Name: Micro-dissection de l’organe de l’émail des incisives mandibulaires de Rats exposés à des substances toxiques environnementales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez la micro-dissection de l'organe de l'émail chez le rat pour étudier l'activité des améloblastes lors de la formation de l'émail. Cette technique permet d'analyser quantitativement les cellules dentaires sans traitement préalable.

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Ce travail a été financé par l’Université Paris-Diderot, l’Institut National Français de la santé et la recherche médicale (INSERM) et l’Institut Français pour la recherche odontologique (IFRO).

Tous les animaux utilisés dans la présente étude ont été maintenues conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère Français de l’Agriculture (A-75-06-12).
1. animale exposition aux substances toxiques
<ol><li>Avant d’effectuer ce protocole, obtenir l’approbation institutionnelle nécessaire et s’assurer de se conformer à toutes les directives de protection des animaux.</li>
	<li>S’appliquent à la conception du protocole de recherche permettant la constitution de différents groupes expérimentaux afin de tester l’impact de la molécules étudiées sur la phase de sécrétion Odam et la phase de maturation Odam. Ici, quatre groupes de rats Wistar mâles ont été constitués selon leur exposition au fluorure (NaF) en combinaison ou non avec BPA (Figure 1 a)2. Tous les animaux ont été observées et disséquées jour 65 (Figure 1 b).</li>
</ol>2. dissection de Hemi-mandibules des Rats adultes
<ol><li>Euthanasier des rats de CO2 asphyxie, éventuellement suivi par décapitation à la tête séparée du reste du corps. Exposer des rats à CO2 pendant 5 min dans une zone dédiée à16.</li>
	<li>Retirez toute la peau de la lèvre inférieure à l’aide d’un scalpel #11 afin d’obtenir un accès facile pour les incisives inférieures.</li>
	<li>Avec le scalpel même, faites une incision entre les deux incisives inférieures avec une légère pression et la mandibule sera divisée en deux moitiés.</li>
	<li>Couper l’articulation mandibulaire temporale avec un scalpel pour détacher la mâchoire et tenir l’hémi-mandibule avec pince fine.</li>
	<li>Couper les tissus mous environnants avec un scalpel et enlever tous les muscles, tendons et ligaments à l’aide d’un racloir jusqu'à ce que l’OS est parfaitement propre.</li>
</ol>3. isolement des incisives17,18
<ol><li>Raser avec soin l’OS en plaçant la lame parallèle à l’axe longitudinal majeur de l’incisive. Commencez à la crête osseuse près les conseils de l’incisive (extrémité proximale) jusqu'à la fin de l’incisive près de la boucle du col utérin. La motion de l’incision part de proximale à la direction distale.</li>
	<li>Faites une première coupe distale à la boucle du col avec le scalpel pour enlever la gonion de l’hémi-mandibule et permettre de décoller de l’incisive facilement sans endommager la boucle col de l’utérus ou le stade sécrétoire des améloblastes (ligne rouge dans la Figure 2).</li>
	<li>Faire une deuxième coupe au-dessous de la deuxième molaire et insérez le scalpel entre l’os et la surface médiale de l’incisive. Lorsque tout l’OS basal est levée, faire pivoter vers l’extérieur l’incisive et enlevez-le soigneusement pour éviter l’émail organe tissu porter atteinte à l’aide de pinces fines.</li>
</ol>4. micro-Dissection de l’organe de l’émail sous lentille binoculaire
<ol><li>Déposer 200 µL de tampon Phosphate salin (PBS 1 X) sur l’incisive à l’aide d’une pipette. Prendre l’incisive avec pince fine avec la face labiale vers le haut. Faire un scalpel marque entre l’incolore et les parties orange du tissu. Cette note correspond à la tache blanche sous-jacente qui est observable par la suite (Figure 2).</li>
	<li>Gratter, avec une pelle ou un outil équivalent, la surface de la cellule de la marque de scalpel à l’extrémité apicale correspondant à sécrétion améloblastes de scène (incolore) et de la marque de bistouri Swann-Morton à la pointe de l’incisive pour les améloblastes de phase (orange) de maturation.</li>
	<li>Enlever le tissu de 2 mm, correspondant à la phase de transition, comme précédemment décrit19. Ne pas ouvrir l’incisive au cours de la dissection orgue émail pour éviter la contamination par le mésenchyme.</li>
	<li>Couper la boucle col de l’utérus située immédiatement à la partie apicale de l’incisive (Figure 2) tel que décrit précédemment20.</li>
	<li>Ramasser en solution à 10 % de formol ou lyse pour complément d’enquête (voir Table des matières).</li>
</ol>5. collection de tissus organes séparés émail pour d’autres recherches
<ol><li>Déposer 200 µL de tampon PBS 1 X sur l’incisive.</li>
	<li>Avec une lame de bistouri #11, soigneusement détacher les cellules épithéliales dentaires progressivement dans la mémoire tampon, séparément pour chaque étape avec l’aide de la marque de bistouri faite précédemment.</li>
	<li>Pour cellule RNA et extractions de protéine, mettre le tissu dans une solution de lyse qui permet l’extraction de protéines et ARN (voir Table des matières). NOTE : Préparez RNAs de haute qualité en tournant la tissu-pelle dans le tube et ensuite ponçage les cellules jusqu'à l’obtention d’un mélange homogène. Le mélange est prêt pour des extractions ARN et des protéines selon la procédure par le fabricant, qui a été précédemment décrit2,8,17. Habituellement, environ 5-10 µg au total RNAs et 150 µg de protéines totales ont été obtenus pour chaque préparation.</li>
	<li>Pour les analyses histologiques, immunohistochimie et hybridation in situ (ISH), mettent la couche de cellules dans 10 % de formol pendant 2 h, puis conserver à 4 ° C dans du PBS 1 X. Les tissus peuvent ensuite être incorporés dans cire/paraffine ou tissu OCT pour coupes congelées.</li>
	<li>Pour les extractions EMP, prendre l’incisive avec pince fine. Après une courte exposition à l’air (déshydratation légère), une tache blanche sera visible autour de la partie médiane de la face labiale de l’incisive, qui représente l’initiation de la minéralisation de l’émail. Cette tache blanche correspond à la transition- / tôt-la phase de maturation des améloblastes, donc l’utiliser comme indicateur pour l’extraction de PGE21.</li>
</ol>

