Fractionnement pour la résolution des espèces de la huntingtine solubles et insolubles
27 février 2018
On décrit une méthode pour le fractionnement de la huntingtine mutante solubles et insolubles espèces de souris cérébrale et la culture cellulaire. La méthode décrite est utile pour la caractérisation et la quantification des flux de protéine huntingtine et sida en analysant l’homéostasie des protéines dans la pathogenèse de la maladie et en présence de perturbations
L’objectif général de cette procédure est de décrire un outil utile pour la visualisation, la caractérisation et la quantification du flux de protéines huntingtiniques pour l’analyse de l’homéostasie des protéines dans les systèmes modèles de la maladie de Huntington. Cette méthode peut nous aider à comprendre des questions dans les domaines de l’homéostasie des protéines et des maladies neurodégénératives, telles que la compréhension de l’impact de certaines interventions thérapeutiques sur la pathogenèse de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs d’isoler et de résoudre les espèces de protéines insolubles pour une analyse quantitative.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des changements biochimiques au cours de la pathogenèse de la maladie de Huntington, elle peut également être appliquée à d’autres maladies telles que la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. Pour commencer cette procédure, étiquetez deux jeux de tubes pour chaque échantillon comme solubles et insolubles. Préparez un tampon de lyse immédiatement avant la lyse de l’échantillon dans le tube soluble en ajoutant la quantité appropriée d’inhibiteurs.
Ensuite, ajoutez au tissu un tampon de lyse soluble de travail glacé complété par des inhibiteurs de protéase. Pour le tissu cérébral de souris, dénoncez lentement 30 fois dans un bec en verre d’un millilitre. Veillez à ne pas casser la surface du liquide car des bulles se formeront et pourraient entraîner une homogénéisation incomplète.
Ensuite, pipetez-le dans le tube insoluble étiqueté sur de la glace. Pour les lignées cellulaires, les cellules ont été plaquées à cinq fois 10 à la cinquième cellules dans chaque plaque à six puits et cultivées jusqu’à une quasi-confluence. Ensuite, rincez les cellules une fois avec du PBS 1X froid et retirez-le.
Appliquez ensuite un volume minimal de tampon de lyse sur les cellules et soulevez-les à l’aide d’un grattoir cellulaire. Ensuite, transférez l’homogénat ou le lysat cellulaire dans le tube insoluble marqué et laissez reposer sur de la glace pendant une heure. Pour les lysats cellulaires, triturez plusieurs fois pour briser les amas cellulaires avant de commencer l’incubation et éviter de former des bulles.
Pulsez brièvement chaque échantillon pendant une seconde à mi-chemin de la lyse. Après cela, centrifugez les échantillons à quatre degrés Celsius à 15 000 x g pendant 20 minutes. Retirez ensuite le surnageant.
Veillez à ne pas déranger la couche de granulés ou trouble car cela contaminerait la fraction. Pipeter le surnageant sous forme de fraction soluble dans le tube marqué soluble et le maintenir sur de la glace. Il est essentiel de garder une trace des tampons de lyse solubles et insolubles.
Le changement des tampons ou le placement du tampon insoluble ou des échantillons sur de la glace sera préjudiciable au résultat du protocole. Lavez le granulé avec 500 microlitres de tampon de lyse et centrifugez-le à quatre degrés Celsius à 15 000 x g pendant cinq minutes. Répétez le lavage une fois de plus.
Par la suite, retirez tout le tampon de lavage restant en ne laissant que la pastille de tissu. Ensuite, mettez le granulé en suspension avec un tampon de lyse complété par 4 % de SDS. Sonicez chaque échantillon pendant 30 secondes à température ambiante à l’aide d’un sondeur sonicateur.
La sonication de petits volumes pendant une longue période est un défi technique. Attention à ne pas perdre d’échantillon en émulsifiant ou en pulvérisant pendant cette étape. Ensuite, faites bouillir les échantillons pendant 30 minutes.
Ensuite, centrifugez-les brièvement à 6 000 x g. Par la suite, effectuez un dosage des protéines compatible avec les détergents ou un dosage des protéines Lowry pour mesurer la concentration des protéines. Ensuite, aliquotez les échantillons en lots de 50 microlitres pour éviter les problèmes de gel/dégel.
