Name: Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Apprenez à isoler des cellules dendritiques de l'appareil reproducteur féminin humain pour des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode préserve les marqueurs de surface et permet une caractérisation immédiate des cellules.

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AI102838 et AI117739 (CRW) bourses d’études appuyé par les NIH. Nous remercions Richard Rossoll d’assistance technique. Analyse en cytométrie en flux a été réalisée en DartLab, la ressource partagée au Dartmouthsupported de (P30CA023108-37) et (P30GM103415-15).

Études sur des sujets humains ont été menées selon les principes exprimés dans la déclaration d’Helsinki. Études ont été approuvées par le Comité pour la Protection des sujets humains (SSPC) et Dartmouth College Institutional Review Board. Consentement éclairé a été obtenu avant l’intervention de femmes séronégatives subissant des hystérectomies au Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). Pathologistes formés sélectionné des échantillons de tissus de l’EM, CX et ECX, exempte de lésions pathologiques et éloigné des sites de pathologie. Des échantillons de sang ont été prélevés de donneurs sains volontaires recrutés à Dartmouth Hitchcock Medical Center. Les donneurs de sang étaient anonymes. Des tissus EM, CX et ECX fraîchement isolées de la salle d’opération ont été transférés à la pathologie d’isolement et de classement préalable de transférer à notre laboratoire dans des tubes en polypropylène distincts, stériles.
1. enzymatique Digestion des tissus
Remarque : Utilisez le matériel stérile et travailler sous une hotte de sécurité biologique.
<ol><li>Préparer Balanced Salt Solution (HBSS de Hank a mis à jour le) avec 1 x HBSS rouge de phénol, 100 U/mL la pénicilline-streptomycine, 0,35 g/L NaHCO3et 20 mM HEPES.</li>
	<li>Préparer le cocktail enzymatique (modifié désoxyribonucléase 0,01 % [wt/vol] HBSS, 450 U/mL collagénase IV, I et 2 mg/mL D-glucose). Passer la solution à travers un filtre de 0,22 µm stérile. Idéalement, préparer l’enzyme de digestion sur la journée d’utilisation, mais il peut être congelé à-20 ° C pour le stockage. Éviter répétés de gel et de dégel des cycles.</li>
	<li>Rincer le tissu avec mis à jour le HBSS et placez-les dans un plat de Pétri 100 x 15 mm2 . Ajuster la taille de boîte de Pétri basée sur la quantité de tissu disponible et le volume de cocktail enzymatique utilisé (Voir l’étape 1.4.2 ci-dessous). Remarque : Les tissus varient en taille selon l’échantillon chirurgicaux issu de la pathologie, allant de 1 à 10 g.</li>
	<li>Traitement physique avec scalpel jetable et forceps :<ol>
<li>Ajouter environ 3 mL d’enzyme de digestion cocktail au tissu pour éviter le dessèchement pendant la coupe.</li>
		<li>Utiliser les pinces pour stabiliser le tissu et découper avec un scalpel pour augmenter la surface des tissus exposés à l’enzyme de digestion cocktail. Couper le tissu en petits morceaux (< 2 mm sur un côté). Ajouter suffisamment cocktail d’enzyme de digestion pour couvrir tous les morceaux de tissus (5 mL/g de tissu). Placez le couvercle sur la boîte de Pétri.</li>
		<li>Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 sur un rotateur à environ 80 tr/min pendant 45 min. veiller à ce que la vitesse de la coiffe mélange soigneusement le cocktail d’enzyme de digestion sans renverser ou produisant des bulles.</li>
		<li>Visualiser la préparation du tissu avec un microscope inversé léger avec le 4 X et 10 X objectifs. Remarque : Après digestion, petits fragments de tissus ou une suspension de cellules mixtes comprenant des glandes épithéliales visibles doivent être présents (voir la Figure 1 a).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. physique séparation des cellules individuelles
<ol><li>Dans un environnement stérile, placer une maille tendue 250 µm avec support dans un plat de Pétri de2 150 x 15 mm. Veiller à ce que le maillage est environ 0,5 cm au-dessus de la surface de la boîte de Pétri.</li>
