Name: Échantillonnage de Sap de phloème de Brassica napus pour 3D-PAGE des protéines et des Complexes ribonucléoprotéiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Apprenez à isoler et analyser les complexes protéiques et ribonucléoprotéiques du phloème de Brassica napus par électrophorèse 3D-PAGE. Cette méthode permet la séparation simultanée des protéines et des acides nucléiques.

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Nous remercions Jennifer Deke et Urszula Zarzenska pour leur soutien scientifique. Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention de l’intégration professionnelle (CIG, 0734 PCIG14-GA-2013-63) par la Commission européenne au sein du 7e programme-cadre, la subvention LFF-GK06 « DELIGRAH » (Landesforschungsförderung Hamburg) et l’octroi de la DFG (DFG KE 856_6-1) attribué à JK.

1. l’échantillonnage et préparation de sève de b. napus plantes 4,8,20
<ol><li>Pour sève d’échantillonnage, utilisez bien arrosées 8 semaines cette floraison initial seulement voir l’afin d’éviter des contaminations de pollen de plantes de b. napus .</li>
	<li>Utiliser une aiguille hypodermique (Ø 0,8 mm) et ponctuée de l’inflorescence la tige plusieurs fois. Répétez à plusieurs autres tiges d’inflorescence et sur d’autres plantes pour obtenir assez sève (Figure 2 a). Remarque : Pour des analyses complexes, il est recommandé de commencer au moins 600 µL de sève. 4 à 5 plantes produiront entre 200 et 700 µL de sève.</li>
	<li>Essuyer la première goutte sur les sites accidentés avec filtre papier. Principalement, ces gouttes contiennent des matières hautement contaminés d’entourant les tissus lésés et doivent être jetés.</li>
	<li>Recueillir les gouttes suivants de pipetage et stocker l’exsudat recueilli dans un tube à essais préalablement réfrigérées conique 1,5 mL à-20 ° C à l’aide d’un système de refroidissement sans glace.</li>
	<li>Poursuivre la collecte jusqu'à ce qu’aucune autre formation de goutte n’est observable, mais pas plus de 1 h. Cette procédure peut être répétée après deux jours sans perte significative de sève recueillie. Remarque : La sève recueillie peut être utilisée immédiatement ou stockée à-80 ° C pour des analyses. Pour le stockage de-80 ° C,-congélation le tube de réaction dans l’azote liquide.</li>
	<li>Concentrer l’échantillon de phloème à environ 1/6ème de son volume initial à l’aide de concentrateurs centrifuges avec un poids moléculaire coupé (MWCO) de 10 000 Daltons (Da). Centrifuger l’échantillon concentré à 4 ° C et 20 000 x g pendant au moins 15 min enlever les particules de poussière. NOTE : Concentration de sève de phloème ne conduit pas à une perte importante de protéines.</li>
	<li>Pour leur analyse complexe, passez à l’étape 3.1.</li>
</ol>2. contrôle de pureté du phloème sap à l’aide de la reverse transcriptase PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>Isoler l’ARN total de sève à l’aide d’une méthode d’extraction de RNA standard pour matières liquides (p. ex. TRIzol ou phénol-chloroforme extraction suivie d’isopropanol précipitation de la phase aqueuse et d’éthanol lavage étapes selon la Protocole du fabricant). ATTENTION : Phénol-chloroforme est toxique. Travailler sous une hotte avec équipement de protection individuelle appropriés. L’ARN extrait peut être conservée dans l’éthanol à-80 ° C pendant jusqu'à six mois.</li>
	<li>Élimination des contaminants de l’ADN par digestion avec la DNase I (1 u/µg) pour 45 min à 37 ° C et inactiver les enzymes en ajoutant EDTA à une concentration finale de 5 mM et incuber l’échantillon à 75 ° C pendant 10 min.</li>
	<li>Pour obtenir des RNA pur, purifier et concentrer l’échantillon par une autre étape de purification (par exemple à l’aide de Kits de nettoyage de RNA, selon les instructions du fabricant).</li>
	<li>Effectuer une reverse transcriptase PCR (RT-PCR) pour la synthèse de cDNA avec un kit de synthèse de cDNA en utilisant 150 ng d’ARN pur tel que décrit par le fabricant du protocole. Remarque : L’ADNc peut être stocké à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
	<li>Utiliser 5 µL de l’ADNc comme modèle pour une réaction de PCR standard tel que spécifié par le fabricant, pour amplifier les transcriptions de compartiment spécifique et vérifier par électrophorèse sur gel d’agarose. Confirmer la pureté des échantillons de phloème par exemple à l’aide d’amorces pour la petite sous-unité de rubisco, thiorédoxine h et la protéine de capside du pollen (Figure 1 b, tableau 1).</li>
</ol>3. bleu natif PAGE 4,25,26,31
<ol><li>Utiliser soit coulé des gels natifs de dégradé comme décrit ailleurs27 ou commerciales gels de gradient de Bis-Tris.</li>
	<li>Charge de 20 à 30 µg de l’échantillon de concentré de protéine / puits sur le gel en triplicates au moins.</li>
