Name: Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Découvrez l'imagerie dSTORM bidimensionnelle et bicolore des microtubules et filaments intermédiaires dans des cellules fixes U373. Cette méthode de super-résolution permet de caractériser les interactions cytosquelettiques inaccessibles à la microscopie conventionnelle.

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Nous remercions Mickael Lelek, Orestis Faklaris et Nicolas Bourg de discussions fructueuses, Andrey Aristov et Elena Rensen pour aider avec la technique de Super-résolution et Shailaja Seetharaman pour une lecture attentive du manuscrit. Nous tenons à souligner le Citech UtechS BioImaging photoniques (Imagopole) d’Institut Pasteur (Paris, France) ainsi que le réseau d’infrastructures de France-BioImaging pris en charge par l’Office National Français des recherches (ANR-10-INSB-04 ; Investissements d’avenir) et la Région Ile-de-France (programme Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) pour l’utilisation du microscope Elyra. Ce travail a été soutenu par la la Ligue Contre le Cancer et le Français National Research Agency (ANR-16-CE13-0019).

<ol><li>Herrmann, H., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Filaments%3A+Structure+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Intermediate Filaments: Structure and Assembly.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).</li>
<li>Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+crosstalk%3A+when+three+different+personalities+team+up%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).</li>
<li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filaments+in+cell+migration+and+invasion%3A+the+unusual+suspects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Gevaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Prize+in+Chemistry%3A+seeing+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale.</a> Nat Nanotechnol. 9 (11), 878(2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+samples+for+optimizing+STORM+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Dempsey, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+localization-based+super-resolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+neuronal+microtubule+organization+and+microtubule-associated+proteins+using+single+molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy.</a> Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li>
<li>Eliasson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filament+protein+partnership+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intermediate filament protein partnership in astrocytes.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).</li>
<li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microtubule-associated+motors+drives+intermediate+filament+network+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization.</a> J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).</li>
<li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+Intermediate+Filaments+Template+Microtubule+Networks+to+Enhance+Persistence+in+Cell+Polarity+and+Directed+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration.</a> Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-Orientation%3A+Quantifying+Simultaneous+Co-Localization+and+Orientational+Alignment+of+Filaments+in+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy.</a> PLoS One. 10 (7), e0131756(2015).</li>
<li>Yang, Z., Wang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein%3A+from+intermediate+filament+assembly+and+gliosis+to+neurobiomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker.</a> Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).</li>
<li>Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptomatic+spinal+metastases+of+intracranial+glioblastoma%3A+clinical+characteristics+and+pathomechanism+relating+to+GFAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression.</a> J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).</li>
<li>Hol, E. M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+and+the+astrocyte+intermediate+filament+system+in+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).</li>
<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytoma+grade+IV+%28glioblastoma+multiforme%29+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924(2015).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004(2013).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Étapes cruciales dans le protocole
Nous présentons ici un protocole qui minimise les artefacts dans les images dSTORM des microtubules et IFs dans les cellules gliales. Artefacts peuvent être créées à chaque étape de la préparation de l’échantillon et l’imagerie : fixation, blocage, immunomarquage, dérive pendant l’acquisition, non-optimale clignotant conditions23. Nous énumérons ci-dessous les étapes plus critiques.
Les lame...

