Mise en culture des cellules épithéliales pigmentaire sur un modèle Ex Vivo de la Membrane de Bruch humain âgé

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de créer une matrice extracellulaire ex vivo connue sous le nom de système de culture membranaire de Bruch, qui observe l’effet de la membrane de Bruch sur la superposition des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés en sous-biologie de l’EPR dans le domaine de l’étiologie de la DMLA, par exemple si les changements sur les membranes de Bruch vieillissantes contribuent aux dysfonctionnements des cellules EPR superposées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs d’isoler la membrane de Bruch native d’un œil de donneur humain d’âges différents et de l’utiliser pour l’étude protéomique dans des cultures de cellules EPR.

Isoler la membrane de Bruch et créer un véritable système de culture vivo avec un minimum de dommages à la membrane indigène de Bruch est un défi, mais je vais vous montrer comment dans cette vidéo. Pour commencer, placez une gaze de 1,5 pouce carré imbibée de DMEM indépendant du CO2 dans une parabole de 100 millimètres. Chargez ensuite le globe oculaire sur la gaze.

Ensuite, utilisez une lame chirurgicale pour faire une incision à travers la sclérotique à trois millimètres en arrière du limbe. Ensuite, utilisez des ciseaux à lame fine pour faire une incision de pleine épaisseur et étendez circonférentiellement l’incision dans les deux sens autour de l’œil. Ensuite, retirez et jetez le segment antérieur, y compris la cornée, le cristallin et l’iris.

Jetez également le vitré et la rétine. Ensuite, décollez soigneusement le complexe choroïde membranaire de l’EPR Bruch de la sclérotique de la périphérie vers le nerf optique à l’aide d’une spatule recouverte de téflon. Cela doit être fait très soigneusement pour ne pas déchirer le complexe membranaire.

Maintenant, utilisez des ciseaux chirurgicaux fins pour faire quatre incisions radiales dans la sclérotique et décoller la sclère. Ensuite, coupez l’explant choroïde membranaire de Bruch du nerf optique et transférez cet explant dans une boîte de 60 millimètres contenant 0,02 molaire d’hydroxyde d’ammonium dans DPBS. Pour éliminer les cellules RPE natives, incubez cet explant pendant 20 minutes à température ambiante.

Après l’incubation, lavez l’explant trois fois à l’aide de DPBS en fixant le site du nerf optique sur la membrane de Bruch avec une pince recouverte de téflon tout en faisant circuler la solution autour du tissu. Ensuite, faites flotter l’explant, côté laminine vers le haut dans un milieu sans dioxyde de carbone. Faites quatre incisions sur la membrane de Bruch, puis transférez une membrane PTFE hydrophobe non laminée de 65 microns d’épaisseur avec des pores de 0,2 micron sur l’explant.

Réglez-le avec la lame basale contre la membrane PTFE. Retirez le liquide supplémentaire dans le plat, puis transférez l’ensemble dans un système de porte-filtre sous vide de microanalyse en verre où il doit reposer sur un support en verre fritté. Ensuite, tout en évitant soigneusement tout contact avec la lame basale, aplatissez les bords recourbés de la face choroïdienne à l’aide d’une pince enduite de téflon.

Maintenant, liquéfiez 15 millilitres d’agarose à 4 % dans du DPBS et refroidissez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, versez lentement l’agarose sur la face choroïdienne de l’explant tout en appliquant une légère aspiration pour le maintenir à plat. Une fois que le gel commence à se solidifier, transférez-le avec la membrane dans une boîte de 60 millimètres sur de la glace.

Laissez le gel se solidifier pendant deux à trois minutes, puis décollez la membrane en PTFE. Ensuite, immergez l’explant dans DPBS et stockez-le à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Lors de la culture de l’explant sur une parabole de 60 millimètres tapissée de 4 % d’agarose liquide, faites face vers le haut la membrane de Bruch.

Lors de la culture à l’aide d’une plaque de 96 puits doublée de polystyrène, placez l’explant de membrane de Bruch enrobé de gel sur une feuille de téflon plate avec la laminine face vers le haut. Ensuite, à l’aide d’un trépan, découpez six à huit boutons de six millimètres dans l’explant et transférez les boutons de tissu dans des puits chargés d’agarose liquide. Pour commencer, installez le globe oculaire sur une gaze imbibée de DPBS comme précédemment.

Ensuite, faites une incision circonférentielle à cinq millimètres sous le point de contact iris-sclérotique, la pars plana, dans l’espace sous-rétinien. Jetez le segment intérieur, l’humeur vitrée et la rétine. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, lavez l’œilleton avec deux à trois millilitres de DPBS froid.

Au total, lavez l’œilleton trois fois. Ensuite, pour dissocier les cellules RPE, traitez l’œilleton avec de la trypsine pendant 10 minutes maximum. Ensuite, transférez les cellules EPR trypsinisées dans un tube de 50 millilitres et, pour éteindre la réaction, ajoutez 25 millilitres de milieu avec FBS à 37 degrés Celsius.

Maintenant, centrifugez le mouchoir et la solution à 200 g pendant 10 minutes à 24 degrés Celsius. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans cinq millilitres de milieu complet DMEM avec 15 % FBS. Maintenant, comptez les cellules et placez 15 000 cellules EPR viables dans 200 microlitres de milieux essentiels minimum sans sérum contenant des antibiotiques sur chaque bouton de la membrane de Bruch dans la plaque de 96 puits.

Cultivez les cellules pendant au moins 24 heures pour les fixer. Plus tard, changez doucement le milieu pour réchauffer le DMEM complet et continuez la culture des cellules. À l’aide de ce protocole, les membranes de Bruch humaines âgées et malades peuvent être étudiées en cultivant des cellules EPR sur celles-ci.

En règle générale, les explants âgés diminuent le rattachement des cellules EPR. Les cellules EPR cultivées sur la membrane de Bruch humaine âgée sont également moins capables de phagocyter les segments externes des bâtonnets, une fonction essentielle de l’EPR. À l’aide de microréseaux, il a été constaté que l’expression des gènes des cellules RPE est différente lorsque les cellules sont cultivées sur la membrane de Bruch à partir d’individus plus âgés par rapport aux cellules cultivées sur la membrane d’individus plus jeunes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler la membrane de Bruch des yeux d’un donneur humain et de fabriquer des explants dans lesquels les cellules EPR peuvent être cultivées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas toucher le côté laminine de l’explant de membrane de Bruch avec des outils de dissection pour éviter d’endommager la surface.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la phagocytose de l’EPR et les études d’expression génique des cellules EPR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la question de savoir si la membrane de Bruch provenant d’un donneur d’âge variable ou de donneurs atteints de dégénérescence maculaire liée à l’âge affectera les fonctions des cellules EPR superposées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la dégénérescence maculaire liée à l’âge pour explorer le mécanisme de l’étiologie de la DMLA dans un système modèle de membrane de Bruch ex vivo.