	<li>Exécutez le gel à 4 ° C et 150 V à l’aide de buffer de cathode bleu foncé B et anode (tableau 2) jusqu'à ce que l’échantillon passé 1/3rd du gel (env. 20 à 30 min, Figure 3 a). Remarque : Pour le transfert de Northern, une voie unique de gel est suffisante, tandis que pour l’analyse de la composition en protéines par PAGE 3D et spectrométrie de masse qu'il est recommandé de combiner la même bande de jusqu'à dix voies de gel pour concentrer les protéines moins abondantes.</li>
	<li>Interrompre la course et échange cathode bleu foncé tampon B cathode bleu clair tampon B/10 (tableau 2) et continuer la course. Terminer le gel exécuté au démarrage de la façade bleue éluer hors gel (environ 120 à 180 min, Figure 3 a). Remarque : Le gel natif bleu fini peut être stocké à 4 ° C pendant au moins une semaine. Une conservation prolongée peut conduire à diffuser des bandes et devrait être évitée. Tampon bleu foncé B puisse être réutilisé.</li>
</ol>4. facultative : Détection de l’ARN à l’aide de bleu natif du Nord buvard 4
<ol><li>Découper des bandes distinctes ou utiliser la voie de tout gel de gel bleu natif et transférez-les sur une membrane de nylon par demi-sec buvard à 3,5 mA/cm2 pour 60 min et marquer la frontière gel supérieur et inférieur avec un crayon sur la membrane (Figure 4 a).</li>
	<li>Après avoir éponger, laver la membrane avec de l’eau traitée DEPC et sécher entre deux papiers filtres.</li>
	<li>Effectuer des UV-réticulation de la membrane buvardages avec 120 000 MJ/cm2 (85 s si vous utilisez la RETICULATION dans la Table des matières).</li>
	<li>Les hybrider la membrane avec 6 mL de tampon d’hybridation (commercial ou autodidacte) pendant 60 min à 68 ° C dans un four à hybridation (Figure 4 a).</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’un tampon d’hybridation contenant 4 µL de sondes de 3'-biotinylé supplémentaire (100 nM).</li>
	<li>Incubez la membrane avec la sonde du jour au lendemain, en refroidissant le four de 68 ° C à 37 ° C.</li>
	<li>Nettoyer la membrane avec un tampon contenant 2 SDS x SSC et 0,1 %, pendant 5 min à température ambiante pour retirer les sondes liés besoin. ATTENTION : SDS peut causer des irritations. Porter des gants et blouse de laboratoire lorsque vous travaillez avec le SDS et SDS contenant des solutions.</li>
	<li>Effectuer la détection des sondes de 3'-biotinylé sur la membrane par exemple avec un conjugué streptavidine-HRP et le luminol comme substrat peroxydase de raifort (HRP) raifort, entraînant une réaction chimiluminescente sensible (Figure 4 a).</li>
</ol>5. deuxième dimension : Tris-Tricine-urée PAGE 4,28
<ol><li>Des bandes individuelles de gel bleu natif de l’accise. Combiner les bandes d’échantillons sur des voies parallèles pour atteindre une concentration supplémentaire de protéines complexes (Figure 5). NOTE : Bandes excisées peuvent être stockés dans tubes de réaction unique jusqu'à utilisation ultérieure à 4 ° C.</li>
	<li>Versez un gel de Tris-Tricine-urée de 12 % (épaisseur de 1 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (largeur x longueur)). Préparer le gel de séparation (tableau 2), 10 mL de la solution de gel A verser entre deux plaques de verre et de superposition avec de l’isopropanol. Supprimer l’isopropanol après que la polymérisation est terminée et le transfert de 4 mL de solution de gel B (tableau 2) pour le gel de concentration sur le gel et insérer qu'un 10 bien peigner. ATTENTION : L’acrylamide non polymérisée peut être neurotoxique et TEMED est nocif par inhalation. Toujours porter un équipement de protection individuelle et travailler sous une hotte.</li>
	<li>Transférer les bandes de gel excisées dans un tube de réaction de 1,5 mL et ajouter 1 mL de 2 x SDS solution tampon pour l’équilibration des pièces gel (Figure 5, tableau 2).<ol>
<li>Incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante, avant de faire bouillir dans un bloc chauffant (95 ° C) ou dans un four à micro-ondes et incuber les échantillons à nouveau à température ambiante pendant 15 minutes supplémentaire.</li>
		<li>Empilez plusieurs morceaux de gel équilibré qui représente le même complexe dans un gel unique poche.</li>
		<li>Effectuer l’électrophorèse de l’anode et la cathode exécutant des tampons à 150 V pendant 45 à 60 min et la voie gel toute l’accise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber la voie coupée pendant 20 min dans un tampon acide (Tris, d’acide acétique 100 mM 100 mM) et équilibrer en 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 pendant 20 min (Figure 5).</li>
</ol>6. troisième dimension : SDS-PAGE 4,32
<ol><li>Versez une SDD 15 % séparant gel selon Laemmli32 (épaisseur : 1,5 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (largeur x longueur)) (tableau 2) et ajoutez une fine couche d’un 4 % gel ci-dessus d’empilage. ATTENTION : SDS, l’acrylamide et TEMED sont toxiques et nocives. Travailler sous une hotte et porter des équipements de protection individuelle.</li>