Les filaments intermédiaires cytoplasmiques (IFs) sont 10 nm de diamètre homo - ou hétéropolymères d’un sous-ensemble spécifique de type cellulaire des protéines de l’IF. IFs participent dans une large gamme de fonctions cellulaires telles que les réponses de stress, la prolifération et la motilité cellulaire. Leur rôle essentiel est souligné par le fait que plus de 90 maladies humaines sont directement causées par des mutations dans les protéines de l’IF ; par exemple, les changements dans la composition de l’IF accompagne la croissance tumorale et la diffusion de1,2,3. Il est plus en plus évident que les trois systèmes de cytosquelette travaillent en collaboration pour contrôler les fonctions cellulaires tels que la polarisation de la cellule, division et migration2,3. Étant donné qu’un couplage étroit entre l’architecture spatiale et fonctions, il est crucial d’obtenir des aperçus de la structure de l’organisation de la fi avec les autres filaments et mieux comprendre la diaphonie du cytosquelette. Cet article fournit un protocole pour effectuer la Super-résolution technique dSTORM bicolores (stochastique optique Reconstruction examen microscopique direct)4 et comment il est utilisé pour étudier l’interaction entre le si et les microtubules en fixe, cultivés cellules en 2 dimensions (2D).
Plusieurs techniques de Super-résolution ont été développées au cours de la dernière décennie et là-bas découvertes furent à l’origine du prix Nobel de chimie en 20145. Parmi toutes ces techniques se trouve les seule molécule axées sur la localisation des méthodes comme PALM6 (microscopie de localisation Photo-Activated) qui utilise des protéines fluorescentes ayant, tempête de7 paires de fluorophores ou dSTORM4 avec des fluorophores classiques. Toutes ces méthodes sont basées sur le même principe qui consiste en (i) l’interrupteur de la plupart des journalistes fluorescentes dans un état « off » » l’état de (non fluorescent), (ii) l’activation stochastique d’une partie d'entre eux dans un fluorescent afin de localiser leurs position spatiale avec précision nanométrique et (iii) la répétition de ce processus afin d’activer autant de sous-ensembles de fluorophores que possible. Une image finale est reconstruite à l’aide de toutes les localisations des molécules activées, offrant une résolution latérale vers le bas pour ~ 20 à 40 nm. Plusieurs systèmes optiques commercialisés permettant PALM/STORM sont maintenant disponibles pour les biologistes pour expériences de routine. Ici, un tel système a été utilisé pour étudier l’association structurelle des microtubules et IFs. Parmi toutes les molécules simples axées sur la localisation méthodes, la technique de double-couleur dSTORM a été choisie, parce qu’il est bien adapté pour l’observation des régions lamellaires très minces (< 1 µm) des cellules adhérentes et peut apporter une amélioration significative de la résolution de l’image avec investissement minimal de temps et d’argent. En effet, dSTORM est une technique très pratique et polyvalente qui est compatible avec les colorants organiques standards couramment utilisées pour la coloration cellulaire et immunofluorescence.
Alors qu’une seule couleur dSTORM images sont relativement simples à obtenir en utilisant le fluorophore Alexa6478, dSTORM bicolore nécessite d’optimiser les conditions expérimentales afin que deux colorants peuvent clignoter correctement dans le tampon choisi, surtout si il est limité puissance du laser. Excellentes communications sont déjà disponibles sur les méthodes à mettre en place l’imagerie multicolore avec dSTORM9,10,11,12,13, et ces documents expliquent en détail les sources possibles de artefacts et la résolution de l’image dégradée ainsi que la façon de les surmonter. Dans cet article, les conditions expérimentales optimales en ce qui concerne la fixation des cellules, immunomarquage, préparation des échantillons, acquisition d’imagerie et la reconstruction de l’image sont décrits afin d’acquérir des images des réseaux denses de IF cytoplasmiques et microtubules dans cellules gliales avec dSTORM bicolores. En bref, la méthode d’extraction/fixation décrite à Chazeau et al.12 a été adaptée aux cellules gliales et utilisé avec une étape après fixation, concentration d’anticorps optimisée, un tampon de tempête avec 10 mM MEA décrit dans Dempsey9 et coll., qui a été jugées optimales pour l’expérimental mis en place et le type d’échantillon.
Les cellules gliales expriment principalement trois types de protéines IF : vimentine, nestin et GFAP (glial protéine fibrillaire acide). Ces trois protéines ont été montrés à polymériser conjointement dans les astrocytes14. Nous avons montré précédemment à l’aide de la microscopie d’illumination de Super-résolution structurée (SR SIM) que ces trois protéines IF se trouve dans le même filament unique de IF et qu’ils affichent semblables de distribution et de la dynamique dans les cellules gliales 15. En raison des similitudes entre les trois protéines IF, vimentine coloration a été utilisée comme reporter pour l’ensemble du réseau IF. À l’aide de dSTORM, nous avons réussi à résoudre Comment former des faisceaux IF le long des microtubules, qui n’était pas possible avec la diffraction limitée des techniques de microscopie15. Ces observations peuvent aider à comprendre comment la vimentine IFs peuvent microtubules modèle et réglementer leur trajectoire de croissance, favorisant le maintien d’un axe de polarité au cours de la migration de cellules16. Images de Super-résolution fourni des informations clées sur l’interaction mutuelle des deux sous-systèmes du cytosquelette et amené à mieux comprendre le lien entre l’association spatiale et la fonction locale qui pourrait être de type cellulaire spécifique17. En général, bicolores dSTORM peut servir à étudier la diaphonie entre les éléments du cytosquelette ou autres types d’organites, pourvu que l’immunomarquage bonnes conditions sont atteintes en termes de densité et de la spécificité. Cette technique sera utile pour mieux caractériser les cytosquelette des changements observés au cours de l’astrogliosis et dans le glioblastome, la tumeur plus malins et les plus courants du système nerveux central, où l’expression des protéines de l’IF est modifié 18 ,19,20,21.

