Imagerie des Filaments intermédiaires et Microtubules avec directes 2 dimensions de Reconstruction stochastique optiques de microscopie

L’objectif global de cette méthodologie est de créer les conditions expérimentales optimales, de la préparation de l’échantillon à l’acquisition et à la reconstruction d’images, afin d’effectuer une imagerie 2D bicolore D-STORM de microtubules et de filaments intermédiaires dans des cellules fixes. Cette méthode peut aider à caractériser les interactions physiques entre les réseaux cytosquelettiques denses et complexes tels que les filaments intermédiaires et les microtubules. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’observer des structures cellulaires, qui ne sont pas résolues avec la microscopie à fluorescence conventionnelle.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car le contrôle de la préparation des échantillons et l’acquisition des données de liaison de robe sont cruciaux afin de limiter la génération d’artefacts. Après avoir cultivé des cellules U373 selon le protocole texte, fixez les cellules en utilisant d’abord du PBS pour les laver une fois. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez un millilitre par puits de solution de fixation d’extraction préchauffée.

Incuber les cellules à température ambiante pendant 60 secondes. Ensuite, retirez la solution et ajoutez un millilitre par puits de PFA 4 % fraîchement préparé et préchauffé dilué dans un tampon de cytosquelette. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Retirez ensuite le PFA et ajoutez trois millilitres de PBS par puits. Utilisez du PBS pour laver les cellules deux fois. Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 10 millimolaires de borohydrure de sodium fraîchement préparés dilués dans du PBS afin d’éteindre l’autofluorescence du glutaraldéhyde.

Incuber les cellules à température ambiante pendant sept minutes et transférer le borohydrure de sodium recyclé dans un bac spécifique. Utilisez PBS pour laver les puits trois fois pendant cinq minutes chacune. Retirez ensuite le PSB et ajoutez 5 % de BSA dans PBS comme solution de blocage.

Après l’immunomarquage des échantillons et la préparation des solutions dans des tampons conformément au protocole textuel, montez la lamelle contenant les cellules marquées sur un porte-échantillon magnétique. Et ajoutez le tampon d’imagerie pour remplir complètement la chambre. Appliquez le couvercle et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air entre le tampon d’imagerie et le couvercle.

À l’aide d’éthanol absolu, nettoyez le fond de l’échantillon et vérifiez qu’il n’y a pas de fuites. Ensuite, si nécessaire, utilisez de la graisse pour bien sceller la retenue de l’échantillon. Pour effectuer l’imagerie, allumez le microscope et le logiciel d’acquisition.

Configurez les paramètres d’acquisition en fonction du protocole texte, à l’aide de l’objectif NA 1.46 100x, de l’objectif Optivar 1,6 fois et du mode UHP TIRF. Créez une piste 647 pour imager les filaments de vimentine étiquetés avec Alexa Fluor 647. Sélectionnez les lignes laser de 405 et 642 nanomètres et le filtre d’émission LP 655.

Ensuite, créez une piste 555 pour imager les microtubules marqués avec Alexa Fluor 555. Sélectionnez les lignes laser nanométriques 561, 488 et 405 pour imager les fluorophores et le filtre d’émission BP 570 à 650. Ensuite, ajoutez de l’huile dans l’objectif et placez l’échantillon sur la lentille.

Ensuite, sélectionnez l’onglet de localisation et ouvrez l’obturateur de la lampe à fluorescence. Trouvez la mise au point et utilisez l’oculaire pour rechercher les cellules à imager. Utilisez ensuite le joystick pour positionner les cellules au centre du terrain.

Cliquez sur l’onglet acquisition pour revenir en mode acquisition. Sélectionnez ensuite la piste 647 et réglez la puissance laser 642 sur 0,2 % et la puissance laser 405 sur sa valeur minimale. Réglez le temps d’exposition sur 50 millisecondes et le gain sur 50.

Choisissez ensuite le mode d’acquisition continue pour observer la cellule à l’écran. Assurez-vous qu’il y a au moins une perle fluorescente dans le champ de vision. Utilisez un mode de mise à l’échelle automatique pour l’affichage et ajustez la mise au point.

Ensuite, prenez une image d’épifluorescence à grand champ du réseau de vimentine en cliquant sur snap et enregistrez l’image. Pour vérifier l’éclairage TIRF, cliquez sur TIRF, appuyez sur continu, ajustez les paramètres d’acquisition afin d’avoir un champ d’éclairage homogène. Appuyez ensuite sur snap et enregistrez l’image.

Vérifiez la piste 555. Décochez la piste 647 et sélectionnez la piste 555. Prenez une image d’épifluorescence du réseau de microtubules et enregistrez-la.

Ensuite, prenez une image TIRF et enregistrez-la. Maintenant, vérifiez la piste 647. Décochez la piste 555 et sélectionnez la piste 647.

Réglez le gain à zéro et le temps d’exposition à 10 millisecondes. Appuyez ensuite en continu. Réglez la puissance laser de 642 nanomètres à 100 % afin de pomper la plupart des colorants Alexa 647 à l’état sombre.

Une fois que les fluorophores commencent à clignoter, augmentez l’exposition à 15 millisecondes et le gain à 300. Utilisez le mode d’indicateur de portée pour vérifier que les signaux d’une seule molécule ne saturent pas la caméra comme indiqué par la couleur rouge. Dans ce cas, diminuez le gain jusqu’à ce que la saturation disparaisse.