	<li>Transférer la voie gel équilibré sur le gel SDS et couvrir le gel d’agarose de 0,5 % (p/p) 1 x SDS tampon additionné d’une trace de bleu de bromophénol (Figure 5).</li>
	<li>Faire bouillir le SDS exécutant tampon avec agarose dans le four à micro-ondes avant chargement dans le gel.</li>
	<li>Pour faire fonctionner un marqueur protéique pour estimer le poids moléculaire des composants simples, insérez un morceau de papier filtre sur une extrémité du gel jusqu'à ce que l’agarose solidifié ou utilisez un peigne spécial, généralement utilisé pour les gels de l’IPG.</li>
	<li>Exécutez le gel à 150 V pour 60 min et tache le gel colloïdal Coomassie, tache argentée ou toute autre coloration méthode d’analyse par spectrométrie de masse ultérieure.</li>
	<li>Analyser les taches de protéines visibles en utilisant des approches par spectrométrie de masse comme du désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) temps de vol ou de CL-SM/SM spectrométrie de masse. Remarque : Nous recommandons d’utiliser le bleu de Coomassie colloïdal coloration comme déjà décrit33. Dans nos mains, encore moins abondantes protéines peut être suffisamment coloré et permet une analyse par spectrométrie de masse avec la qualité des données raisonnables.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le phloème est un compartiment d’un grand intérêt, car elle constitue l’itinéraire de transport important pour photoassimilates et est également essentiel pour la signalisation sur de longues distances entre plantes différentes pièces9,20,34, 35. En plus de petites molécules, macromolécules comme les protéines et les ARN ont été impliqués avec entretien de phloème et signalisation4,7,8. L’analyse de la composition de phloème est limité par l’accessibilité limitée aux échantillons de phloème dans la plupart des espèces végétales. La technique de l’insecte stylet est largement applicable, mais expérimentalement exigeants et se traduit par très petites quantités d' échantillons de phloème11. Une technique simple, utilisée pour l’échantillonnage de phloème est facilitée par EDTA exsudation12. EDTA chélates ions divalents comme le Calcium et empêche ainsi la fermeture des plaques criblées de P-protéines et callose. Il est facile à utiliser, mais est sujette à la contamination par les cellules endommagées et les échantillons sont dilués. Appauvrissant la couche d’ions divalents par l’EDTA pourrait également conduire à un effondrement des complexes existants. Cependant, il permet un échantillonnage d’un large éventail d’espèces dont la plante modèle Arabidopsis15. Exsudation spontanée de sève se produit uniquement dans un petit nombre d’espèces végétales. C’est une méthode invasive qui implique de lésion significative d’usine tissus10. Nous avons récemment mis en place b. napus comme espèce modèle pour l’étude des transports longue distance4,8,20. Ici, sève peut être dégusté de petites incisions, qui réduit les blessures des effets et des sources de contamination.
À l’aide de différentes techniques d’échantillonnage, le protéome d’échantillons de phloème de différentes espèces de plantes a été étudié au cours des dernières années7,8,17,36,37, 38,,39. Pour ces études de protéome, les protéines ont été extraites et précipités dans des conditions dénaturantes et par conséquent ne permettent pas de conclusions au sujet de protéines : protéines et protéines : interactions acides nucléiques présentent sous conditions natives. Co-immunoprécipitation (Pico) et essais de superposition a indiqué qu’un complexe ribonucléoprotéique majeur pouvant exister dans la sève de citrouille40, mais il n’était pas démontré que les complexes macromoléculaires présents dans des conditions natives dans le système de phloème.
Bleue PAGE native, présentée par Schägger et al. 26, en combinaison avec les étapes de l’électrophorèse sur gel haute résolution ultérieure permettent la séparation des différents composants de complexes protéiques importantes. En utilisant des analyses 3D-PAGE du natif de b. napus exsudat de phloème, nous pourrions récemment montrent que plusieurs high-molecular-weight protéine : protéine et complexes de RNP existent dans des échantillons de phloème et sont enzymatiquement actif4. Autres méthodes pour isoler les complexes protéiques ainsi que RNP comme chromatographie d’exclusion peut-être exister, mais en termes de résolution par rapport à BN-PAGE en cas d’échec. En outre, pour une qualité raisonnable de séparation complexe, matrices de taille exclusion colonne doivent être adaptées selon les poids moléculaires complexes dans l’ensemble à l’étude. Analyse des complexes de taille différente exigeront donc différents types de colonnes qui est intensif et ne permet pas comme haute puissance mise au point comme un BN-PAGE.