<table><tbody><tr><td>Milieu essentiel minimum (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>culture cellulaire</td></tr><tr><td>acide aminé non essentiel</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>culture cellulaire 1/100e</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>culture cellulaire 1/100e</td></tr><tr><td>F&oelig ; tal Sérum bovin</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>culture cellulaire 1/10e</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>culture cellulaire</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>fischer scientific</td><td>11540486</td><td>lamelle de culture cellulaire</td></tr><tr><td>18 mm n&deg ; 1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>lamelles de</td></tr><tr><td>paraformaldéhyde (PFA) solution</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>fixation cellulaire</td></tr><tr><td>glutaraldéhyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>fixation cellulaire</td></tr><tr><td>triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>tensioactif non ionique. Utilisé pour la fixation cellulaire</td></tr><tr><td>borohydrure de sodium (NaBH4)</td><td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>fixation cellulaire</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>passivation de l’échantillon 3 % dans l’anticorps</td></tr><tr><td>monoclonal anti-vimentine (V9) PBS produit chez la souris</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>anticorps primaires</td></tr><tr><td>anti rat anti alpha tubuline</td><td>Biorad</td><td>MCA77G</td> anticorps <td>primaires</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires anti-IgG (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 555</td><td>Fisher scientific</td><td>10635923</td><td>anticorps secondaires</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires anti-IgG de souris (H+L), Alexa Fluor 647</td><td>Fisher scientific</td><td>10226162</td><td>anticorps secondaires</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0,1 & micro ; m, bleu fluorescent/vert/orange/rouge foncé</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td><td>perles fluorescentes</td></tr><tr><td>Chambre magnétique Chamlide</td> Live <td>Cell Instrument</td><td>CM-B18-1 porte-échantillon</td><td>magnétique, volume maximum 1,2 mL</td></tr><tr><td>Cysteamine (MEA)</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>pour le tampon clignotant</td></tr><tr><td>glucose oxydase d’Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>pour le tampon</td></tr> <tr>clignotant<td>glucose</td><td>sigma</td><td></td><td>pour le tampon clignotant</td></tr><tr><td>catalase du foie bovin</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>pour le tampon clignotant</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>pour le tampon clignotant</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry porte-lamelles</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>nettoyeur à ultrasons à</td> film de paraffine<td>Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td>nettoyeur plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie des filaments intermédiaires et microtubules avec directes 2 dimensions de reconstruction stochastique optiques de microscopie

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Le cytosquelette, composé de microfilaments d’actine et les microtubules filaments intermédiaires (si), joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la polarité et la motilité. L’Organisation des réseaux actine et les microtubules a été particulièrement étudiée, mais celui d’IFs n’est pas encore pleinement caractérisée. IFs ont un diamètre moyen de 10 nm et forme un réseau s’étendant dans tout le cytoplasme de la cellule. Ils sont physiquement associés d’actine et les microtubules grâce à des moteurs moléculaires et linkers du cytosquelette. Cette association étroite est au cœur des mécanismes de réglementation qui assurent la régulation coordonnée des trois réseaux du cytosquelette requis pour la plupart des fonctions cellulaires. Il est donc indispensable de visualiser IFs seuls et aussi avec chacun des autres réseaux du cytosquelette. Cependant, les réseaux de IF sont extrêmement denses dans la plupart des types de cellules, en particulier dans les cellules gliales, qui rend sa résolution très difficile à réaliser avec la microscopie en fluorescence standard (latéral résolution de ~ 250 nm). Microscopie de Reconstruction stochastique optique directe (dSTORM) est une technique qui permet un gain en résolution latérale d’un ordre de grandeur. Ici, nous montrons que la résolution latérale dSTORM est suffisante pour résoudre l’organisation dense des réseaux IF et, en particulier, des faisceaux de IF entourant les microtubules. Serré de ces associations sont susceptible de participer à la régulation coordonnée de ces deux réseaux et mai, expliquer comment modèle IFs vimentine et stabiliser l’Organisation des microtubules ainsi que pourraient influencer microtubule dépendant du trafic vésiculaire. Plus généralement, nous montrons comment l’observation des deux composants du cytosquelette avec bicolores dSTORM technique apporte nouvel aperçu de leur interaction mutuelle.

Un microscope équipé de caméra de 512 x 512, un alpha Plan Apo 100 X 50 mW 405 nm et les 100 mW 488, 561 et 642 nm à semi-conducteurs lasers, une EMCCD / 1,46 objectif et Band passent 570-650 / passent longtemps 655 filtres d’émission a été utilisé pour les résultats représentatifs présentés ci-dessous.
Figure 1 a donne un exemple de la densité de la molécule et de signal / bruit qui doit être utili...

