Échantillonnage de Sap de phloème de Brassica napus pour 3D-PAGE des protéines et des Complexes ribonucléoprotéiques

L’objectif global de cette procédure 3D-PAGE est de séparer les complexes protéiques et ribonucléoprotéiques de la sève de Brassica napus ploem, couplé à l’identification des composants respectifs des acides nucléiques et des protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biochimie et en physiologie végétale. Par exemple, vous pouvez analyser la composition des complexes de phloème sous stress.

Le principal avantage de la technique est que la sève pure du phloème peut être collectée et que les acides nucléiques, ainsi que les composants protéiques, peuvent être analysés simultanément. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les interactions entre les protéines et les acides nucléiques des protéines dans le système phloème du colza, elle peut également être appliquée à l’analyse du phloème d’autres plantes comme les cucurbitacées, les lupins et le yucca. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé d’identifier des partenaires d’interaction entre les protéines et les ARN pour une protéine spécifique du phloème.

Tout d’abord, perforez plusieurs fois la tige inflorescente d’une plante B.napus de huit semaines à l’aide d’une aiguille hypodermique de 0,8 millimètre. Percez plusieurs autres tiges inflorescentes sur la même plante et d’autres plantes pour obtenir suffisamment de sève de phloème. Essuyez la première goutte de chaque site blessé avec du papier filtre.

Après avoir retiré les premières gouttes, utilisez une pipette pour recueillir les gouttes restantes. Et transférez-les dans un tube de réaction conique pré-refroidi de 1,5 millilitre. Stockez ensuite l’exsudat collecté à moins 20 degrés Celsius à l’aide d’un système de refroidissement sans glace.

Continuez à recueillir les gouttes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de formation de gouttes, mais pas plus d’une heure. Ensuite, ajoutez l’échantillon de phloème dans un concentrateur centrifuge avec une réduction de poids moléculaire de 10 000 daltons, et concentrez-vous à environ 1/6 du volume initial. Ensuite, centrifugez l’échantillon concentré à quatre degrés Celsius et 20 000 g pendant au moins 15 minutes pour éliminer les particules de poussière.

Pour effectuer une PAGE native bleue, assemblez la chambre de gel. Et ajoutez le tampon cathodique B bleu foncé à la moitié, et lavez les puits avec le tampon cathodique. Chargez 20 à 30 microgrammes de l’échantillon de protéines concentrées par puits sur un gel radiant Bis-Tris commercial en au moins trois exemplaires.

Remplissez la chambre avec la cathode et le tampon d’anode, et faites fonctionner le gel à quatre degrés Celsius et 150 volts jusqu’à ce que l’échantillon dépasse 1/3 du gel, ce qui prend 20 à 30 minutes. Mettez en pause l’exécution d’un tampon cathodique bleu foncé B d’échange avec un tampon cathodique bleu clair B 1/10. Redémarrez la course et continuez jusqu’à ce que le front bleu commence à s’échapper du gel, ce qui prend 120 à 180 minutes.

Découpez une bande de gel entière dans le gel bleu natif, puis transférez-le sur une membrane en nylon par tamponnage semi-sec, et marquez les bordures de gel supérieure et inférieure sur la membrane avec un crayon. Après l’épongement, lavez la membrane avec de l’eau traitée au DEPC et placez-la entre deux morceaux de papier filtre pour la faire sécher. Ensuite, effectuez une réticulation UV de la membrane blotted avec une énergie appliquée de 120 000 microjoules par centimètre carré.

Maintenant, pré-hybridez la membrane réticulée UV avec six millilitres de tampon d’hybridation pendant 60 minutes à 68 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Ajoutez un millilitre supplémentaire de tampon d’hybridation contenant quatre microlitres de sondes biotinylées à 3 premiers objectifs à la membrane. Ensuite, incubez la membrane avec la sonde pendant la nuit tout en refroidissant le four d’hybridation de 68 à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, lavez la membrane avec un tampon contenant 2x SSC et 0,1 % SDS pendant cinq minutes à température ambiante pour retirer les sondes liées de manière non spécifique. Effectuer la détection des sondes biotinylées à 3 amorces sur la membrane avec un conjugué HRP de streptavidine et du luminol comme substrat de peroxydase de raifort, entraînant une réaction chimiluminescente sensible. Exciser les bandes simples du gel natif bleu.