<ol><li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enamel+defects+reflect+perinatal+exposure+to+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Enamel defects reflect perinatal exposure to bisphenol A.</a> Am J Pathol. 183, 108-118 (2013).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Exposure+to+Bisphenol+a+Exacerbates+Dental+Fluorosis+in+Growing+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic Exposure to Bisphenol a Exacerbates Dental Fluorosis in Growing Rats.</a> J Bone Miner Res. 31, 1955-1966 (2016).</li>
<li>Alaluusua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dental+aberrations+after+the+dioxin+accident+in+Seveso%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Developmental dental aberrations after the dioxin accident in Seveso.</a> Environ Health Perspect. 112, 1313-1318 (2004).</li>
<li>Chapple, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+lifestyle%2C+behaviour+or+systemic+diseases+with+dental+caries+and+periodontal+diseases%3A+consensus+report+of+group+2+of+the+joint+EFP%2FORCA+workshop+on+the+boundaries+between+caries+and+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Interaction of lifestyle, behaviour or systemic diseases with dental caries and periodontal diseases: consensus report of group 2 of the joint EFP/ORCA workshop on the boundaries between caries and periodontal diseases.</a> J Clin Periodontol. 44, S39-S51 (2017).</li>
<li>Nanci, A. Enamel: Composition, Formation, and Structure. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNanci%2C+A+%22Ten+Cate%27s+Oral+Histology+Development%2C+Structure%2C+and+Function%22">Ten Cate's Oral Histology Development, Structure, and Function</a>. , 8th ed, Elsevier mosby. 122-164 (2012).</li>
<li>Leite, G. A., Sawan, R. M., Teofilo, J. M., Porto, I. M., Sousa, F. B., Gerlach, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+lead+exacerbates+dental+fluorosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Exposure to lead exacerbates dental fluorosis.</a> Arch Oral Biol. 56, 695-702 (2011).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enamel+hypomineralization+due+to+endocrine+disruptors%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tiss+Res%22%5BJournal%5D)">Enamel hypomineralization due to endocrine disruptors.</a> Connect Tiss Res. 55, 1-5 (2014).</li>
<li>Jedeon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+involvement+in+rat+amelogenesis%3A+an+additional+way+for+endocrine+disrupting+chemicals+to+affect+enamel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor involvement in rat amelogenesis: an additional way for endocrine disrupting chemicals to affect enamel synthesis.</a> Endocrinology. 157, 4287-4296 (2016).</li>
<li>Weerheijm, K. L., Jalevik, B., Alaluusua, S. <a target="_blank" href="https://www.karger.com/Article/Abstract/47479">Molar-incisor hypomineralisation.</a> Caries Res. 35, 390-391 (2001).</li>
<li>Jälevik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+Diagnosis+of+Molar-Incisor-+Hypomineralisation+%28MIH%29%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Paediatr+Dent%22%5BJournal%5D)">Prevalence and Diagnosis of Molar-Incisor- Hypomineralisation (MIH): A systematic review.</a> Eur Arch Paediatr Dent. 11, 59-64 (2010).</li>
<li>Alaluusua, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aetiology+of+Molar-Incisor+Hypomineralisation%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Paediatr+Dent%22%5BJournal%5D)">Aetiology of Molar-Incisor Hypomineralisation: A systematic review.</a> Eur Arch Paediatr Dent. 11, 53-58 (2010).</li>
<li>Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. The tooth, target organ of Bisphenol A, could be used as a biomarker of exposure to this agent. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJedeon%2C+K+%22Bisphenol+A%3A+Sources%2C+Risks+of+Environmental+Exposure+and+Human+Health+Effects%22">Bisphenol A: Sources, Risks of Environmental Exposure and Human Health Effects</a>. Gibert, Y. , Nova Science Publishers. 205-225 (2015).</li>
<li>Fejerskov, O., Larsen, M. J., Richards, A., Baelum, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+tissue+effects+of+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Dental tissue effects of fluoride.</a> Adv Dent Res. 8, 15-31 (1994).</li>
<li>Robinson, C., Connell, S., Kirkham, J., Brookes, S. J., Shore, R. C., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+fluoride+on+the+developing+tooth%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of fluoride on the developing tooth.</a> Caries Res. 38, 268-276 (2004).</li>
<li>Sahlberg, C., Pavlic, A., Ess, A., Lukinmaa, P. L., Salmela, E., Alaluusua, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+amoxicillin+and+sodium+fluoride+on+the+structure+of+developing+mouse+enamel+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined effect of amoxicillin and sodium fluoride on the structure of developing mouse enamel in vitro.</a> Arch Oral Biol. 58, 1155-1164 (2013).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+of+neonatal+rats+with+carbon+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Euthanasia of neonatal rats with carbon dioxide.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 23-27 (2009).</li>
<li>Hiller, C. R., Robinson, C., Weatherell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+the+composition+of+developing+rat+incisor+enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Variations in the composition of developing rat incisor enamel.</a> Calcif Tissue Res. 18, 1-12 (1975).</li>
