS dans chaque puits. Incuber les hémocytes pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Déposer 10 µL de la milieu de montage antifade sur une lame de microscope.</li>
		<li>Après avoir retiré les PBS de chaque puits, retirer le couvercle en verre de la plaque de 24 puits à l’aide de pinces à pointe fine. Placez délicatement le couvercle en verre sur le support de montage antifade sur la lame de verre, avec les hémocytes vers le bas.</li>
		<li>Laisser la lame sécher en le plaçant dans la nuit sombre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie confocale<ol>
<li>Configurer le microscope confocal pour l’imagerie couleur trois DAPI EGFP et mCherry. Utilisez le paramètre suivant : excitation DAPI (ex) 405 nm, émission (em) 415-480 nm ; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm ; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>Placez l’échantillon sur le microscope et l’accent mis sur l’échantillon à l’aide d’un 63 X / 1.4 objectif ouverture numérique (NA). Localiser les hémocytes souhaitées dans le champ de vision pour l’imagerie.</li>
		<li>Ajuster le laser détecteur de puissance et de gains pour réaliser une exposition appropriée de l’échantillon. Vérifier plusieurs z-avions pour assurer que le niveau d’exposition est approprié pour l’épaisseur de l’échantillon entier.</li>
		<li>Trouver la position haut et en bas sur l’axe z d’un hémocytes entiers. Définir ces postes comme les positions de début et de fin pour le z-sectionnement.</li>
		<li>Utilisez uniquement le balayage zoom d’image de la zone contenant les hémocytes. Les facteurs de zoom 3 X sont souvent utilisés.</li>
		<li>Recueillir les séries d’images à résolution appropriée, par exemple 1024 x 1024 pixels dans le plan x-y et 0,3 µm espacement dans la dimension z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reconstruction du modèle 3D Remarque : Logiciel Open source existe qui effectue la plupart des fonctions décrites ci-dessous pour la reconstruction du modèle 3D.<ol>
<li>Importez le fichier de série z-sectionné image dans le logiciel associé à la microscopie confocale pour la reconstruction du modèle 3D.</li>
		<li>Sélectionnez une cellule présentant la co-localisation des noyaux colorées au DAPI et mCherry exprimant c. burnetii dans un EGFP exprimant les hémocytes. Récolte des séries d’images pour contenir uniquement la cellule unique.</li>
		<li>Sélectionnez l’option visionneuse 3D qui reconstitue le modèle 3D à l’aide d’algorithme pré-packagées du logiciel. Choisissez le type de représentation 3D parmi les options mixtes, Surface et mélange désiré. Dans cette méthode, hemocytes, noyaux et c. burnetii sont indiquées à l’aide de modèles de surface.</li>
		<li>Observer la cellule 3D reconstituée à partir de différentes positions de Regarde un en tenant le bouton de la souris et en faisant glisser le curseur autour de l’écran. Ajustez l’orientation de la cellule et la position de la source lumineuse modélisée pour optimiser l’image. Autres options pour l’opacité, Minimum et Maximum Threshold, spéculaire, Ambient, Shineness et Gamma existent pour optimiser l’image.</li>
		<li>Prendre des coupes à travers le modèle à l’aide de commandes de coupure et de sectionnement pour visualiser le contenu intérieur des hémocytes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la demande d’analyse de gènes ou de protéines
<ol><li>Suite à l’infection avec IIV6 et Listeria, lyser les cellules pour ultérieur qRT-PCR ou analyse par Western blot décrite précédemment21 et suivants du fabricant. Remarque : Consultez la Table des matières pour les amorces pour qRT-PCR et les anticorps pour la tache occidentale.</li>
	<li>Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose, comme précédemment décrit22, pour s’assurer de la bonne longueur du produit amplifié.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Pour mieux comprendre comment sont infectent les cellules de l’hôte, il est important de préciser la localisation de l’agent pathogène dans les cellules, surtout quand l’expérimentation sur les pathogènes préalablement testés et cellule type combinaisons4. Alors qu’étudie la cascade de réaction cellulaire suite à une infection peut indiquer l’invasion pathogène productive, la combinaison des données de réponse cellulaire et d’imagerie est essentielle pour démontrer l’infection et l’invasion de l’a...