Les étapes essentielles pour analyser des complexes de b. napus comprennent le montant total de sève utilisée comme matériau de départ. Au moins 600 µL de l’échantillon du phloème sont nécessaires et peuvent être obtenus auprès de cinq plantes bien arrosées. 3D-PAGE et BN northern Blot, il est nécessaire de commencer le gel BN initial avec une quantité suffisante d’échantillons de phloème. Pour y parvenir, des échantillons de phloème sont concentrés jusqu'à 20 à 30 µg de protéines peuvent être chargés dans chaque bien et au moins réanalysés du même échantillon sont exécutés en parallèle. Des concentrations trop faibles ou trop élevées réduisent la détection des complexes (Figure 3). Phloème échantillons doivent être prélevés dans des tubes de réaction sur la glace et doivent être conservés congelés pour une utilisation ultérieure éviter le chiffre d’affaires et de la dégradation des protéines. Inhibiteurs de protéase ont été trouvés dans toutes les protéomes phloème analysés, mais aussi un protéasome pleinement actif a été décrite dans le phloème de b. napus4. En outre, volume et la composition des échantillons de phloème dépendent du temps-point de prélèvement et conditions environnementales10. C’est pourquoi il faut recueillir à la fois de la journée dans des conditions similaires. Traitements de stress (sécheresse,par exemple ) peuvent réduire la quantité de phloème qui peut être collecté. Pour identifier les protéines simples par spectrométrie de masse, il est obligatoire pour limiter les contaminations de kératine possible de porter des gants tout le temps. Kératine conduit à signaux supplémentaires lors de l’analyse de masse spec et entrave l’identification des protéines. Tourne le BN-PAGE à une tension plus élevée ou à température ambiante peut conduire au chauffage du gel pouvant survenir dans le démontage des complexes fragiles.
Le protocole présenté ici est destiné à l’analyse des complexes de protéine : protéine. Nous montrons aussi qu’il peut être utilisé pour détecter l’ARN spécifiques contenues dans les complexes en parallèle. Pour ce faire, nous avons récemment introduit un protocole pour BN northern Blot4. RNAs sont sujettes à la dégradation par des contaminations de RNAse. Afin de limiter cette dégradation DEPC-traitée, l’eau doit être utilisé.
Principales limites de la méthode présentée comprennent l’estimation du poids moléculaire de complexes protéiques séparées de BN-PAGE, étant donné que le comportement de migration dépend de la taille, la forme et même des modifications post-traductionnelles des complexes31, 41. Estimation de la taille des complexes de RNP est encore plus compliquée en raison de l’influence des acides nucléiques sur le comportement de migration. Elle peut également pas être prévenue que complexes de même taille migrent conjointement dans une seule bande. Cela peut conduire à la prévision erronée des compositions complexes. Donc vérifier les interactions observées avec des techniques complémentaires, par exemple par des essais fonctionnels4, peut être nécessaire. Également les protéines seulement faiblement ou transitoirement associées à un complexe macromoléculaire pourraient être perdus dans le tampon BN utilisé. Pour éviter cela, les échantillons pourraient être réticulé, ce qui peut aussi conduire à des artefacts ou empêchent l’identification des protéines, ou les conditions de la mémoire tampon peuvent être optimisées.
Contrairement aux pages 2D classique, la combinaison d’urée et SDS-PAGE permet la séparation selon l’hydrophobie et poids moléculaire au lieu de point isoélectrique (pI) et de poids moléculaire 28et ne limite pas la séparation de protéines d’un gamme spécifique pI. Semblable au classique 2D-PAGE, séparés des protéines sont visibles sous forme de taches simples, mais en diagonal de la ligne 4,28 (Figure 5, , Figure 6). Plus de protéines hydrophobes apparaissent dans des endroits au-dessus de cette diagonale, alors que plus hydrophiles protéines sont trouvent au-dessous de la ligne28. Les concentrations de polyacrylamide utilisées dans le présent protocole seront bien séparer des protéines entre 25 à 80 kDa. Pour permettre une séparation des protéines plus petites ou plus grandes le polyacrylamide concentration peut varier ou gels de gradients peuvent être utilisés dans la troisième dimension. Les composantes du complexe IV (Figure 3) séparés par 3D-PAGE (Figure 6) ont été supprimés, trypsine digéré et analysé par spectrométrie de masse. Cela a permis l’identification de plusieurs ligases ARNt. Les composants des autres complexes ont été publiés récemment 4. Notre PAGE 3D activé la séparation des différents ligases, nommément aspartate, asparagine, thréonine, lysine et glycine ligases, dont les poids moléculaires similaires (tableau 3). À l’aide d’une sonde d’ARNt spécifique de méthionine, nous étions capables de détecter des ARNt potentiellement lié au sein du complexe IV, mais si le tRNA pleine longueur ou des fragments de l’ARNt sont dans le complexe ne peuvent pas être distinguées avec les sondes utilisées. Pour vérifier si les acides nucléiques sont vraiment lié au sein du complexe et pas migrent, protéase digéré sève échantillons pourraient servir de contrôles migratoires approprié.