Combinez des bandes d’échantillons analysées en voies parallèles dans un tube réactionnel conique de 1,5 millilitre pour obtenir une concentration supplémentaire de protéines complexes. Pour préparer un gel d’urée Tris-Tricine à 12 %, versez 10 millilitres de solution de gel A entre deux plaques de verre et recouvrez d’isopropanol. Après la polymérisation, retirez l’isopropanol, ajoutez deux à trois millilitres de solution de gel B au gel et insérez un peigne à 10 puits.

Pour l’équilibrage des morceaux de gel excisés, ajoutez un millilitre de tampon d’échantillon 2x SDS dans le tube de réaction. Après avoir incubé l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante, chauffez-le dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant environ une minute. Ensuite, incubez l’échantillon à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, empilez plusieurs morceaux de gel équilibrés représentant le même complexe dans une seule poche de gel. Après avoir assemblé la chambre de gel, effectuez l’électrophorèse à l’aide de tampons d’anode et de cathode à 150 volts pendant 45 à 60 minutes. Lorsque vous avez terminé, excisez toute la bande de gel.

Incuber la voie de gel coupée pendant 20 minutes dans un tampon acide. Ensuite, équilibrez dans 125 millimolaires de Tris-HCL à pH 6,8 pendant encore 20 minutes. Verser une solution de gel séparateur à 15 % SDS selon lanely.

Une fois que le gel se solidifie, retirez l’isopropanol, ajoutez trois millilitres d’une solution de gel à empiler à 4 % et insérez le peigne spécial pour gels IPG. Après solidification, transférez la voie de gel d’équilibre sur le gel SDS et recouvrez le gel de 0,5 % d’agarose dans 1 tampon courant SDS complété par une trace de bleu de bromophénol. Après avoir assemblé la chambre de gel, faites fonctionner le gel à 150 volts pendant 60 minutes.

Une fois terminé, colorez le gel avec une solution colloïdale de Kumasi pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Enfin, analysez les taches protéiques visibles à l’aide de la spectrométrie de temps de vol par désorption ionisation laser assistée par matrice. Un résultat représentatif obtenu à partir d’un échantillon de phloème pur est représenté ici.

Les échantillons de phloème non contaminés montrent une bande visible pour l’âge de la thiorédoxine, alors qu’aucun signal pour RuBisCO et la protéine d’enveloppe pollinique n’est observé. Au moins quatre grandes bandes de complexes protéiques deviennent visibles après BN PAGE de la sève du phloème de B.napus. Des concentrations trop faibles ou trop élevées de sève de phloème ne permettent pas une séparation claire des complexes.

Une séparation à haute résolution est observée dans 3D PAGE en raison des différents comportements de migration des protéines dans les gels d’urée et SDS-PAGE. En règle générale, les protéines appartenant à un seul complexe seront visibles sous la forme d’une ligne diagonale à travers le gel. Les protéines au-dessus de cette ligne ont une hydrophobicité accrue, tandis que les protéines en dessous de la ligne sont plus hydrophiles.

Le transfert de Northern BN montre qu’un ARNt spécifique n’est présent que dans un complexe spécifique. L’analyse par spectrométrie de masse a montré que ce complexe contient principalement des ARNt ligases qui confirment l’activité de liaison à l’ARNt retrouvée par le transfert nord BN. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de porter des gants et une blouse de laboratoire pour minimiser la contamination par le carotène qui entravera l’analyse par spectrométrie de masse. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que des zymogrammes et des dosages enzymatiques avec la sève de phloème collectée peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme des études complexes d’activité et d’inhibition. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la science végétale pour explorer des complexes multi-sous-unitaires dans des échantillons de phloème de différentes espèces végétales.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler la sève du phloème des plantes Brassica napus, et comment isoler et analyser les protéines et les complexes d’acides nucléiques protéiques. N’oubliez pas que travailler avec du SDS, de l’acrylamide et du TMET peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que travailler sous la cagoule avec des gants et une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.