<li>Robinson, C., Kirkham, J., Nutman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+enamel+formation+and+eruption+rate+in+rat+mandibular+incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between enamel formation and eruption rate in rat mandibular incisors.</a> Cell Tissue Res. 254, 655-658 (1988).</li>
<li>Smith, C. E., Nanci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+sampling+the+stages+of+amelogenesis+on+mandibular+rat+incisors+using+the+molars+as+a+reference+for+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">A method for sampling the stages of amelogenesis on mandibular rat incisors using the molars as a reference for dissection.</a> Anat Rec. 225, 257-266 (1989).</li>
<li>Chavez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+dental+epithelial+stem+cells+from+the+adult+mouse+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Brookes, S. J., Kingswell, N. J., Barron, M. J., Dixon, M. J., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+32-kDa+fragment+the+functional+enamelin+unit+in+all+species%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Oral+Sci%22%5BJournal%5D)">Is the 32-kDa fragment the functional enamelin unit in all species?</a> Eur J Oral Sci. 119, 345-350 (2011).</li>
<li>Babajko, S., Jedeon, K., Houari, S., Loiodice, S., Berdal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Steroid+Axis%2C+a+New+Paradigm+for+Molar+Incisor+Hypomineralization+%28MIH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Steroid Axis, a New Paradigm for Molar Incisor Hypomineralization (MIH).</a> Front Physiol. 8, 343(2017).</li>
<li>Houari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asporin+and+the+mineralization+process+in+fluoride-treated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Min+Res%22%5BJournal%5D)">Asporin and the mineralization process in fluoride-treated rats.</a> J Bone Min Res. 29, 1446-1455 (2014).</li>
<li>Denbesten, P., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoride+toxicity%3A+dental+fluorosis%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+oral+science%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoride toxicity: dental fluorosis.</a> Monographs in oral science. 22, 81-96 (2011).</li>
<li>Kirkham, J., Robinson, C., Phull, J. K., Shore, R. C., Moxham, B. J., Berkovitz, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+rate+of+eruption+on+periodontal+ligament+glycosylaminoglycan+content+and+enamel+formation+in+the+rat+incisor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of rate of eruption on periodontal ligament glycosylaminoglycan content and enamel formation in the rat incisor.</a> Cell Tissue Res. 274, 413-419 (1993).</li>
<li>Lacruz, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+candidate+genes+involved+in+mineralization+of+dental+enamel+by+genome-wide+transcript+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel candidate genes involved in mineralization of dental enamel by genome-wide transcript profiling.</a> J Cell Physiol. 227, 2264-2275 (2012).</li>
<li>Wen, X., Paine, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+deposition+and+ferritin+heavy+chain+%28Fth%29+localization+in+rodent+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Iron deposition and ferritin heavy chain (Fth) localization in rodent teeth.</a> BMC research notes. 6, 1(2013).</li>
<li>Houari, S., Loiodice, S., Jedeon, K., Berdal, A., Babajko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Steroid+Receptors+in+Ameloblasts+during+Amelogenesis+in+Rat+Incisors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of Steroid Receptors in Ameloblasts during Amelogenesis in Rat Incisors.</a> Front Physiol. 7, 503(2016).</li>
<li>Kawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+dental+epithelial+cell+line+%28HAT-7%29+and+the+cell+differentiation+dependent+on+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway.</a> Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).</li>
<li>Zhou, Y. L., Snead, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein+alpha+as+a+transactivator+of+the+mouse+amelogenin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of CCAAT/enhancer-binding protein alpha as a transactivator of the mouse amelogenin gene.</a> J Biol Chem. 275, 12273-12280 (2000).</li>
<li>Nakata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+mouse+ameloblast-lineage+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line.</a> Biochem Biophys Res Commun. 308, 834-839 (2003).</li>
<li>Harada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+ameloblastoma+cell+line%2C+AM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+pathology+%26+medicine%3A+official+publication+of+the+International+Association+of+Oral+Pathologists+and+the+American+Academy+of+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Establishment of ameloblastoma cell line, AM-1.</a> Journal of oral pathology & medicine: official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 27, 207-212 (1998).</li>
<li>Jussila, M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+networks+regulating+tooth+organogenesis+and+regeneration%2C+and+the+specification+of+dental+mesenchymal+and+epithelial+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling networks regulating tooth organogenesis and regeneration, and the specification of dental mesenchymal and epithelial cell lineages.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a008425(2012).</li>
<li>Tucker, A., Sharpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting-edge+of+mammalian+development%3B+how+the+embryo+makes+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The cutting-edge of mammalian development; how the embryo makes teeth.</a> Nat Rev Genet. 5, 499-508 (2004).</li>