Il a été spéculé plus tôt que la traduction des protéines peut se produire dans les tubes criblés du phloème, étant donné que presque la plupart des composants de la ribosome ensemble, mais aussi les facteurs d’élongation ont été trouvés dans le phloème échantillons4,7. Notre découverte du Tarn et les ligases ARNt semble appuyer cette idée. Cependant, les fragments de tRNA présents dans des échantillons de phloème de citrouille ont démontré être puissants inhibiteurs de traduction42 et ribosomes fonctionnels semblent être absent4, ce qui suggère que la traduction ne peut avoir lieu.
Pris ensemble, le protocole présenté ici permet la séparation des protéines : la protéine native et même RNP complexes d’échantillons de phloème et la séparation et l’identification de leurs composants à haute résolution. L’application de cette méthode permet la découverte de la nouvelle protéine et complexes de RNP dans des échantillons de phloème et peut élucider par conséquent de nouvelles fonctions dans ce compartiment de plantes hautement spécialisés.

Les conduites sur de longues distances du phloème sont essentiels pour la répartition des nutriments organiques chez les plantes supérieures, mais sont également impliqués dans la régulation de nombreux processus différents importants pour la croissance et développement, défense de l’agent pathogène et l’adaptation aux effets indésirables conditions environnementales. Outre petits effecteurs tels que les ions, phytohormones ou métabolites eux-mêmes, les macromolécules comme les protéines et les ARN ont récemment émergé comme signaux potentiels.
Des études ont montré que le chargement de phloème des protéines est taille dépendant et contrôlé par la limite d’exclusion de taille (SEL) des unités pore-plasmodesmal reliant les cellules compagnes (CC) et filtrez les éléments (SE) qui sont typiquement de l’ordre de 10 à > 67 kDa1 , 2 , 3. Toutefois, malgré ces protéines plus grandes limites de taille et de protéines complexes ont été découverts dans le système de phloème contestant l’idée d' exclusion de taille4et perte même non spécifique des protéines du CC pour soi a été suggérée5 .
Des complexes ribonucléoprotéiques multiprotéiques ainsi que de grandes jouent un rôle essentiel dans la biosynthèse et le maintien de l’intégrité structurale de la cellule6. On constate qu’il existe des complexes protéine-protéine et ribonucléoprotéique phloème-mobile4,7, mais à ce jour, on sait peu sur leur fonction. En éléments criblés du phloème RNP complexes et protéines : les protéines ont été impliqués avec transport à longue distance et / ou signalisation8,9. Pour démêler les fonctions des translocations complexes, étudier leur composition sous des variables environnementale ou des conditions de stress est nécessaires. Pour y parvenir, natives complexes doivent être isolés et leurs composants doivent être séparés avec une résolution suffisante.
Pour isoler des complexes de poids moléculaire élevé de phloème, il faut d’abord obtenir des échantillons de sève en qualité et en quantité suffisante. La technique qui peut être utilisée pour l’échantillonnage de phloème dépend de l’espèce végétale d’intérêt. Trois méthodes principales pour obtenir la sève existent 10: insectes stylectomie11, facilitées par EDTA exsudation12et exsudation spontanée13.
Échantillons de phloème d' Arabidopsis thaliana (a. thaliana), l’usine modèle majeur dans les laboratoires du monde entier, ne peuvent être obtenues que par l’EDTA-facilité exsudation ou puceron stylectomie14,15. Les deux méthodes conduisent à sève hautement diluées ou montants d’échantillon très faible. Exsudation facilitées par EDTA est également sujette à la contamination et ne peut pas représenter le phloème véritable composition16. Exsudation spontanée de phloème se limite à planter des espèces comme les cucurbitacées, lupin ou yucca, où couper les parties de la plante entraîne une émission spontanée de sève qui peut être facilement collectées13,17,18, 19. Nous avons récemment mis en place les colzas (Brassica napus) comme un système de modèle approprié pour l’analyse de phloème, puisque c’est un proche parent du thaliana et plusieurs microlitres de sève peuvent être obtenus auprès de petites incisions qui s’est avéré être de grande pureté4,8,20. En outre, la séquence du génome de b. napus sortit en 201421.