	<li>Mouiller la maille avec 2 mL de HBSS mis à jour l’et transférer les tissus digérés sur le maillage.</li>
	<li>À l’aide de la surface plane d’un piston de la seringue de 10 mL, doucement mais fermement, moudre les tissus digérés hachées à travers les mailles. ATTENTION : Rectification trop agressivement endommagera le maillage et augmentent la mortalité cellulaire. Cette étape se séparera les cellules épithéliales et les cellules du stroma (y compris les cellules immunitaires) du tissu conjonctif et de mucus.</li>
	<li>Une fois que les fragments de tissus ont été soigneusement dispersés, élever le maillage et le porte-2-3 cm au-dessus de la boîte de Pétri et rincer avec 3 mL de modification HBSS pour récupérer des cellules supplémentaires.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire. Placez le maillage de 20 µm avec support dans une boîte de Pétri et mouillé avec 2 mL de HBSS modifiés. Versez la suspension cellulaire à travers les mailles tenant la maille 2-3 cm au-dessus de la boîte de Pétri et rinçage avec 6 mL de HBSS modifiés. Remarque : Cette étape va se séparer les feuilles épithéliales, qui sont conservés sur le dessus, à partir de cellules uniques qui passent à travers les mailles. Le cheminement est une suspension de cellules mixtes, qui comprend les cellules immunitaires et fibroblastes stromales.</li>
	<li>Recueillir la suspension cellulaire mixte et centrifuger à 500 x g pendant 10 min. aspirer le liquide et Resuspendre le culot dans 4 mL de HBSS modifiés pour la centrifugation en gradient de densité.</li>
	<li>Couche la suspension de cellules mixtes plus de 3 mL de solution de polysucrose et centrifuger à température ambiante à 500 x g pendant 30 min avec pas de frein. Recueillir la bande blanche du haut de la solution de polysucrose et laver avec du PBS. Remarque : Cette fraction est la suspension de cellules mixtes enrichi, qui est riche en cellules immunitaires et contient quelques fibroblastes stromales.</li>
</ol>3. mort cellulaire Removal
Remarque : Si un grand pourcentage de cellules mortes (> 20 %) est présent dans la suspension de cellules mixtes enrichi après centrifugation en gradient de densité, il est recommandée d’élimination des cellules mortes avec billes magnétiques. Les cellules mortes doivent être supprimés car ils peuvent interférer avec le processus de sélection des billes magnétiques positifs.
<ol><li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre sur un microscope optique avec l’objectif 10 X. Tournez en bas toutes les cellules de la suspension de cellules mixtes enrichi (500 x g, 10 min, 4 ° C). Totalement aspirer et éliminer le surnageant. Ajouter 100 µL de perles élimination des cellules mortes par 1 x 107 total des cellules (vivants ou morts), selon les instructions du fabricant. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.</li>
	<li>Placer un filtre de 30 µm sur la colonne magnétique, appliquez la suspension cellulaire et laissez les cellules marquées perle de tomber à travers la colonne magnétique.</li>
	<li>Rincer la colonne avec tampon élimination des cellules mortes comme recommandé (3 mL). Recueillir les intermédiaires contenant les cellules vivantes. La gamme de récupération de la cellule après l’élimination des cellules mortes, est présentée dans la Figure 1 b. Remarque : Ces cellules peuvent être utilisées pour effectuer la cytométrie en flux, la coloration des études phénotypiques (section 5) ou de continuer avec l’isolement de DC (section 4).</li>
</ol>4. DC Purification par sélection Positive billes magnétiques
<ol><li>Après élimination des cellules mortes (étape 3.2), faire tourner les cellules vers le bas, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 80 µL de tampon de sélection magnétique par 1 x 107 cellules (PBS, 0,5 % inactivés par la chaleur humaine sérum AB (HS), 2 mM EDTA).</li>
	<li>Pour la sélection positive des populations de DC, ajouter des billes magnétiques CD1a ou CD14 selon les instructions du fabricant (20 billes magnétiques µL par 1 x 107 cellules). Incuber pendant 15 min à 4° C.