L’objectif global de cette méthodologie est de donner les conditions expérimentales optimales de préparation des échantillons pour l’acquisition d’images et de la reconstruction afin d’effectuer des images dSTORM 2D bicolore des microtubules et des filaments intermédiaires dans les cellules fixes

Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

L’objectif global de cette méthodologie est de créer les conditions expérimentales optimales, de la préparation de l’échantillon à l’acquisition et à la reconstruction d’images, afin d’effectuer une imagerie 2D bicolore D-STORM de microtubules et de filaments intermédiaires dans des cellules fixes. Cette méthode peut aider à caractériser les interactions physiques entre les réseaux cytosquelettiques denses et complexes tels que les filaments intermédiaires et les microtubules. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’observer des structures cellulaires, qui ne sont pas résolues avec la microscopie à fluorescence conventionnelle.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le contrôle de la préparation des échantillons et l’acquisition des données de liaison de robe sont cruciaux afin de limiter la génération d’artefacts. Après avoir cultivé des cellules U373 selon le protocole texte, fixez les cellules en utilisant d’abord du PBS pour les laver une fois. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez un millilitre par puits de solution de fixation d’extraction préchauffée.Incuber les cellules à température ambiante pendant 60 secondes. Ensuite, retirez la

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Biologie

Nous décrivons une méthode de microscopie corrélative qui combine la microscopie à haute vitesse 3D de cellules vivantes fluorescent lumière et de haute résolution tomographie cryo-électronique. Nous démontrons la capacité de la méthode corrélative par imagerie dynamique, les petites VIH-1 particules en interaction avec des cellules HeLa d'accueil.

Microscopie corrélative pour l&#39;analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Les informations spatio-temporelles sur les protéines dynamiques à l’intérieur des cellules vivantes sont cruciales pour comprendre la biologie. Un type de microscopie à super-résolution appelé microscopie à illumination rapide structurée en 3D (f3D-SIM) révèle des informations uniques sur l’anneau cytocinétique Z chez les bactéries : à la fois son apparence en forme de perle et la dynamique rapide de FtsZ à l’intérieur de l’anneau.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

Pour étudier les vitesses d’écoulement et la directionnalité de l’actine filamenteuse au niveau de la synapse immunologique des lymphocytes T, l’imagerie à super-résolution des cellules vivantes est combinée à la fluorescence par réflexion interne totale et quantifiée par spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Nous présentons un protocole pour l'application de localisation interférométrique photoactive Microscopie (iPALM), une méthode nanoscope trois dimensions molécule unique de localisation, à l'imagerie du cytosquelette d'actine dans les cellules de mammifères adhérentes. Cette approche permet la visualisation à base de lumière des caractéristiques structurelles nanométriques qui autrement resteraient en suspens par microscopie optique à diffraction limitée classique.

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Ce protocole est un guide pour la mise en œuvre de la microscopie de réflexion d'interférence sur un microscope de fluorescence standard pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette, à contraste élevé, des microtubules utilisant des essais in vitro de surfaces.

Mise en œuvre de la microscopie de réflexion sur les interférences pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette des microtubules

La microscopie optique à base de puces est une nouvelle approche de la microscopie à fluorescence et offre des avantages en termes de rentabilité et de débit. Ici, les protocoles de préparation et d'imagerie des puces sont présentés pour la microscopie TIRF et la microscopie super-résolution basée sur la localisation.

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est utilisée pour contourner la limite de diffraction typique de la microscopie optique et pour visualiser les exosomes à l’échelle nanométrique. Il peut être utilisé en deux et trois dimensions pour caractériser les exosomes.

Microscopie à reconstruction optique stochastique directe de vésicules extracellulaires en trois dimensions

Ici, un essai de reconstitution in vitro basé sur la microscopie TIRF est présenté pour quantifier et comparer simultanément la dynamique de deux populations de microtubules. Une méthode est décrite pour visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs protéines associées aux microtubules sur des faisceaux de microtubules réticulés et des microtubules simples.

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Nous présentons un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie interférence-réflexion et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de protéines associées à des microtubules marquées par fluorescence.

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

La microscopie dynamique différentielle (DDM) combine les caractéristiques de la diffusion dynamique de la lumière et de la microscopie. Ici, le processus d’utilisation du DDM pour caractériser les réseaux de cytosquelettes reconstitués en quantifiant la dynamique sous-diffusive et en cage des particules dans les réseaux de vimentine et le mouvement balistique des composites actifs actine-microtubules entraînés par la myosine est présenté.

Quantification de la dynamique du cytosquelette à l’aide de la microscopie dynamique différentielle

Ce protocole décrit en détail comment construire un microscope à fluorescence à feuillet de lumière à objectif unique et son utilisation pour visualiser les réseaux de cytosquelettes.

Conception et construction d’un microscope à fluorescence à feuillet de lumière personnalisable à objectif unique pour la visualisation des réseaux de cytosquelettes

Découvrez l'imagerie dSTORM bidimensionnelle et bicolore des microtubules et filaments intermédiaires dans des cellules fixes U373. Cette méthode de super-résolution permet de caractériser les interactions cytosquelettiques inaccessibles à la microscopie conventionnelle.

Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie

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