À l’exception des pucerons stylectomie, toutes les méthodes de collecte de phloème décrites comprennent endommager des tissus sur le site d’échantillonnage environnants, et la composition de la sève peut changer en réponse à une lésion. Il est donc indispensable de vérifier la qualité des échantillons de phloème, quelle que soit la méthode d’échantillonnage appliquée. Il existe différentes méthodes pour le contrôle de la qualité de sève recueillies, par exemple par détermination de la RNase activité22,23, RT-PCR avec des amorces contre Rubisco8,24ou l’analyse du sucre composition8.
Différentes méthodes pour isoler et séparer des complexes protéiques peuvent être appliquées, y compris chromatographie d’exclusion, ultracentrifugation de densité de saccharose ou échantillon filtration à travers des membranes avec des poids moléculaires distinctes coupe offs. Cependant, ces approches ne permettent pas de haute résolution. La technique appelée bleue PAGE native (BN-PAGE), d’abord décrit par Schägger et al. 25, est supérieure en termes de résolution. Il a été utilisé avec succès pour déterminer le poids moléculaire de complexes de grosse protéine native de divers organites ou de lysats cellulaires et leur abondance relative26,27.
Pour plus amples élucider la composition complexe de complexes protéiques, il est nécessaire de séparer les différents composants dans des conditions, conduisant à un démontage complet des composants complexes dénaturantes. Ceci peut être réalisé par une deuxième dimension du SDS-PAGE 28,29 , ou, pour obtenir une résolution plus élevée, par une deuxième dimension de l’isoélectrofocalisation (IEF) suivie d’une third dimension de SDS-PAGE30 et l’identification ultérieure des les protéines par spectrométrie de masse.
Dans ce protocole, nous décrivons le prélèvement de sève pure de b. napus plantes et l’analyse des protéines complexes de ces échantillons de phloème en utilisant une approche électrophorétique 3D combinant BN-PAGE avec Tris-Tricine-urée-PAGE et SDS-PAGE. Les protéines séparées des composants complexes sont par la suite identifiés par spectrométrie de masse. En outre, nous introduisons bleu natif northern Blot comme une méthode permettant la détection d’ARN en grandes RNP complexes4, étendre l’applicabilité de l’approche.

<table><tbody><tr><td>Tubes de réaction de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>peigne à 10 puits pour SDS PAGE, épaisseur 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37,5:1) solution</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96 % Éthanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’aluminium (14-18)-hydraté</td><td>AppliChem</td> 141101 Peroxodisulfate <td>d’ammonium</td><td></td></tr><tr><td>(APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateurs centrifuges p.ex. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Kit de module de détection d’acide nucléique chimiluminescent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Papiers de chromatographie par ex. 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Abdominaux à l’éthanol.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel p.ex. Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation p.ex. Incubateur d’hybridation GFL 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille hypodermique (0,8 mm)</td>B <td>Peigne</td> gel 4658309 <td></td>IPG <td>de Braun</td></tr><tr><td>, épaisseur 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Marquage de l’ARN par ex. Biotine 3Kit d’étiquetage de l’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Gel dégradé natif par exemple Novex NativePAGE 4&ndash ; 16 % Bis-Tris protein gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrane en nylon p.ex. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Acide orthophosphorique</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler échelle de protéines pré-colorées</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation pour électrophorèse sur gel EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>disponible à partir de GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi-sec Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Synthèse de l’ADNc p. ex. RevertAid First Strand Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tris AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Citrate tri-sodique dihydraté</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Tampon d’hybridation ultrasensible</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Uréa</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Réticulant UV par exemple Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>de Fisher Scientific</td>Appareil d’électrophorèse</tr><tr><td>vertical par exemple Le système XCell SureLock Mini-Cell ou Mini-Protean III</td><td>Thermo Fisher Scientific ou BioRad</td><td>EI0001 ou 1658004</td><td></td></tr><tr><td>essuie-glaces par exemple KIMWIPES Delicate Essuie-glaces</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

Échantillonnage de sap de phloème de brassica napus pour 3d-page des protéines et des complexes ribonucléoprotéiques

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Prélèvement, le phloème des plantes supérieures est souvent laborieux et significativement dépend de l’espèce végétale. Toutefois, des études dans des conditions dénaturantes proteome pourraient être atteint dans différentes espèces de plantes. Protéine : protéine et protéine : complexes d’acides nucléiques provenant d’échantillons de phloème ont encore guère été analysées, même si elles pourraient jouent un rôle important dans le maintien de ce compartiment spécialisé ou dans la signalisation sur de longues distances. Grands assemblages moléculaires peuvent être isolés d’une électrophorèse sur gel natif bleu (BN-PAGE). Leurs constituants protéiques peuvent être séparées par un dodécylsulfate de sodium ultérieur PAGE (SDS-PAGE). Toutefois, les protéines avec des poids moléculaires similaires co migrent, ce qui peut gêner l’identification des protéines par spectrométrie de masse. Combinant BN-PAGE avec deux différents dénaturation gel électrophorèse étapes, à savoir Tris-Tricine-urée et SDS-PAGE, permet la séparation supplémentaire de protéines selon leur hydrophilicité/hydrophobie et augmente ainsi la résolution et le succès d’identification des protéines. Il permet même de distinguer les protéines qui diffèrent seulement par leurs modifications post-traductionnelles. En outre, bleu natif northern blot peut être appliqué pour identifier les composants de RNA de complexes macromoléculaires. Nous montrons que notre protocole est adapté pour démêler les protéines et les composants de RNA de protéine : protéine native et complexes ribonucléoprotéiques (RNP) survenant dans les échantillons de phloème. Combinant un bleu PAGE native avec deux différentes étapes dénaturation de PAGE peut aider à séparer les différents types de complexes protéiques grand et permet également un taux accru d’identification de leurs composants par spectrométrie de masse. En outre, le protocole est assez robuste pour détecter simultanément des acides nucléiques potentiellement liés au sein de complexes protéiques unique.