</li>
	<li>Laver les cellules avec le tampon de sélection magnétique, tournez en bas et enlever le tampon complètement. Remettre en suspension les cellules dans un minimum de 500 µL de tampon de sélection magnétique.</li>
	<li>Fixer la colonne sur l’aimant et ajouter un filtre de 30 µm sur le dessus de la colonne de conserver tout amas de cellules restantes. Rincez le filtre et la colonne avec le tampon de sélection magnétique tel que recommandé.</li>
	<li>S’appliquent à la suspension de cellules de la colonne. Rincer 3 fois avec le tampon de sélection magnétique.</li>
	<li>Transférer la colonne dans un tube de 15 mL, ajouter 5 mL de tampon de sélection magnétique et d’appliquer le piston pour libérer les cellules sélectionnées dans la colonne.</li>
	<li>Pour augmenter la pureté, répétez les étapes 4,4 – 4,6 avec les cellules récupérées à l’aide d’une nouvelle colonne. La gamme de récupération cellulaire après sélection de billes magnétiques est présentée en Figure 1.</li>
</ol>5. évaluation de la pureté de la cellule : Flow Cytometry et microscopie
<ol><li>Anticorps de coloration pour la cytométrie en flux :<ol>
<li>Remettre jusqu'à 1 x 106 cellules dans 100 µL de PBS contenant 20 % inactivés par la chaleur HS à bloquer les récepteurs Fc et incuber pendant 10 minutes sur la glace.</li>
		<li>Ajouter le désiré fluorescent étiquetée anticorps et le réactif pour l’identification de cellules mortes (pour obtenir un exemple, voir la section 6.5). Définissez la fluorescence moins un (FMO) contrôles à mettre en place les portes et perles de compensation permet de préparer les contrôles tache unique d’indemnisation. Exemples d’anticorps utilisés sont donnés dans le tableau 1. Incuber pendant 20 min à 4 ° C, abri de la lumière.</li>
		<li>Laver les cellules avec 2 mL de tampon de sélection magnétique. Remarque : La présence d’EDTA est important pour éviter la formation de cellule s’agglutiner pour analyse en cytométrie en flux. Tournez en bas et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Fixer les cellules en ajoutant 100 µL de solution de paraformaldéhyde de 2 % par tube.</li>
		<li>Analyser les échantillons par un écoulement cytomètre10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spin de la colonne (par exemple, cytospin) et utiliser pour analyser la morphologie de coloration de Giemsa :<ol>
<li>Remettre en suspension les cellules dans 200 µL de tampon de sélection magnétique.</li>
		<li>Charger dans une colonne et un essorage pendant 5 min. Faites entrer le sécher complètement.</li>
		<li>Difficulté la diapositive par immersion dans du méthanol 100 % pendant 2 min. Rincer la lame avec de l’eau désionisée et laisser sécher à l’air.</li>
		<li>Effectuer une coloration standard de Wrights-Giemsa. Couvrir les cellules avec l’éosine et incuber pendant 10 min, rincer à l’eau désionisée et laissez-le sécher. Couvrir les cellules avec Wrights-Geimsa tache, incuber pendant 1 min, rincer à l’eau déminéralisée et sécher à l’air.</li>
		<li>Examiner les préparatifs avec un microscope inversé (Figure 2 a, objectif 40).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. allogéniques Stimulation Assay pour évaluer la fonction des cellules DC
<ol><li>Décongeler les cellules mononucléaires de sang périphérique congelé (PBMC)<ol>
<li>Réchauffer les milieux de culture cellulaire avec 10 % HS à 37 ° C.</li>
		<li>Décongeler les PBMC en plaçant le cryotube dans un bain d’eau de 37 ° C, jusqu'à ce qu’une petite quantité de milieux cellulaires congelés reste dans le cryotube. Dans un environnement stérile, transférer le contenu du cryotube à 10 mL de milieu de culture cellulaire pré chauffé avec 10 % HS dans un tube de 15mL.</li>
		<li>Centrifuger à ~ 500 g pendant 7 min. Retirez le support, disperse le culot, remettre en suspension les PBMC dans 10 mL de milieux de culture cellulaire avec 10 % HS et centrifuger les cellules.</li>
