Un sang à base d’essai pour la détection des ROS1 et RET transcrits de Fusion de circuler l’acide ribonucléique Using Digital Polymerase Chain Reaction

L’objectif global de cette procédure est l’isolement et la caractérisation par PCR numérique en gouttelettes d’acide ribonucléique circulant dérivé de tumeurs à partir d’échantillons de sang total. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du diagnostic en oncologie. Par exemple, comment détecter les transciptes de fusion de gènes dérivés de tumeurs à partir d’échantillons d’ARN et de sang circulants.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des méthodes hautement optimisées pour la stabilisation, l’extraction et la détection des variants de l’ARN présents à basse fréquence et dans des échantillons de sang. Les tests sanguins sont un complément aux biopsies tissulaires traditionnelles avec l’avantage d’utiliser une technique peu invasive qui peut fournir des résultats rapides. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mutations cliniquement significatives et le CPNPC, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes où l’identification accessible et rapide des molécules d’ARN circulantes dans le sang total est nécessaire.

L’ARN circulant pour la réaction de transcription inverse est isolé à partir d’échantillons de sang de donneurs, comme décrit dans le protocole textuel. Convertissez l’échantillon d’ARN circulant concentré en ADNc à l’aide d’un kit de réaction de transcription inverse disponible dans le commerce, y compris des amorces aléatoires. Inclure un échantillon témoin sans transciptase inverse et un échantillon témoin sans ARN.

Lorsque la réaction de transcription inverse est terminée, isolez l’ADNc du mélange réactionnel, à l’aide d’une colonne de spin de concentrateur d’ADN disponible dans le commerce. Cette étape facilite l’élimination des enzymes, des amorces et des désoxynucléotides triphosphates libres. Si l’ADNc ne doit pas être utilisé immédiatement dans les réactions PCR, stockez-le à moins 80 degrés Celsius.

Portez une blouse de laboratoire d’élimination et des gants en nitrile pendant l’exécution de cette procédure, ainsi qu’une zone de préparation des réactifs dédiée. Couvrez les sondes pour les protéger de la lumière, car les lumières successives peuvent photoblanchir le colorant fluorescent attaché à la sonde. Préparez d’abord les mélanges PCR pour un volume de réaction final de 20 microlitres comme indiqué dans ce tableau, mais sans encore ajouter l’ADNc.

Ensuite, transportez les mixages, couverts et protégés de la lumière, vers un capot propre PCR, situé dans une zone de préamplification séparée. Répartissez les mélanges sur une plaque PCR. Ajoutez l’ADNc à tester au mélange PCR.

Couvrez la plaque avec une scelleuse de plaque amovible. Centrifugez brièvement les plaques pour recueillir les échantillons au fond des puits. Mélanger sur un shaker, à basse température pendant 10 secondes.

Centrifugez à nouveau brièvement les plaques pour recueillir les échantillons au fond du puits. Retirez la scelleuse de plaques avant d’effectuer la génération manuelle de gouttelettes. Il est important de minimiser les bulles dans la pointe de la pipette lors du chargement des échantillons et de transférer ensuite les gouttelettes lentement de la cartouche à la plaque pour éviter d’endommager les gouttelettes.

Transférez soigneusement 20 microlitres du mélange PCR dans les puits d’échantillon sur la cartouche de génération de gouttelettes. Ajouter 70 microlitres d’huile de génération de gouttes. Recouvrez d’un joint en caoutchouc et transférez la cartouche dans un générateur de gouttelettes manuel pour initier la génération de gouttelettes.

Après la génération des gouttelettes, utilisez les embouts recommandés par le fabricant pour transférer les gouttelettes sur une plaque PCR fraîche. Aspirez et distribuez les gouttelettes lentement, pendant 5 à 6 secondes chacune, sans toucher l’extrémité de la pointe à la cartouche ou à la plaque de gouttelettes. Scellez la plaque avec une scelleuse de plaques d’aluminium.