Nous présentons un protocole afin d’analyser la composition en protéines de grande protéine : protéine native et de protéines : acides nucléiques complexes de colza (b. napus) exsudat de phloème en utilisant une approche d’électrophorèse (PAGE) 3D gel de polyacrylamide combinant bleu natif (BN) avec deux PAGEs de dénaturation suivie d’identification par spectrométrie de masse.

Échantillonnage de Sap de phloème de Brassica napus pour 3D-PAGE des protéines et des Complexes ribonucléoprotéiques

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

L’objectif global de cette procédure 3D-PAGE est de séparer les complexes protéiques et ribonucléoprotéiques de la sève de Brassica napus ploem, couplé à l’identification des composants respectifs des acides nucléiques et des protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biochimie et en physiologie végétale. Par exemple, vous pouvez analyser la composition des complexes de phloème sous stress.Le principal avantage de la technique est que la sève pure du phloème peut être collectée et que les acides nucléiques, ainsi que les composants protéiques, peuvent être analysés simultanément. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre les protéines et les acides nucléiques des protéines dans le système phloème du colza, elle peut également être appliquée à l’analyse du phloème d’autres plantes comme les cucurbitacées, les lupins et le yucca. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé d’identifier des partenaires d’interaction entre les protéines et les ARN pour une protéine spécifique du phloème.Tout d’abord, perforez plusieurs fois la tige inflorescente d’une plante B.napus de huit semaines à l’aide d’une aiguille hypodermique de 0,8 millimètre. Percez plusieurs autres tiges inflorescentes sur la même plante et d’autres plantes pour obtenir suffisamment de sève de phloème. Essuyez la première goutte de chaque site blessé avec du papier filtre.Après avoir retiré les premières gouttes, utilisez une pipette pour recueillir les gouttes restantes. Et transférez-les dans un tube de réaction conique pré-refroidi de 1,5 millilitre. Stockez ensuite l’exsudat collecté à moins 20 degrés Celsius à l’aide d’un système de refroidissement sans glace.Continuez à recueillir les gouttes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de formation de gouttes, mais pas plus d’une heure. Ensuite, ajoutez l’échantillon de phloème dans un concentrateur centrifuge avec une réduction de poids moléculaire de 10 000 daltons, et concentrez-vous à environ 1/6 du volume initial. Ensuite, centrifugez l’échantillon concentré à quatre degrés Celsius et 20 000 g pendant au moins 15 minutes pour éliminer les particules de poussière.Pour effectuer une PAGE native bleue, assemblez la chambre de gel. Et ajoutez le tampon cathodique B bleu foncé à la moitié, et lavez les puits avec le tampon cathodique. Chargez 20 à 30 microgrammes de l’échantillon de protéines concentrées par puits sur un gel radiant Bis-Tris commercial en au moins trois exemplaires.Remplissez la chambre avec la cathode et le tampon d’anode, et faites fonctionner le gel à quatre degrés Celsius et 150 volts jusqu’à ce que l’échantillon dépasse 1/3 du gel, ce qui prend 20 à 30 minutes. Mettez en pause l’exécution d’un tampon cathodique bleu foncé B d’échange avec un tampon cathodique bleu clair B 1/10. Redémarrez la course et continuez jusqu’à ce que le front bleu commence à s’échapper du gel, ce qui prend 120 à 180 minutes.Découpez une bande de gel entière dans le gel bleu natif, puis transférez-le sur une membrane en nylon par tamponnage semi-sec, et marquez les bordures de gel supérieure et inférieure sur la membrane avec un crayon. Après l’épongement, lavez la membrane avec de l’eau traitée au DEPC et placez-la entre deux morceaux de papier filtre pour la faire sécher. Ensuite, effectuez une réticulation UV de la membrane blotted avec une énergie appliquée de 120 000 microjoules par centimètre carré.Maintenant, pré-hybridez la membrane réticulée UV avec six millilitres de tampon d’hybridation pendant 60 minutes à 68 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Ajoutez un millilitre supplémentaire de tampon d’hybridation contenant quatre microlitres de sondes biotinylées à 3 premiers objectifs à la membrane. Ensuite, incubez la membrane avec la sonde pendant la nuit tout en refroidissant le four d’hybridation de 68 à 37 degrés Celsius.Le lendemain, lavez la membrane avec un tampon contenant 2x SSC et 0,1 % SDS pendant cinq minutes à température ambiante pour retirer les sondes liées de manière non spécifique. Effectuer la détection des sondes biotinylées à 3 amorces sur la membrane avec un conjugué