Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des Modifications d’Histone de Saccharomyces cerevisiae

L’objectif global de ce protocole d’immunoprécipation de la chromatine est de déterminer l’abondance et la localisation des modifications des histones dans des régions définies du génome de la levure en bourgeonnement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la régulation de la chromatine, telles que comment les modifications des histones sont liées au contrôle de l’expression des gènes et comment ces modifications changent en réponse à différentes conditions environnementales. Un protocole extrêmement polyvalent qui peut être utilisé pour étudier de nombreuses modifications d’histones différentes et plusieurs souches E à la fois.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des modifications des histones, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres protéines de liaison de la chromatine grâce à l’utilisation de marqueurs d’épitopes ou d’anticorps disponibles. Commencez cette procédure en cultivant les cellules de levure, inoculez 10 millilitres de milieu YPD avec une seule colonie de chaque souche appropriée, et cultivez-la à 30 degrés Celsius dans un incubateur à agitation à 220 tr/min pendant la nuit. Le lendemain, après avoir mesuré la densité optique à 600 nanomètres ou OD600 de la culture, diluez la culture à une OD600 de 0,2 dans 100 mL de YPD dans un nouveau flacon.

Cultivez les cellules à 30 degrés Celsius dans un incubateur à agitation à 220 tr/min jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase mi-loglog. Lorsque les cultures ont atteint la mi-phase logarithmique, ajouter 2,7 millilitres de formaldéhyde à 37 % directement dans le milieu de chaque flacon pour une concentration finale de 1 % de formaldéhyde. Transférez les flacons dans un agitateur à température ambiante et secouez à 50 tr/min pendant 15 minutes.

Ajoutez cinq millilitres de glycine à 2,5 molaires dans le milieu et continuez à agiter à 50 tr/min à température ambiante pendant cinq minutes pour éteindre le formaldéhyde. Ensuite, faites tourner les cellules et lavez-les comme décrit dans le protocole texte. Retirez le surnageant après le dernier essorage et procédez à la fabrication de lysats de levure.

Remettre les cellules en suspension dans un millilitre de précipitation aminée de chromatine froide ou de tampon de lyse ChIP avec 1 millimolaire PMSF et une dilution de 1:1000 d’un cocktail d’inhibiteur de protéase de levure. Transférez la suspension dans un tube à bouchon à vis de 2,0 millilitres contenant 200 microlitres de billes de verre. Transférez les cellules dans un appareil de battage de billes pour une agitation à grande vitesse à quatre degrés Celsius.

Battez les perles pendant 30 secondes et glacez pendant une minute. Battez les talons six fois au total, en gardant les cellules sur la glace pendant au moins une minute entre chaque battement de 30 secondes. À l’aide d’un embout de chargement de gel, transférez le lysat dans un tube de 1,5 millilitre.

Centrifugez le lysat à 15 500 g à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 250 microlitres de tampon de digestion des nucléases micrococciques en pipetant doucement de haut en bas. Ajoutez 2,5 microlitres de nucléase micrococcique à chaque réaction.

Mélangez doucement en inversant quatre à six fois et incubez immédiatement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après 20 minutes, arrêtez la réaction en plaçant les tubes sur de la glace, en ajoutant cinq millilitres d’EDTA 0,5 molaire pour une concentration finale de 10 millimolaires d’EDTA et en mélangeant doucement par inversion. Centrifuger à 15, 500 g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, transférez chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pour obtenir les résultats les plus cohérents, il est essentiel de s’assurer que la même concentration de protéines est utilisée dans chaque précipitation d’aminés. En fonction du nombre de précipitations d’acides aminés ou de réactions IP, faites un mélange maître de chaque fraction de chromatine libérée par des nucléases micrococciques et d’un tampon de lyse ChIP et allouez un millilitre contenant 50 microgrammes de protéines totales à des tubes individuels.

Retirez 100 microlitres de chaque mélange IP pour les traiter comme échantillon d’entrée. Congelez les échantillons d’entrée à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Il est également important de s’assurer que la même quantité de billes liées à l’anticorps est utilisée pour chaque immunoprécipitation.

À l’aide d’une pointe de pipette à large carte, ajoutez 20 microlitres de billes de protéines AG magnétiques, pré-liées avec des anticorps à chaque échantillon IP. Faites pivoter les échantillons à huit tr/min à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Lorsque l’IP est terminé, placez les tubes dans un support magnétique et laissez les billes s’accumuler sur le côté du tube.