Effectuez la PCR dans le thermocycleur en utilisant les paramètres suivants. Une fois le fonctionnement du thermocycleur terminé, lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de gouttelettes. Créez une disposition de plaque pour le logiciel de lecture qui identifie l’emplacement des commandes et des échantillons, puis chargez-la dans le logiciel pour démarrer la lecture.

Les résultats de lecture des plaques sont analysés à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce. Commencez par accéder au menu d’analyse pour afficher des graphiques d’amplitude en 2 dimensions ou en 2D. Évaluez la qualité globale des données en examinant les données sur les gouttelettes.

À l’aide du menu des événements, évaluez les données pour déterminer le nombre total d’événements acceptés. Il devrait y avoir plus de 10 000 événements par puits. Si ce n’est pas le cas, les données doivent être soigneusement évaluées pour détecter d’autres problèmes.

Ensuite, vérifiez les données pour les amplitudes de fluorescence odieuses. Des différences significatives d’amplitude et de concentration entre les échantillons répétés indiquent une mauvaise manipulation ou un mauvais mélange des échantillons. Notez les grappes de gouttelettes avec des motifs de pulvérisation sur un axe de 45 degrés, ce qui indique des gouttelettes de mauvaise qualité ou des échantillons problématiques.

Examinez d’abord les données pour le contrôle positif, l’absence de contrôle de la transcriptase inverse et l’absence de contrôle de l’ARN. Sélectionnez tous les échantillons de contrôle et examinez la qualité de l’agrégat à l’aide d’un tracé 2D pour un seuillage approprié, une séparation claire entre les amas de gouttelettes devrait être apparente. Pour chaque variante de test, définissez le seuil en fonction des puits de contrôle.

Définissez des seuils sur les tracés 2D à l’aide des outils de réticule pour séparer la population de gouttelettes double négative de la population de gènes de contrôle sur l’axe des x et de la population de gènes variants, le cas échéant, sur l’axe des y. Quelques copies de chaque puits de réplicant pour un seul échantillon. Enfin, exprimez les résultats du test en nombre de copies variantes détectées.

À l’aide de lignées cellulaires exprimant la fusion SDC4-ROS1 et la fusion CCDC6-RET, diluées dans le fond de l’ARN sauvage humain total, la limite de détection a été établie à 0,2 % de fréquence de variants avec chaque variant de fusion. Aucune préparation d’ARN dérivé de 5 % de la lignée cellulaire cible n’a été détectée, ce qui démontre la spécificité du test. Les étalons analytiques d’ARN multiplex ont été mesurés à des concentrations élevées, moyennes et faibles sur trois cycles le même jour.

Trois trajets sur trois jours consécutifs, et avec deux opérateurs indépendants. Les résultats démontrent une détection précise à la fois du transcrit de fusion d’intérêt ainsi que d’un gène de contrôle interne, GUSB. Chaque échantillon clinique a également été analysé avec un contrôle positif, un contrôle sans transcriptase inverse et un contrôle sans matrice d’ARN.

Les variantes Fusion sont représentées le long de l’axe des y tandis que GUSB se trouve sur l’axe des x. Lorsque les témoins de lot ont été évalués sur une période de 21 jours, des gouttelettes positives à la fusion et des gouttelettes du gène de contrôle GUSB ont été observées pour ROS1 et RET dans toutes les séries. Des résultats sous-optimaux sont observés lorsqu’il y a contamination dans le contrôle sans transcriptase inverse, contamination dans le contrôle sans ARN, partage et coalescence des gouttelettes, et conditions de PCR mal optimisées ou inhibition de la PCR.

Une fois maîtrisé, l’ensemble de ce protocole peut être réalisé en 12 heures environ. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser les meilleures pratiques pour la manipulation des échantillons d’ARN et de sang humain. Suite à l’isolement de l’ARN, d’autres méthodes telles que le séquençage de nouvelle génération pourraient être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de nouveaux variants de fusion.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’ARN circulant du sang total et du plasma, puis de traiter l’ARN récupéré afin d’identifier les variants rares en circulation tels que RET et ROS1. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la détection de mutations cliniquement exploitables dans le sang total. Et nous avons étendu ces méthodes pour examiner les transcriptions surexprimées en circulation.