Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse

Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’infection cellulaire et de la microbiologie, telles que la façon dont les hémocytes contribuent à la réponse immunitaire globale chez les mouches des fruits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée en laboratoire, en utilisant des larves précédemment infectées. Alternativement, les hémocytes de larves non infectées peuvent être utilisés pour une infection ex vivo.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’imagerie sont difficiles à apprendre en raison de la complexité du microscope confocal et des options de reconstruction de modèles 3D. Pour commencer le protocole, superposez deux à trois morceaux de film de paraffine de dix centimètres sur dix centimètres sous un stéréomicroscope. Ensuite, préparez le capillaire en verre en réglant le chauffage polaire capillaire à 55 % du maximum.

Placez le tube capillaire à un point pointu d’environ dix micromètres. Remplissez le capillaire avec de l’huile minérale. Assemblez le tube capillaire rempli sur le nano-injecteur.

Et ouvrez l’extrémité du tube capillaire fusionné en cassant l’extrémité avec une pince. Éjectez autant d’huile que possible de l’extrémité du tube capillaire, puis remplissez le tube avec un milieu isolant des hémocytes de drosophile, ou DHIM. Pour une visualisation facile de la bordure de l’huile d’hémolymphe, incluez une bulle d’air entre l’huile et le DHIM.

À l’aide d’une pince, prélevez délicatement dix larves de drosophile du troisième stade de la paroi intérieure des flacons de nourriture et placez-les dans une passoire de 100 micromètres. Versez cinq millilitres d’eau stérile sur les larves et secouez la passoire pendant cinq secondes. Placez la passoire sur une lingette pour enlever l’excès d’eau.

Transférez les larves dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, anesthésiez-les avec du gaz CO2 pendant cinq secondes. Ensuite, placez les larves sur un film de paraffine sous le microscope stéréoscopique, avec la face dorsale vers le haut. Placez légèrement le capillaire de verre sur le corps postérieur de la larve pour le maintenir en place, et débloquez l’ouverture de la cuticule postérieure à l’aide d’une pince à pointe fine.

Laissez l’hémolymphe s’écouler sur le film de paraffine. Faites une mare d’hémolymphe, y compris les hémocytes, de 20 à 50 larves à la fois, sur le film de paraffine. Utilisez le capillaire en verre du nanoinjecteur pour absorber l’hémolymphe accumulée.

Éjectez l’hémolymphe dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de DHIM. Placez la pâte de levure sur une plaque de gélose au jus de raisin. Faites une fine incision dans la gélose où les larves peuvent migrer pour éviter le dessèchement.

Assemblez une aiguille en tungstène pointue de 0,001 millimètre avec une pince de maintien à l’aide d’un film de paraffine. Pipetez 50 microlitres de C. Burnetii exprimant la cerise sur le film de paraffine sous le stéréomicroscope et placez les larves dans le bassin de bactéries. Piquez les larves avec une aiguille en tungstène.

Transférez les larves sur une plaque de gélose. Transférez le milieu pathogène restant sur la plaque de gélose et scellez la plaque avec un film de paraffine. Conservez les larves sur la plaque dans l’air humide jusqu’au moment souhaité après l’infection.

Laissez les larves infectées par C. Burnetii sur la plaque pendant 24 heures. Placez un verre de couverture rond de 12 millimètres dans un puits d’une plaque de 24 puits. Pipette 500 microlitres de DHIM dans le puits.

Extrayez et prélevez l’hémolymphe des larves précédemment infectées, puis éjectez l’hémolymphe dans le puits. Centrifugez la plaque à 1000 G pendant cinq minutes. Configurez le microscope confocal pour l’imagerie tricolore de DAPI, EGFP et mCherry.

Placez l’échantillon sur le microscope et faites la mise au point sur l’échantillon à l’aide d’un objectif à ouverture numérique 63x 1,4. Localisez les hémocytes souhaités dans le champ de vision pour l’imagerie. Ensuite, ajustez la puissance du laser et les gains du détecteur pour obtenir l’exposition appropriée de l’échantillon.

Vérifiez plusieurs plans Z pour vous assurer que le niveau d’exposition est approprié pour toute l’épaisseur de l’échantillon. Ensuite, trouvez la position supérieure et inférieure sur l’axe Z d’un hémocyte entier. Définissez ces positions comme positions de début et de fin pour la coupe en Z.

Utilisez le zoom de balayage pour imager la zone contenant l’hémocyte. Collectez la série d’images à la résolution appropriée, par exemple 1024 x 1024 pixels dans le plan X Y et un espacement de 0,3 micromètre dans la dimension Z. Importez le fichier de la série d’images en Z dans le logiciel associé au microscope confocal pour la reconstruction de modèles 3D.

Sélectionnez une co-localisation cellulaire de noyaux colorés avec DAPI et C.Burnetii exprimant mCherry dans un hémocyte exprimant EGFP. Recadrez la série d’images pour qu’elle ne contienne que la cellule unique. Sélectionnez l’option Visionneuse 3D, qui reconstruit le modèle 3D à l’aide de l’algorithme pré-packagé du logiciel.

Choisissez le type d’imagerie souhaité pour la représentation 3D parmi les options de fusion, de surface et mixtes. Dans cette méthode, les hémocytes, les noyaux et C. Burnetii sont représentés à l’aide de modèles de surface. Observez la cellule reconstruite en 3D à partir de différentes positions de visualisation en maintenant le bouton de la souris enfoncé et en faisant glisser le curseur sur l’écran.

Ajustez l’orientation des cellules et la position de la source lumineuse modélisée pour optimiser l’image. Enfin, effectuez des coupes transversales dans le modèle à l’aide des commandes de découpage et de coupe pour visualiser le contenu intérieur de l’hémocyte. La visualisation des hémocytes vivants extraits exprimant l’EGFP sous le contrôle du pilote de l’hémomectine à partir de plusieurs images montre que la plupart des cellules DAPI-positives sont également EGFP-positives.

Des coupes transversales d’hémocytes infectés par Coxiella Burnetii confirment la présence de bactéries exprimant mCherry à l’intérieur de la cellule. Les images ont été reconstruites en modèles 3D et nous avons observé que les hémocytes infectés in vivo présentaient des extensions cytoplasmiques plus importantes et étaient de nature plus plate. Alors que les hémocytes infectés ex vivo étaient plus sphériques.

Des coupes efficaces de l’un ou l’autre modèle confirment la présence de Coxiella exprimant mCherry à l’intérieur de la cellule. Les hémocytes extraits ont été infectés par le VII6 et appliqués à l’analyse PCR qRT, qui a montré des niveaux significativement plus élevés du transcrit VII6-193R entre les cellules fictives et les cellules infectées par le VII6. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que tous les milieux sont préparés à l’avance et équilibrés à température ambiante afin que les cellules ne manquent pas trop longtemps des nutriments appropriés.

Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la recherche d’ARN sur cellule unique, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, comme la réponse globale de l’hôte à l’infection. Après son développement, cette technique aide les chercheurs en immunologie et en microbiologie à explorer l’invasion des agents pathogènes et les réponses de l’hôte chez les mouches des fruits ou d’autres animaux ayant un système circulatoire ouvert.