Drosophila melanogaster est un organisme modèle bien établi pour l’étude de l’immunité innée1. Au cours de la réponse immunitaire innée, hemocytes jouent un rôle important dans la réponse au défi de l’agent pathogène. Hémocytes sont critiques pour encapsuler des parasites, comme ayant une fonction importante dans la lutte contre l’agent pathogène par l’action phagocytaire au cours de l’infection fongique, virale et bactérienne2,3.
Afin de mieux comprendre réponse immunitaire innée de l’hôte à l’infection microbienne pathogène, il est important de visualiser comment l’agent pathogène envahit les cellules de l’hôte au cours de l’infection. Cette visualisation contribue à la compréhension du mécanisme d’invasion. Ainsi que les détails de la localisation intracellulaire pathogène et la réponse cellulaire, ces données peuvent fournir des indices sur la réponse de l’hôte à l’infection et les organites cellulaires avec lequel interagit le microbe. Ainsi, reconstruction 3D modèle après l’imagerie par microscopie peut être utile pour déterminer l’emplacement précis d’agents pathogènes dans les cellules hôtes. Dans cette étude, nous avons visualisé l’invasion de Coxiella burnetii (c. burnetii), l’agent causal de la fièvre Q, une zoonose qui constitue une menace grave pour la santé humaine et animale, en primaires hémocytes de drosophile . Récemment, il a été démontré que les Drosophila sont susceptibles d’être du niveau de biosécurité 2 phase de Nine Mile II (NMII) cloner 4 souches de c. burnetii et que cette souche est capable de se répliquer dans drosophile4, indiquant que Drosophile peut être utilisé comme un organisme modèle pour étudier la pathogenèse de c. burnetii .
Des études antérieures ont utilisé les hémocytes pour étudier la réponse immunitaire innée chez l’hôte. Hémocytes ont été utilisés pour des observations morphologiques5,6,7, morphométriques analyse2,8, phagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprécipitation10,11, analyse par immunofluorescence10,12, immunomarquage13, immunoblotting3,10, 11 et immunohistochimie9,14. Bien que les cellules de drosophile S2 sont également disponibles pour diverses expériences in vitro , immortalisation et infection virale préexistante potentielle changent leur comportement15,16. L’utilisation de cellules primaires par opposition à une lignée de cellules immortalisées, telles que les cellules S2, permet pour l’étude du système immunitaire inné dans un système plus représentative de l’ensemble de l’organisme. En outre, l’infection des hémocytes in vivo, avant l’extraction, permet aux cellules d’interagir avec d’autres protéines de l’hôte et le tissu, un avantage sur l’extraction de hemocytes avant l’ex vivo de l’infection. Un certain nombre de méthodes différentes ont été utilisé pour obtenir un nombre suffisant d’hémocytes dans un court laps de temps pour garder les hémocytes vivant8,17,18,19.
Dans cette étude, nous présentons une méthode pour extraire les hémocytes de drosophile 3rd stade larvaire pour infection microbienne pathogène avec c. burnetii, monocytogenes de Listeria (Listeria) ou invertébré irisé Virus 6 (IIV6). Nous décrivons les méthodes pour les infections hémocytes fois in vivo et ex vivo . In vivoet ex vivo-hémocytes infectés ont été visualisés à l’aide de la microscopie confocale et utilisées pour construire des modèles 3D de l’invasion de c. burnetii . En outre, en utilisant le protocole d’extraction, ex vivo-hémocytes infectées ont été utilisées pour l’expression génique et protéique des essais. Plus précisément, afin d’examiner l’étendue de l’infection avec IIV6 et Listeria, total ARN ou protéine a été isolé des cellules pour qRT-PCR ou analyse par Western blot. Pris ensemble, le protocole fournit des méthodes pour collecter rapidement un nombre élevé d’hémocytes de 3rd stade larvaire et les éléments de preuve que les hémocytes primaires, infecté soit in vivo ou ex vivo, sont une plate-forme appropriée pour microbienne études d’infection pathogène et des analyses en aval il y a lieu, comme la microscopie, transcriptomique et protéomique.