<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Years+lived+with+disability+%28YLDs%29+for+1160+sequelae+of+289+diseases+and+injuries+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2163-2196 (2012).</li>
<li>Marcenes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+oral+conditions+in+1990-2010%3A+a+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Global burden of oral conditions in 1990-2010: a systematic analysis.</a> J Dent Res. 92, 592-597 (2013).</li>
<li>National Institute of Dental and Craniofacial Research. Dental Caries (Tooth Decay) in Adults (Age 20 to 64). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm">https://www.nidcr.nih.gov/DataStatistics/FindDataByTopic/DentalCaries/DentalCariesAdults20to64.htm</a> (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Odam altérée activité et/ou perturbé Odam prolifération, différenciation et maturation processus responsable d’anomalies de l’émail irréversible et, par conséquent, la caractérisation des anomalies de l’émail peut aider à développer la compréhension de l’altération Odam activité pendant Amélogenèse. Ainsi, les études sur l’organe de l’émail isolés sont déterminants pour élucider les événements pathologiques conduisant à l’émail défauts quels que soient leur origine, environnemental ou génétique.
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Plusieurs anomalies de l’émail du développement peuvent résulter de l’exposition aux substances toxiques environnementaux et/ou de style de vie inapproprié1,2,3,4. Caractérisation de perturber les événements et les molécules d’Amélogenèse en utilisant la procédure décrite actuellement favorisera l’utilisation des anomalies de l’émail qui en résulte comme marqueurs précoces de l’exposition à plusieurs substances toxiques et peut-être aider à reconstituer l’histoire de la santé de chaque patient pendant la période périnatale, quand l’émail est synthétisée1,2. Synthèse de l’émail peut être divisée en quatre grandes étapes selon Odam activité5. La première étape regroupe la prolifération cellulaire et pré-Odam précurseur. Au cours de la deuxième étape, les améloblastes différenciées sécrètent émail protéines de la matrice (PGE), principalement amélogénine, enamelin et ameloblastin, qui détermine l’épaisseur de l’émail final. Ainsi, toute perturbation de la synthèse de l’EMP conduit à des anomalies quantitatives de l’émail. Après la déposition de l’épaisseur de l’émail complet, commence la phase de maturation. Au cours de cette étape, croissance cristallites apatite en largeur et en épaisseur permet à l’émail atteindre le plus haut ratio de minéralisation dans un tissu biologique, avec jusqu'à 96 % en poids. Défauts d’émail des événements perturbateurs qui se produisent au cours de la maturation étape conduit à qualitative. Enfin, améloblastes entrent dans une phase de maturation post, également appelée pigmentation chez les rongeurs et apoptose au cours de l’éruption de dents faisant des anomalies de l’émail (le cas échéant) irréparable et irréversible, donc défauts potentiel enregistrement rétrospective de Odam souligne. Chez les rongeurs, Amélogenèse suit une séquence d’événements avec la particularité que leurs incisives poussent en permanence, ce qui en fait un modèle approprié pour étudier le processus général d’Amélogenèse similaire. Ainsi, toute perturbation d’Amélogenèse provoque des altérations de l’émail de qualité ou quantité, selon la fenêtre de temps de l’événement qui perturbent. En ce sens, l’exposition à la dioxine, du plomb et produits chimiques perturbant le système endocrinien (SPSE) comme le bisphénol A (BPA), génistéine et vinclozoline, ont démontré que générer émail hypomineralizations1,2,3 ,6,7,8. Des taches opaques blanches asymétriques ont été identifiés sur les incisives des rats exposés à une dose BPA de faibles doses pendant la période fœtale et le premier mois après la naissance1. Ces anomalies de l’émail chez les rats et celles des incisives molaire humaine hypomineralization (MIH), partagent des caractéristiques cliniques, structurales et biochimiques semblables. MIH est une pathologie décrite récemment l’émail dentaire, dont l’étiologie demeure encore peu clair9,,10 , malgré les nombreux facteurs de causalité ayant émis l’hypothèse9,10,11 ,,12.
Une autre pathologie de hypominéralisation émail important en raison de facteurs environnementaux est la fluorose dentaire (DF), qui est la conséquence d’une absorption excessive de fluorure (> 0,1 mg/kg/jour)13,14. La principale source de fluor est l’eau potable qui est complétée ou naturellement enrichie en fluor. Le fluorure est également souvent prescrit pour prévenir la carie dentaire, mais la dose prophylactique n’est que 50 % plus bas que le toxique un (≤ 0,05 mg/kg/jour). MIH et DF, deux pathologies fréquentes résultant de l’exposition à des facteurs environnementaux peuvent présenter des caractéristiques communes qui doivent être caractérisés en raison de la potentialisation des effets de hypomineralizing de fluorure combinée avec d’autres substances toxiques telles que le CDE2 ou amoxicilline15.
Micro-dissection de l’organe de l’émail rat contenant les améloblastes à des stades différents de la différenciation vous aidera à comprendre le mécanisme d’action des molécules capables de perturber l’activité Odam et causer des anomalies de l’émail d’être diagnostiqués après l’éruption de la dent. En d’autres termes, la caractérisation des modifications d’émail gene expression et émail composition de la matrice en raison des substances toxiques environnementales permet la reconstitution de l’histoire de l’exposition aux substances toxiques et facilite le contrôle de la sécurité environnementale pour le public santé.