		<li>Répétez l’étape de lavage une troisième fois. Compter les cellules non vides.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélection de cellules T Naïve :<ol>
<li>Utilisez un kit de sélection une sélection négative anticorps MAGNETIQUE cellule pour isoler naïf lymphocytes T selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Après l’isolement, vérifier la pureté à l’aide d’anticorps CD45RA et CCR7. NOTE : Pureté typique est > 99 % naïf T-cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve lymphocytes prolifération coloration :<ol>
<li>Préparez 600 µL de solution de x 2 de colorant de prolifération cellulaire, protégeant le colorant à l’exposition à la lumière.</li>
		<li>Laver les naïfs de lymphocytes-T 2 x avec du PBS. Remettre en suspension les cellules dans 500 µL de PBS.</li>
		<li>Tout en douceur de Vortex les cellules dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, ajouter 500 µL de prolifération colorant pour les naïfs de lymphocytes T.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 10 min à 37° C.
</li>
		<li>Arrêter le marquage cellulaire en ajoutant 5 mL de milieux de culture cellulaire avec 10 % HS aux cellules. Incuber sur glace pendant 5 min, abri de la lumière.</li>
		<li>Centrifuger les cellules à ~ 500 g x 7 mn, aspirer les médias et remettre en suspension les cellules à 4 ° C, des milieux de culture cellulaire avec 10 % HS. Répétez deux fois plus pour un total de 3 lavages. Prélever une partie aliquote de cellules à compter avant la centrifugation dernier. NOTE : En général, naïve final nombre de T-cellules variera entre 5 % et 15 % du nombre initial d’éléments PBMC.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules avec les milieux de culture cellulaire avec 10 % HS à la concentration de la cellule souhaitée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC-allogénique naïf T-cell culture mixte :<ol>
<li>Plaque l’isolé DCs et naïf T-cellules dans une plaque 96 puits, fond rond, à un 01:15 rapport d’accident de décompression à lymphocytes T. S’assurer que le nombre optimal pour DCs varie entre 3 000 et 5 000 cellules par puits.</li>
		<li>Centrifuger la plaque à ~ 500 x g pendant 3 minutes pour s’assurer que les cellules sont trouvent au centre du puits. Contact cellule-cellule est important pour la signalisation appropriée de se produire.</li>
		<li>Incuber à 37 ° C pendant 6 jours. Surveiller l’amas de cellules qui apparaissent dans les puits comme la prolifération se produit, avec la microscopie (Figure 3 a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytométrie en flux coloration afin d’évaluer la prolifération :<ol>
<li>Après 6 jours, les cellules peuvent être examinés par cytométrie en flux. Détachant la co-culture de cytométrie en flux.</li>
		<li>Préparer une solution de 2 x de colorant jaune viabilité (émission maximale 572 nm) dans du PBS. Remarque : L’utilisation de PBS sans sérum est importante, comme sérum protéines interfèrent avec le colorant).</li>
		<li>Centrifuger la plaque avec les cellules à ~ 500 g pendant 5 min.</li>
		<li>Déposer 100 µL de liquide surnageant. Remarque : À ce stade recueillir et stocker le surnageant pour analyse séparée des facteurs solubles.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois avec du PBS : Ajouter 150 µL/puits de PBS, centrifuger à ~ 500 g pendant 5 min, retirer 150 µL de liquide surnageant avec une pipette. Veiller à ce qu’il y a 50 µL de liquide surnageant restant dans chaque puits.</li>
		<li>Ajouter 50 µL de colorant de viabilité 2 x dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min, abri de la lumière.</li>
		<li>Pendant l’incubation, préparer un mélange maître des marqueurs de l’anticorps désiré. Par exemple : CD3 APC/Cy7, PE de CD4, CD8 FITC, etc.