HRP de streptavidine et du luminol comme substrat de peroxydase de raifort, entraînant une réaction chimiluminescente sensible. Exciser les bandes simples du gel natif bleu.Combinez des bandes d’échantillons analysées en voies parallèles dans un tube réactionnel conique de 1,5 millilitre pour obtenir une concentration supplémentaire de protéines complexes. Pour préparer un gel d’urée Tris-Tricine à 12 %, versez 10 millilitres de solution de gel A entre deux plaques de verre et recouvrez d’isopropanol. Après la polymérisation, retirez l’isopropanol, ajoutez deux à trois millilitres de solution de gel B au gel et insérez un peigne à 10 puits.Pour l’équilibrage des morceaux de gel excisés, ajoutez un millilitre de tampon d’échantillon 2x SDS dans le tube de réaction. Après avoir incubé l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante, chauffez-le dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant environ une minute. Ensuite, incubez l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes.Ensuite, empilez plusieurs morceaux de gel équilibrés représentant le même complexe dans une seule poche de gel. Après avoir assemblé la chambre de gel, effectuez l’électrophorèse à l’aide de tampons d’anode et de cathode à 150 volts pendant 45 à 60 minutes. Lorsque vous avez terminé, excisez toute la bande de gel.Incuber la voie de gel coupée pendant 20 minutes dans un tampon acide. Ensuite, équilibrez dans 125 millimolaires de Tris-HCL à pH 6,8 pendant encore 20 minutes. Verser une solution de gel séparateur à 15 % SDS selon lanely.Une fois que le gel se solidifie, retirez l’isopropanol, ajoutez trois millilitres d’une solution de gel à empiler à 4 % et insérez le peigne spécial pour gels IPG. Après solidification, transférez la voie de gel d’équilibre sur le gel SDS et recouvrez le gel de 0,5 % d’agarose dans 1 tampon courant SDS complété par une trace de bleu de bromophénol. Après avoir assemblé la chambre de gel, faites fonctionner le gel à 150 volts pendant 60 minutes.Une fois terminé, colorez le gel avec une solution colloïdale de Kumasi pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Enfin, analysez les taches protéiques visibles à l’aide de la spectrométrie de temps de vol par désorption ionisation laser assistée par matrice. Un résultat représentatif obtenu à partir d’un échantillon de phloème pur est représenté ici.Les échantillons de phloème non contaminés montrent une bande visible pour l’âge de la thiorédoxine, alors qu’aucun signal pour RuBisCO et la protéine d’enveloppe pollinique n’est observé. Au moins quatre grandes bandes de complexes protéiques deviennent visibles après BN PAGE de la sève du phloème de B.napus. Des concentrations trop faibles ou trop élevées de sève de phloème ne permettent pas une séparation claire des complexes.Une séparation à haute résolution est observée dans 3D PAGE en raison des différents comportements de migration des protéines dans les gels d’urée et SDS-PAGE. En règle générale, les protéines appartenant à un seul complexe seront visibles sous la forme d’une ligne diagonale à travers le gel. Les protéines au-dessus de cette ligne ont une hydrophobicité accrue, tandis que les protéines en dessous de la ligne sont plus hydrophiles.Le transfert de Northern BN montre qu’un ARNt spécifique n’est présent que dans un complexe spécifique. L’analyse par spectrométrie de masse a montré que ce complexe contient principalement des ARNt ligases qui confirment l’activité de liaison à l’ARNt retrouvée par le transfert nord BN. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée.Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de porter des gants et une blouse de laboratoire pour minimiser la contamination par le carotène qui entravera l’analyse par spectrométrie de masse. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que des zymogrammes et des dosages enzymatiques avec la sève de phloème collectée peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme des études complexes d’activité et d’inhibition. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la science végétale pour explorer des complexes multi-sous-unitaires dans des échantillons de phloème de différentes espèces végétales.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler la sève du phloème des plantes Brassica napus, et comment isoler et analyser les protéines et les complexes d’acides nucléiques protéiques. N’oubliez pas que travailler avec du SDS, de l’acrylamide et du TMET peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que travailler sous la cagoule avec des gants et une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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