<table><tbody><tr><td>Bisphénol A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>formol 10 %</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Réactif</td><td>Euromedex, France</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT tampon</td><td>Qiagen, Les Ulis, France</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>Anticorps anti-récepteur des androgènes</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>anticorps polyclonal de lapin</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330. A</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>paraplast régulier</td><td>Leica microsystems, Nanterre cedex,&nbsp ; France</td><td>39601006</td><td>appelé was/paraffine dans le tissu de texte</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de Bonn extra fins - Droits/8,5 cm</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Manche pour lames de scalpel - 12,5 cm</td><td>PHYMEP, Paris, France</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame de bistouri incurvée</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>Couteau à dissectionner - Pointe fine/droite</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>Couteau circulaire</td><td>PHYMEP, Paris, France</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>lames de scalpel n&deg ; 11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>lentille binoculaire</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&nbsp ; France</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-dissection de l’organe de l’émail des incisives mandibulaires de rats exposés à des substances toxiques environnementales

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Anomalies de l’émail résultant de conditions environnementales et les modes de vie sont des préoccupations de santé publique en raison de leur prévalence élevée. Ces défauts résultent de l’activité altérée des cellules responsables de la synthèse d’émail nommée améloblastes, qui présentent à l’organe de l’émail. Au cours de l’Amélogenèse, améloblastes suivent une séquence spécifique et précise des événements de la prolifération, la différenciation et la mort. Un rat sans cesse croissante des incisives est un modèle expérimental pour étudier les étapes de l’activité et la différenciation Odam dans des conditions physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode fiable et cohérente pour micro-disséquer organe de l’émail des rats exposés à des substances toxiques environnementaux. L’épithélium dentaire micro-disséqués contiennent des améloblastes de sécrétion et de maturation des stades qui peuvent être utilisés pour des expériences qualitatifs, tels que les dosages de l’immunohistochimie et hybridation in situ , ainsi que pour les analyses quantitatives telles que RT-qPCR, RNA-seq et éponger occidental.