<table><tbody><tr><td>Schneider’s Drosophila Medium&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>GE Healthcare Life Sciences&nbsp ; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filtre (0.22 & micro ; L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Crépine (100 &micro ; m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillaire en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Extracteur capillaire</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjecteur</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Pince</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 appareil d’administration</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 plaque</td><td>de puits Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Drosophila Assiettes de jus de fruits</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Ethanol absolu</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch’s 100 % Jus de raisin concentré congelé, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Levure, Bakers Dried</td><td>Active MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Ajouter 2 parties d’eau à 1 partie de levure (v/v)</td></tr><tr><td>Aiguille en tungstène</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Pince de maintien</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Support de montage anti-décoloration</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Microsope confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X Microscope confocal à balayage laser à lumière blanche</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>Logiciel de reconstruction d’imagerie 3D</td><td>Leica</td><td>LASX avec module</td> <td>de visualisation 3D3.3)</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Virus irisé des invertébrés 6 (VII6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi : 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008</td></tr><tr><td>)Listeria monocytogenessouche</td> <td>ATCC</td><td>: 10403S 4</td><td>) La souche 10403S de Listeria monocytogenes (Bishop et Hinrichs, 1987) a été cultivée dans un bouillon d’infusion cerveau-cœur (BHI) Difco (BD Biosciences) contenant 50 & micro ; g/ml de streptomycine à 30 °C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>Dégradation de l’ADNg</td></tr><tr>Kit <td></td>de synthèse de<td>l’ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'IIV6_193R_R</td></tr> <tr><td></td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'RpII_qRTPCR_fwd</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr> RpII_qRTPCR_rev <tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green réactif qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Système de PCR en temps réel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Listeria monocytogenes</td><td>abcam</td><td>AB35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-actine produit chez le lapin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugué</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

extraction des hémocytes de larves de drosophile d’infection microbienne et d’analyse

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Au cours de l’infection pathogène de Drosophila melanogaster, hemocytes jouent un rôle important dans la réponse immunitaire tout au long de l’infection. Ainsi, l’objectif du présent protocole est de développer une méthode pour visualiser l’invasion d’agents pathogènes dans un compartiment spécifique immunitaire des mouches, à savoir les hémocytes. À l’aide de la méthode présentée ici, jusqu'à 3 × 106 hémocytes vivants peuvent provenir de 200 larves de stade Drosophila 3rd en 30 min pour infection ex vivo . Hémocytes peuvent également être infecté en vivo par injection 3rd des larves de stade suivi par extraction hémocytes d’infection après 24h. Ces cellules primaires infectés ont été fixés, colorés et imagés à l’aide de la microscopie confocale. Ensuite, des représentations 3D ont été générées à partir des images pour montrer définitivement invasion de pathogènes. En outre, ARN de haute qualité pour qRT-PCR peut être obtenue pour la détection des suivants d’ARNm pathogène infection et suffisamment de protéines peuvent être extraites de ces cellules pour analyse par Western blot. Ensemble, nous présentons une méthode pour la réconciliation définitive de l’invasion de l’agent pathogène et la confirmation de l’infection à l’aide de types d’agents pathogènes bactériens et viraux et une méthode efficace pour l’extraction de hémocytes d’obtenir assez hémocytes direct de drosophile larves d’expériences d’infection ex vivo et in vivo .

Pour recueillir la hauteur hémocytes d’infection ex vivo , de 3 × 106 hémocytes ont été extraites de 200 larves de stade Drosophila 3rd . Pour développer notre méthode, un certain nombre de techniques différentes ont été tenté. Dissection de larve individuelle prendrait jusqu'à 1,5 h, et une moyenne de ~ 8000 cellules ont été obtenues à l’aide de cette méthode18, dont la plupart ne vivait pas avant la fin de la collection. En...

Cette méthode montre comment visualiser invasion de pathogènes dans les cellules d’insectes avec des modèles tridimensionnels (3D). Hémocytes de larves de drosophile étaient infectées par des pathogènes virus ou bactériens, ex vivo ou in vivo. Hémocytes infectés ont été ensuite fixe et teintés d’imagerie avec un microscope confocal et la reconstruction cellulaire 3D ultérieure.

Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’infection cellulaire et de la microbiologie, telles que la façon dont les hémocytes contribuent à la réponse immunitaire globale chez les mouches des fruits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée en laboratoire, en utilisant des larves précédemment infectées. Alternativement, les hémocytes de larves non infectées peuvent être utilisés pour une infection ex vivo.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’imagerie sont difficiles à apprendre en raison de la complexité du microscope confocal et des options de reconstruction de modèles 3D. Pour commencer le protocole, superposez deux à trois morceaux de film de paraffine de dix centimètres sur dix centimètres sous un stéréomicroscope. Ensuite, préparez le capillaire en verre en réglant le chauffage polaire capillaire à 55 % du maximum.Placez le tube capillaire à un point pointu d’environ dix micromètres. Remplissez le capillaire avec de l’huile minérale. Assemblez le tube capillaire rempli sur le nano-injecteur.Et ouvrez l’extrémité du tube capillaire fusionné en cassant l’extrémité avec une

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

L’hémolymphe de la drosophile sert à la fois de sang et de liquide interstitiel, circulant dans tout le corps pendant les stades larvaire et adulte. Cette vidéo décrit un protocole de collecte de l’hémolymphe larvaire afin de quantifier les cellules circulantes.