Les billes resteront saturées au début de l’acquisition. Appuyez sur stop pour arrêter l’observation de la cellule. Développez l’outil de traitement en ligne et cliquez sur Traitement en ligne PALM pour visualiser l’image STORM pendant l’acquisition.

Utilisez neuf pour la taille maximale du masque et six pour l’intensité maximale du bruit. Maintenant, appuyez sur démarrer l’acquisition. Lors de l’acquisition, refaites le point sur la cellule si nécessaire.

Ajustez le temps d’exposition et activez éventuellement la ligne laser de 405 nanomètres à partir de 0,001 % pour maintenir une densité moyenne de fluorophores avec une distance minimale d’un micromètre entre les molécules uniques. Assurez-vous que le pic de précision de localisation sur l’histogramme sous l’image reconstruite est centré autour ou en dessous de 10 nanomètres. Appuyez sur stop pour terminer le film lorsque plus d’un million de localisations ont été atteintes.

Sauvegardez les données brutes de l’acquisition STORM au format CZI. Ensuite, dans l’outil Canaux, vérifiez la piste 555, décochez la piste 647 et sélectionnez la piste 555. Ensuite, appuyez sur le bouton continu.

Réglez le temps d’exposition à 30 millisecondes et le gain à zéro. Réglez ensuite les lasers 488 et 561 à 100 % pour pomper les colorants Alexa 555 à l’état sombre. Utilisez le mode d’éclairage HILO.

Une fois les fluorophores épuisés, appuyez sur stop. Réglez le gain sur 250 et diminuez le laser 488 à 50 %Utilisez l’indicateur de portée pour vérifier que les molécules uniques ne saturent pas la caméra. Si c’est le cas, diminuez le gain.

Maintenant, appuyez sur démarrer l’acquisition. Lors de l’acquisition, augmentez progressivement le gain pour atteindre la limite de saturation. Augmentez pas à pas la puissance laser de 405 nanomètres pour activer les molécules et atteindre une densité moyenne dans le champ de vision.

Diminuer la puissance du laser 488 nanomètres à 30 % lorsque le laser 405 est d’environ 15 %, puis diminuer progressivement le 488 tout en augmentant la puissance du laser 405 afin de maintenir le clignotement des molécules aussi rapide que possible et avec une densité moyenne. La ligne laser 488 couplée au laser d’excitation 561 à l’intensité maximale augmente à la fois les taux d’activation et d’extinction des fluorophores, tandis que la ligne laser 405 n’augmente que le taux d’activation. Arrêtez l’acquisition lorsque 500 000 localisations ou plus ont été atteintes ou lorsqu’aucune molécule ne clignote.

Sauvegardez ensuite les données brutes de l’acquisition STORM au format CZI. Pour effectuer la reconstruction d’image à l’aide de l’outil PAL-Drift, choisissez le type de correction basé sur le modèle avec des segments automatiques d’une taille maximale de huit. Appuyez sur appliquer plusieurs fois de suite jusqu’à ce que la dérive soit corrigée.

Cette correction basée sur un modèle applique un algorithme basé sur une analyse de corrélation croisée, qui corrige la dérive. À l’aide des outils de filtrage PAL, améliorez l’apparence de l’image STORM en sélectionnant uniquement les molécules les mieux localisées. Par exemple, limitez la précision de localisation à 30 nanomètres et la PSF à 120 à 180 nanomètres.

Avec l’outil PAL-Render, utilisez une résolution de pixels de cinq ou 10 nanomètres et des paramètres selon le protocole texte. Sélectionnez Rendu automatique plage dynamique HR avec une valeur de 95 % et Rendu automatique plage dynamique SWF avec une valeur de 90 %. Sélectionnez ensuite le rendu de la meilleure qualité.

Dans le menu PALM de l’onglet de traitement, sélectionnez PALM convert. Appuyez sur sélectionner, puis sur Appliquer. Enfin, enregistrez l’image créée au format LSM et non CZI.

Cette figure montre un exemple typique d’une image D-STORM de filaments de vimentine immuno-marqués avec Alexa 647. L’augmentation de la résolution est clairement observée par comparaison avec l’image acquise avec un microscope standard à grand champ. Les profils d’intensité de fluorescence présentés dans ce graphique montrent que l’imagerie microscopique à super résolution permet la résolution des faisceaux de vimentine.

La résolution D-STORM est suffisante pour compter le nombre de filaments présents dans les faisceaux. Voici un exemple typique de l’imagerie D-STORM bicolore des réseaux de vimentine et de microtubules immunomarqués avec Alexa 647 et Alexa 555, respectivement. Les bonnes images de vimentine doivent avoir au moins 5 000 localisations par micromètre carré et 2 500 par micromètre carré pour les microtubules.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle a bien fonctionné. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’adapter les méthodes de fixation et de paramétrisation à la protéine qui serait imagée. Par exemple, la fixation avec uniquement du glutaraldéhyde donne de mauvais résultats pour les filaments intermédiaires, mais est la meilleure pour la fixation des microtubules.

Il est important de ne pas oublier d’utiliser des échantillons et des solutions fraîchement préparés, en particulier du MEA, dont le pH doit être soigneusement ajusté. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la morphologie des structures cellulaires nanoscopiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des échantillons, de l’acquisition d’images et de la reconstruction d’images 2D bicolores D-STORM de filaments intermédiaires et de microtubules.

N’oubliez pas que travailler avec certaines solutions, en particulier le PFA, le NABH4 peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants, le travail sous la cagoule chimique et l’utilisation de bacs spécifiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.