Plusieurs émail défauts, tels que la fluorose dentaire12,13, peut résulter de conditions environnementales en raison de l’absorption excessive de fluorure ou d’un émail hypominéralisation semblable au MIH dus à l’exposition à des perturbateurs endocriniens1, 7,,22. Ces anomalies de l’émail du développement peuvent être reproduits expérim...

Comprendre les émail des altérations de la formation et, éventuellement, il faut l’étude de l’activité de l’Odam. Nous décrivons ici une méthode fiable et cohérente pour micro-disséquer les organes émail contenant des améloblastes de sécrétion et de maturation des stades qui peuvent être utilisés pour les procédures expérimentales quantitatives et qualitatives.

Micro-dissection de l’organe de l’émail des incisives mandibulaires de Rats exposés à des substances toxiques environnementales

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

L’objectif global de cette procédure est de micro-disséquer l’organe de l’émail du rat et de séparer l’épithélium dentaire en fonction des principales étapes de la différenciation cellulaire lors de la synthèse de l’émail. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des pathologies de l’émail telles que la fluorose dentaire, l’hyperémaillisation des incisives molaires et l’hérédité de la genèse imparfaite de l’émail. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’analyser davantage les cellules dentaires à l’aide d’expériences quantitatives telles que l’immunohistochimie sans aucun traitement préalable, ainsi que des investigations conséquentes telles que cette méthode peut fournir un aperçu de la mécanisation moléculaire de l’action des molécules endogènes et exogènes capables de perturber l’hémogenèse.Après avoir euthanasié un rat expérimental, retirez toute la peau des lèvres inférieures à l’aide d’un scalpel numéro 11 afin d’accéder facilement aux incisives inférieures. Ensuite, avec le même scalpel, faites une incision entre les deux incisives inférieures. En appliquant une légère pression, la mandibule se divisera alors en deux moitiés.Ensuite, coupez l’articulation temporo-mandibulaire avec le scalpel pour détacher la mâchoire tout en tenant l’hémi-mandibule avec une pince à épiler fine. Ensuite, coupez les tissus mous environnants avec un scalpel et retirez tous les muscles, tendons et ligaments à l’aide d’un grattoir jusqu’à ce que l’os soit complètement propre. Pour isoler l’incisive, rasez soigneusement l’os en plaçant la lame parallèlement au grand axe longitudinal de l’incisive.Commencez à vous raser au niveau de la crête osseuse, près des extrémités de l’incisive, et travaillez vers l’autre extrémité de l’incisive, près de l’anse cervicale. Ensuite, faites une incision avec le scalpel, distalement à l’anse cervicale pour retirer la gonion de l’hémi-mandibule, rendant ainsi l’incisive facile à retirer sans endommager l’anse cervicale ou le stade sécrétoire des améloblastes. Ensuite, faites une deuxième incision sous la deuxième molaire et insérez le scalpel entre l’os et la surface médiale de l’incisive.Lorsque tout l’os basal est soulevé, tournez l’incisive vers l’extérieur et retirez-la soigneusement à l’aide d’une pince à épiler fine pour éviter d’endommager le tissu des organes de l’émail. Maintenant, toute l’incisive est isolée. Pour la dissection, couvrez l’incisive avec 200 microlitres de PBS dans une boîte ou une assiette de 60 millimètres.Pour commencer, coupez l’anse cervicale, située immédiatement sur la partie apicale de l’incisive, comme décrit précédemment. Ensuite, saisissez l’incisive à l’aide d’une pince à épiler fine, avec la surface labiale vers le haut, et faites une marque de scalpel à l’extrémité de la partie incolore du tissu. Cette marque correspond à une tache blanche sous-jacente