</li>
		<li>Ajouter le mélange d’anticorps à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min, abri de la lumière.</li>
		<li>Laver les cellules 2 x avec PBS + 2 % HS : Ajouter 150 µL/puits de PBS + 2 % HS. Centrifuger à ~ 500 g pendant 5 min. Retirer 150 µL de liquide surnageant avec une pipette.</li>
		<li>Fixer les cellules en ajoutant 100 µL/puits de 2 % de para-formaldéhyde. Si nécessaire : transférer les cellules et les médias aux tubes de cytométrie en flux en polypropylène. Tubes peuvent être conservés à 4 ° C et abri de la lumière, jusqu'à ce que la cytométrie.</li>
		<li>Lire les tubes dans un cytomètre en flux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

DCs muqueuses sont une population de cellules rares fortement influencée par l’environnement tissulaire, qui change leur phénotype et leurs fonctions une fois qu’ils pénètrent dans les tissus3. Bien que dérivé du sang DCs sont un modèle très utile, ils ne représentent pas complètement la diversité des populations de DC trouvé dans les tissus. Pour comprendre les caractéristiques uniques de muqueuses DCs, isolement de cellules primaires des tissus est donc nécessaire. Isolement des contrôleurs de d...

La DRF a la double fonction de protection contre les agents pathogènes tout en permettant l’implantation et la grossesse1. Pour ce faire, le TRAF est compartimenté, avec chaque région anatomique affiche des caractéristiques histologiques, immunologiques et fonctionnelle unique1.
DCs présents à surfaces muqueuses prendre contact avec les microbes dans les poumons, le tube digestif et l’appareil génital et assurer la surveillance immunitaire d’éventuels agents pathogènes2. Contrôleurs de domaine ont la capacité unique apprêter naïf T-cellules et de déclencher des réponses immunes adaptatives3. Contrôleurs de domaine dans le TRAF sont également spécialisés pour tolérer les antigènes étrangers, comme ceux que l'on trouve dans le sperme et le développement du fœtus, pour permettre une grossesse réussie4. Par conséquent, selon l’emplacement, le phénotype DC et la fonction seront dérouleront séparément. On sait que DCs sont fortement influencées par l’environnement tissulaire, telle que leur nombre, leur phénotype et fonctions sont modifiées par l’environnement tissulaire dans lequel ils résident3. Par conséquent, pour comprendre le rôle que jouent les FRT DCs en maladies infectieuses, la grossesse et le cancer dans le TRAF, DCs résidents doivent être étudiés, depuis le sang dérivées des modèles cc ne suffisent pas à résoudre les complexités réglementaires trouvées dans les tissus FRT.
La caractérisation des tissus humains DCs résidents est difficile en raison du faible nombre de cellules présentes dans les tissus muqueux et de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus humains. Contrôleurs de domaine ont été étudiés dans le TRAF utilisant immunohistochimie5,6, qui renseigne sur l’emplacement de cellules dans les tissus, mais s’oppose à des études fonctionnelles et est limité dans le numéro d’identification de marqueurs de cellules qui peuvent être analysés Tout de suite. Par ailleurs, des protocoles d’isolement cellulaire unique pour cytométrie ont été développés7,8,9. Certains de ces protocoles tirer parti de la capacité migratoire de DCs pour isoler ces cellules qui migrent. Ces méthodes généralement nécessitent des incubations durant la nuit et sélection de DCs activés, mais ne permettent pas pour l’étude des contrôleurs de domaine à l’état stationnaire.