Dans cette étape, effectuez des western blots en diluant 30 microgrammes d’échantillon dans un rapport de un à un dans le tampon de chargement. Faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes et centrifugez-les brièvement à 6 000 x g. Ensuite, analysez les fractions par page SDS et western blot.
Teindre la membrane avec une coloration protéique entière pour visualiser l’efficacité de la charge en protéines. Voici les fractions solubles et insolubles des lysats de cellules HEK 293T résolues respectivement sur des gels de 4-12 % de Bis-Tris et de 3-8 % d’Acétate de Tris. La fraction soluble normalisée au contrôle de charge GAPDH montre une fluctuation du monomère soluble de l’exon 1 de la huntingtine mutante en fonction de l’exposition à l’inhibiteur de la protéase MG132.
La fraction insoluble montre que les espèces accumulées de huntingtine mutante de haut poids moléculaire sont également modulées par le traitement au MG132. Et voici les échantillons de fractions solubles et insolubles de lysats de cellules HeLA à l’aide de l’analyse par transfert Western et de retard de filtre. Les données montrent que la présence d’une isoforme SUMO surexprimée augmente à la fois le mutant de haut poids moléculaire et le mutant insoluble fibrillaire huntingtine dans la fraction insoluble.
Cette figure montre la régulation de l’accumulation de huntingtine mutante de haut poids moléculaire après modulation d’un traitement potentiel dans le fractionnement insoluble des cellules HeLa sur l’expression de l’exon 1 de la huntingtine 97Q. La cible thérapeutique PIAS1 a été soit réduite au silence par un siRNA vers PIAS1, soit surexprimée. Des fractions insolubles de stries de souris traitées avec des microARN contre PIAS1 et résolues sur des gels de 3-8 % d’acétate de tris montrent une modulation de la huntingtine insoluble de haut poids moléculaire.
N’oubliez pas que travailler avec NEM peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un masque facial doivent toujours être prises lors de l’exécution de ce protocole. Une fois maîtrisée, cette technique du lysat à la fin du fractionnement peut se faire en trois à quatre heures environ selon le nombre d’échantillons. Une heure supplémentaire doit être prévue pour la quantification et l’aliquotage des protéines.
Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’électrophorèse sur gel d’agarose ou le retard de filtre peuvent être effectuées afin de détecter respectivement les oligomères solubles ou les fibrilles insolubles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de résoudre les protéines insolubles mal repliées pour l’analyse quantitative.
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Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de fractionner les espèces de huntingtine mutante insolubles et solubles provenant du cerveau de souris et de cultures cellulaires. Cette technique facilite la caractérisation et la quantification du flux de la protéine huntingtine, contribuant ainsi à l'analyse de l'homéostasie protéique dans la maladie de Huntington et d'autres troubles neurodégénératifs.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Maladies neurodégénératives
Contexte
- La protéine huntingtine est impliquée dans la maladie de Huntington.
- La compréhension de l'homéostasie des protéines est cruciale pour la pathogenèse des maladies.
- Le mauvais repliement des protéines est une caractéristique commune à diverses maladies neurodégénératives.
- Cette méthode peut également être appliquée à l'étude des maladies de Parkinson et d'Alzheimer.
Objectif de l'étude
- Fournir un outil pour la visualisation et la quantification du flux de la protéine huntingtine.
- Analyser l'homéostasie protéique dans les modèles expérimentaux de la maladie de Huntington.
- Évaluer l'impact d'interventions thérapeutiques sur la progression de la maladie.
Méthodes utilisées
- Isolation des espèces protéiques solubles et insolubles.
- Préparation d'un tampon de lyse contenant les inhibiteurs appropriés.
- Analyse quantitative du flux protéique.
- Application de la méthode à divers modèles de maladies neurodégénératives.
Résultats principaux
- La méthode permet une isolation efficace des espèces de la protéine huntingtine.
- L'analyse quantitative révèle des informations sur l'homéostasie des protéines.
- Les résultats contribuent à la compréhension des mécanismes de la maladie.
- La technique présente un potentiel pour des applications plus larges dans les maladies liées au mauvais repliement des protéines.
Conclusions
- Cette méthode constitue un outil précieux pour l'étude de la maladie de Huntington.
- Elle améliore la compréhension des dynamiques protéiques dans la neurodégénérescence.