qui sera observable plus tard.Maintenant, utilisez une excavatrice ou un outil équivalent pour gratter la surface cellulaire de la marque à l’extrémité apicale, ce qui correspond à des améloblastes incolores au stade de sécrétion. Ensuite, faites une marque de scalpel au début de la partie orange, correspondant à l’étape de maturation des améloblastes et grattez de la marque de scalpel jusqu’à la pointe de l’incisive. Retirez maintenant les deux millimètres de tissu qui correspondent à l’étape de transition des améloblastes.N’ouvrez pas l’incisive pendant la dissection de l’organe de l’émail car cela contaminerait les tissus disséqués avec du mésenchyme. Enfin, conservez les tissus dans une solution de formol à 10 % ou de lyse pour des investigations plus approfondies. Pour une extraction de protéines à matrice émaillée, retirez brièvement l’incisive de la solution jusqu’à ce qu’une tache blanche devienne visible autour de la partie médiane de la surface labiale.Ce point représente l’initiation de la minéralisation de l’émail et correspond à la transition vers les améloblastes à un stade précoce. Coupez cette région de tissu et traitez-la au besoin. Si le tissu prélevé est destiné à l’extraction d’ARN cellulaire et de protéines, utilisez un kit commercial pour effectuer l’extraction.Transférez le tissu retiré dans la solution de lyse et broyez-le en un mélange homogène. Pour les analyses histologiques, l’immunohistochimie et l’hybridation NC2, mettez le tissu collecté dans du formol à 10 % pendant deux heures à température ambiante. Transférez ensuite le tissu dans du PBS et conservez-le à quatre degrés Celsius.Plus tard, le tissu peut être incorporé dans de la cire, de la paraffine ou de l’OCT tissulaire. Quatre groupes de rats à queue blanche mâles ont été constitués en fonction de leur exposition au fluorure en combinaison ou non avec le BPA. Tous les animaux ont été observés et disséqués au 65e jour, comme nous l’avons décrit.La qualité des tissus de l’émail micro-disséqués a été vérifiée à l’aide d’une coloration Masson trichrome. L’observation microscopique montre des cellules épithéliales de l’émail typiques et un palicide de l’améloblaste. L’absence de contamination mésenchymateuse a été attestée par l’absence de coloration verte du collagène.Les améloblastes au stade de sécrétion expriment l’émailline. Au stade de maturation, les améloblastes expriment la kalikine quatre et contiennent également des niveaux élevés de phératine, ce qui leur donne la capacité de stocker de grandes quantités de fer responsable de la couleur orange de l’émail. Ces ARN sont exprimés préférentiellement par les améloblastes plutôt que par les cellules mésenchymel.Le collagène, en revanche, est exprimé par les cellules mésenchymoles et non par les améloblastes. L’immunohistochimie a ensuite été utilisée pour marquer quatre protéines spécifiques dans les améloblastes au stade de sécrétion ou de maturation. Par exemple, un récepteur d’androgènes, vu en vert, est spécifiquement localisé aux améloblastes du stade de maturation.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de micro-disséquer, l’organe de l’émail des rongeurs pour une séparation réussie entre les étapes de sécrétion et de maturation des améloblastes. Cette approche est très utile pour la compréhension des mécanismes factoriels clés in vivo responsables des maladies pathologiques et physiologiques de l’émail.

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Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

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Micro-dissection de l’organe de l’émail des incisives mandibulaires de Rats exposés à des substances toxiques environnementales

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