À l’aide d’une pipette, retirez le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon de lyse ChIP aux billes et tournez à huit tr/min à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, placez les tubes sur le support magnétique et retirez le surnageant.

De cette manière, lavez les perles successivement avec les tampons suivants pour le nombre de fois indiqué. Tampon de lyse ChIP, tampon de lavage à haute teneur en sel, tampon de lavage LiCl/détergent et TE. Lors du dernier lavage TE, utilisez 0,5 millilitre de TE pour transférer la plupart des billes dans un nouveau tube, puis utilisez 0,5 millilitre supplémentaire de TE pour laver le tube et transférer les billes restantes. Ajoutez 250 microlitres de tampon d’élution ChIP fraîchement préparé dans chaque tube et agitez brièvement la solution.

Faites pivoter les échantillons à huit tr/min à température ambiante pendant 15 minutes. Placez les tubes dans le support magnétique. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube et évitez les billes.

Ajoutez encore 250 microlitres de tampon d’élution ChIP aux billes. Faites pivoter les échantillons à huit tr/min à température ambiante pendant 15 minutes. Avec précaution et sans déranger les billes, transférez le surnageant dans le tube contenant la première élution.

Décongelez les échantillons d’entrée collectés précédemment et ajoutez 400 microlitres de tampon d’élution ChIP à chaque échantillon d’entrée. Pour inverser les liaisons croisées de l’ADN des protéines, ajoutez à la fois aux échantillons d’entrée et aux échantillons IP, 20 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires, cinq microlitres de glycogène et 12,5 microlitres de protéinase K. Mélangez bien en inversant ou en effleurant les tubes. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant la nuit.

Pour commencer cette procédure, préparez un mélange maître QPCR pour chaque ensemble d’amorces en combinant les volumes appropriés de mélange QPCR, l’amorce directe et l’amorce inverse. Faites des mélanges maîtres d’ADN pour chaque échantillon d’ADN où une réaction contient 0,5 microlitre d’ADN et 4,0 microlitres d’eau sans nucléases Ajoutez 5,5 microlitres du mélange maître d’amorce approprié à chaque puits dans une plaque QPCR de 384 puits. Faites tourner l’assiette à 200 g à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, ajoutez 4,5 microlitres du mélange principal d’ADN approprié dans chaque puits. Fermez l’assiette et faites-la tourner à 200 g à température ambiante pendant une minute. Effectuez une QPCR à l’aide d’un système QPCR en temps réel dans les conditions suivantes : 95 degrés Celsius pendant trois minutes, 40 cycles de 95 degrés Celsius pendant 10 secondes et 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et une courbe de fusion de 65 degrés Celsius à 95 degrés Celsius avec des incréments de 0,5 degré Celsius pendant cinq secondes.

L’un des éléments clés de ce protocole est l’optimisation de la concentration de nucléases micrococciques utilisées pour digérer la chromatine en fragments solubles. Cet exemple, résultat d’une électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN isolé après digestion de la pastille de chromatine avec des quantités variables de nucléases micrococciques, montre que 2,5 microlitres d’enzyme à 20 unités par microlitre produisaient principalement des mononucléosomes. Cette expérience représentative de ChIP a utilisé des anticorps dirigés contre un marqueur méthyle d’histone H3K4me2 et une histone H3 dans des cellules knock-out de type sauvage et set1.

Les cellules knock-out Set1 n’ont pas la méthyl transférase qui catalyse la marque Les barres indiquent l’enrichissement relatif de H3K4me2 au faible sci indiqué. La souche de type sauvage a montré un enrichissement clair pour H3K4me2 à l’extrémité cinq prime de deux gènes connus pour être des cibles directes de set1, PMA1 et ERG11 alors qu’aucun signal n’a été observé dans les cellules knock-out de set1. Comme prévu, il n’y a pas eu d’enrichissement de la marque H3K4me2 à TEL07L, l’expression de SPR3 a également été signalée comme étant régulée par set1 mais ces résultats indiquent que la régulation est susceptible de se produire par un mécanisme différent de celui de PMA1 ou ERG11.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de tester soigneusement la spécificité de l’anticorps utilisé avec les contrôles appropriés. Le cas échéant, les régions de contrôle positives et négatives doivent être sondées dans le QPCR.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le séquençage GP peuvent également être effectuées afin de déterminer le génome par distribution des modifications d’histones. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter de manière cohérente les niveaux de différentes modifications d’histones dans des régions génomiques uniques avec des expériences bien contrôlées.