- Des applications futures pourraient s'étendre à d'autres maladies connexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie de distinguer quantitativement les espèces solubles et insolubles de la huntingtine mutante, offrant ainsi un aperçu mécanistique de l'homéostasie protéique dans les modèles de la maladie de Huntington. En isolant les agrégats de haut poids moléculaire pertinents pour la maladie, qui corrélatent avec les paramètres phénotypiques et la modulation thérapeutique, cette approche soutient la validation des cibles et la réduction des risques associés aux stratégies de modulation de HTT. Elle propose un flux de travail transposable applicable aux cultures cellulaires, aux tissus et à d'autres contextes de maladies neurodégénératives, renforçant la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'analyser le flux des espèces mutantes de la huntingtine afin de préciser les mécanismes pathogènes et de valider la huntingtine comme cible thérapeutique.
- Valeur opérationnelle : Fournit des mesures quantitatives des pools de huntingtine soluble et insoluble pour évaluer l'interaction avec la cible et la modulation de la voie.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille thérapeutique en reliant les modifications biochimiques des espèces de huntingtine à la progression de la maladie et à la réponse thérapeutique.
Développement de criblage et de tests
- Préparation des analyses : Génère des fractions solubles et insolubles standardisées, adaptées aux analyses en aval telles que le western blot, la rétention sur filtre ou la détection d'oligomères.
- Résultats quantitatifs : Permet une mesure précise de la concentration des espèces de HTT à l’aide de dosages protéiques compatibles avec les détergents, soutenant ainsi les analyses de réponse dose-dépendante et cinétiques.
- Reproductibilité : Des étapes définies de lyse, de centrifugation et de lavage assurent une fractionnation cohérente entre différents types d’échantillons, facilitant le transfert de l’analyse et son utilisation dans divers contextes fonctionnels.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Permet d'isoler des espèces de HTT de haut poids moléculaire qui sont corrélées au comportement des souris et modulées par des interventions thérapeutiques, permettant ainsi d'établir un lien entre phénotype et mécanisme.
- Continuité translationnelle : Facilite le passage de modèles in vitro à une validation sur tissus, en alignant les découvertes avec les évaluations d'efficacité préclinique.
- Réduction des incertitudes mécanistiques : Précise si les interventions ciblent les monomères solubles, les oligomères ou les agrégats insolubles, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant le mécanisme d'action.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, permettant de tester des hypothèses sur des stratégies ciblant HTT avant l'identification de composés leaders et la validation préclinique, grâce à des lectures quantitatives fondées sur la fractionation de l'homéostasie protéique.
- Découverte en biologie : Permet l'analyse mécanistique des voies de traitement, d'agrégation et d'élimination de la protéine HTT dans les modèles de maladie.
- Écrans : Prépare des fractions biochimiquement définies pour des criblages fiables de composés ciblant les espèces solubles ou insolubles de HTT.
- Analytique : Fournit des données quantitatives sur la concentration protéique et par immunotransfert afin de comparer les niveaux d'espèces de HTT selon différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Corrèle la fractionation de HTT dans les cellules et tissus avec des paramètres comportementaux et des marqueurs pathologiques dans les modèles précliniques.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude du mauvais repliement des protéines dans les modèles de maladies de Huntington, de Parkinson et d'Alzheimer.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la cible en précisant les contributions spécifiques à l'espèce de la HTT dans la pathogenèse et la réponse thérapeutique.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés de lyse, de fractionnement et de quantification des protéines.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en associant la modulation de la cible à des modifications mesurables des agrégats de HTT pertinents pour la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats visant la réduction de la HTT ou modulant l'agrégation, fondée sur la diminution des espèces insolubles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biochimie des protéines, en techniques de fractionnement et en analyse par immunotransfert (western blot).
- Dépend de l'accès à une centrifugeuse, à un sonicateur et à des réactifs compatibles, notamment le SDS et les inhibiteurs de protéases.
- Exige des protocoles standardisés entre les équipes afin d'éviter la contamination croisée des tampons et de garantir la pureté des fractions.
- Doit tenir compte de la variabilité de l'efficacité de l'homogénéisation tissulaire et de la sonication lors de l'application à différents modèles.
- Est limité par la nécessité d'une manipulation soigneuse pour éviter la perte d'échantillons lors des étapes de sonication et de resuspension, en particulier avec de petits volumes.