Rupture des cuticules : une méthode pour collecter l’hémolymphe des larves de drosophile

Source : Hiroyasu, A., D et al., Extraction d’hémocytes de larves de Drosophila melanogaster pour infection microbienne et analyse. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la procédure pour établir une infection bactérienne chez les larves de Drosophila en les plaçant dans une gouttelette bactérienne et en les piquant avec une aiguille en tungstène. Les larves sont ensuite incubées sur une plaque agar rainurée et riche en nutriments pour étudier les interactions hôte-pathogène.

Établissement d’une infection bactérienne chez les larves de Drosophila

Source : Hiroyasu, A., et al. Extraction d’hémocytes de larves de Drosophila melanogaster pour infection microbienne et analyse. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo démontre l’imagerie confocale haute résolution des hémocytes de Drosophila melanogaster infectés par Coxiella burnetii afin de visualiser la localisation des agents pathogènes en 3D, permettant une analyse détaillée de la dynamique intracellulaire des infections et des interactions hôte-pathogène.

Imagerie confocale haute résolution des hémocytes infectés par un agent pathogène de Drosophila

Cette vidéo montre le test de perturbation des hémocytes, évaluant la réadhésion des hémocytes dans les poches hématopoïétiques des larves de drosophile. Les perturbations mécaniques libèrent des hémocytes résidents, ce qui augmente le nombre d’hémocytes circulants. Après la guérison, la réadhésion des hémocytes résidents est confirmée, illustrant la réversibilité.

Un test de perturbation des hémocytes pour évaluer la réadhésion des hémocytes aux poches hématopoïétiques

Drosophila melanogaster est un organisme modèle exceptionnel pour l’étude du système immunitaire inné et des conséquences physiologiques des infections et des maladies. Ce protocole décrit comment administrer des infections bactériennes robustes et quantitativement reproductibles à D. melanogaster, et comment mesurer par la suite la gravité de l’infection et quantifier la réponse immunitaire de l’hôte.

Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Les cellules sanguines de la drosophile, ou hémocytes, circulent entre les sites résidents et la circulation.  Chez la larve, les hémocytes résidents (sessiles) se localisent dans des microenvironnements inductifs, les poches hématopoïétiques, tandis que les hémocytes circulants se déplacent librement dans l’hémolymphe. L’objectif de ce protocole est l’isolement et la quantification standardisés de ces deux populations d’hémocytes, distinctes sur le plan comportemental mais interchangeables.

Dosage des populations de cellules de sang de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve

Systèmes hématopoïétiques de mammifères Drosophila et partagent de nombreuses caractéristiques communes, ce qui rend la drosophile un modèle génétique attrayant pour étudier l' hématopoïèse. Ici, nous démontrons la dissection et montage du principal organe hématopoïétique larvaire pour l'immunohistochimie. Nous décrivons également des méthodes pour analyser différents compartiments hématopoïétiques larvaires dont hémocytes circulants et des cellules à cristaux sessiles.

Méthodes pour examiner la lymphe et Gland hémocytes dans<em&gt; Drosophila</em&gt; larves

Ce protocole décrit un essai de phagocytose in vivo chez l’adulte Drosophila melanogaster pour quantifier la reconnaissance phagocyte et apurement des infections microbiennes.

Évaluation de la réponse immunitaire cellulaire de la drosophile, Drosophila melanogaster, à l’aide d’un test In Vivo la phagocytose

Ce protocole décrit un test in vivo de phagocytose utilisé pour évaluer et quantifier la capacité des jeunes et âgés Drosophila melanogaster hémocytes aux bactéries phagocytose.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.

Drosophila melanogaster Protocole d’injection de larves

Découvrez l'extraction des hémocytes de larves de Drosophila melanogaster pour visualiser l'invasion microbienne en 3D. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires in vivo et ex vivo par microscopie confocale.

Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse

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