Ici, à l’aide de spécimens de l’hystérectomie, nous avons optimisé un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de différents sites anatomiques de la FRT, l’endomètre (EM), l’endocol (CX) et l’exocol (ECX), qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. En utilisant un protocole non protéolytiques digestion enzymatique, nous pouvons procéder immédiatement après digestion de tissu à la caractérisation des cellule d’isolement et de flux par cytométrie en flux sans activation de la cellule. Cytométrie multicolore et en adaptant des études fonctionnelles pour les faibles nombres de cellules, nous pouvons identifier et caractériser les sous-ensembles rares de contrôleurs de domaine dans les différents sites de la FRT.

<table><tbody><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I</td><td>Worthington Biochimique</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm Stericup 500 mL&nbsp ; filtre</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm boîte de Pétri en polystyrène</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm 150mm x 15mm Boîte de Pétri en polystyrène</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm</td> Cor <td>430599</td><td>ning</td><td>Boîte de</td></tr> <tr>culture cellulaire traitée<td>Incubateur Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5,0 % CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um maille nylon</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um maille nylon</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Centrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 avec gentamicine L-Gln, Rouge de phénol, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Humain AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Kit d’élimination des cellules mortes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de pré-séparation (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur Quadro MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Socle multiple MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbilles, humaines</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbilles, humaines</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 colorant de prolifération cellulaire</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 plaque inférieure ronde bien ronde</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie jaune colorant de viabilité</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anti-humain</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-humain</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-humain</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Cytomètre en flux</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 couleur, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 couleurs, VBR</td></tr></tbody></table>

isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Il est difficile en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de la caractérisation des cellules dendritiques humaines (DCs) résidents dans les tissus muqueux, et le faible nombre de DCs présents par tissu. Pourtant, que le phénotype et la fonction des contrôleurs de domaine n’est modifiée par l’environnement tissulaire, il est nécessaire d’analyser les populations résidentes de DC tissu, puisque le sang provenant DCs incomplètement refléter les complexités des contrôleurs de domaine dans les tissus. Nous présentons ici un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de l’humain appareil reproducteur féminin (FRT) à l’aide de spécimens de l’hystérectomie qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Le protocole se compose de digestion de tissu pour générer une seule cellule mixé suspension cellulaire, suivie par la sélection des billes magnétiques positifs. Notre protocole de digestion du tissu ne pas se fendent de marqueurs de surface, ce qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle des contrôleurs de domaine dans l’état d’équilibre, sans une nuit d’incubation ou cellule d’activation. Ce protocole peut être adapté pour l’isolement des autres types de cellules immunitaires ou l’isolement des contrôleurs de domaine provenant d’autres tissus.

Digestion de tissus suivant, la sortie des feuilles épithéliales et des glandes peut être observée, comme illustré à la Figure 1 a; Il s’agit d’un contrôle positif qui indique la digestion enzymatique a été un succès. Le nombre de cellules viables totales et DCs récupérés par gramme de tissu est également indiqué dans la Figure 1 b et de la Figure 1, respectivement. Les cellules immunitaires représen...

Nous décrivons ici une méthode pour isoler et purifier les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques dans le tractus reproducteur femelle humain pour l’évaluation de leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut être adaptée pour isoler des autres cellules immunitaires ou autres tissus muqueux, les cellules dendritiques.

Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques de l’appareil reproducteur féminin humain afin d’évaluer leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les cellules dendritiques résidentes dans les tissus de l’appareil génital féminin, telles que la compartimentation anatomique de sous-ensembles spécifiques et leurs caractéristiques fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique est que notre protocole de digestion tissulaire ne clive pas les marqueurs de surface, ce qui permet d’isoler immédiatement les cellules dendritiques sans incubation pendant la nuit ni activation cellulaire.Bien que cette méthode ait été optimisée pour isoler les cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain, elle peut également être adaptée pour isoler d’autres cellules immunitaires ou cellules dendritiques d’autres tissus. Fiona Barr et Jared Fortier, techniciens de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez cette procédure en rinçant le tissu avec du HBSS modifié.Placez le mouchoir dans une boîte de Pétri de 100 x 15 millimètres carrés et ajoutez environ trois millilitres d’un cocktail d’enzymes de digestion pour éviter que le tissu ne se dessèche. Tout en utilisant une pince pour stabiliser le tissu, hachez-le avec un scalpel pour augmenter la surface du tissu exposé au cocktail d’enzymes de digestion. Coupez le tissu en petits morceaux.Ajoutez suffisamment de cocktail d’enzymes de digestion pour couvrir tous les morceaux de tissu et placez le couvercle sur la boîte de Pétri. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone sur un rotateur à environ 80 tr/min pendant 45 minutes. Assurez-vous que la vitesse du rotateur mélange bien le cocktail d’enzymes de digestion sans renverser ni produire de bulles.Après 45 minutes, visualisez la préparation des tissus avec un microscope à lumière inversée avec les objectifs 4X et 10X. Une digestion enzymatique réussie devrait libérer des feuillets épithéliales et des glandes, comme le montre cette image représentative. Effectuer la séparation de cellules individuelles dans un environnement stérile.Tout d’abord, placez une maille tendue de 250 micromètres avec support dans une boîte de Pétri de 150 x 15 millimètres carrés et assurez-vous que la maille est à environ 0,5 centimètre au-dessus de la surface de la boîte de Pétri. Ensuite, mouillez le treillis avec deux millilitres de HBSS modifié et transférez le tissu digéré sur le treillis. À l’aide de la surface plane d’un piston de seringue de 10 millilitres, broyez doucement mais fermement le tissu haché digéré à travers le filet.Une fois que les fragments de tissu ont été complètement dispersés, élevez le treillis et le support de deux à trois centimètres au-dessus de la boîte de Pétri, et rincez avec trois millilitres de HBSS modifié pour récupérer des cellules supplémentaires. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Placez un maillage de 20 micromètres avec un support à environ deux à trois centimètres au-dessus d’une nouvelle boîte de Pétri, et mouillez-le avec deux millilitres de HBSS modifié.Faites passer la suspension cellulaire à travers le maillage et rincez avec six millilitres de HBSS modifié. Prélever la suspension à cellules mixtes et centrifuger à 500 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le liquide et remettez le granulé en suspension dans quatre millilitres de HBSS modifié.Superposez la suspension à cellules mixtes sur trois millilitres de solution de polysaccharose pour la centrifugation par gradient de densité. Centrifugeuse à température ambiante à 500 fois g pendant 30 minutes sans frein. Prélevez la bande blanche sur le dessus de la solution de polysaccharose et lavez-la avec du PBS.Une fois la suspension de cellules mixtes enrichie recueillie, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre au microscope optique avec l’objectif 10X. Faites tourner toutes les cellules de la suspension cellulaire pendant 10 minutes. Aspirez complètement et jetez le surnageant.Ensuite, ajoutez des billes d’élimination des cellules mortes et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, placez un filtre de 30 micromètres sur le dessus de la colonne pour retenir les débris tissulaires ou les agrégats cellulaires restants. Rincez le filtre et la colonne avec un tampon d’élimination des cellules mortes.Ensuite, appliquez la suspension cellulaire et laissez les cellules marquées par des billes s’écouler à travers la colonne magnétique. Rincez la colonne avec trois millilitres de tampon d’élimination des cellules mortes quatre fois. Récupérez le flux contenant les cellules vivantes.Après l’élimination des cellules mortes, faites tourner les cellules vers le bas. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de sélection magnétique, 80 microlitres de tampon par un fois 10 aux sept cellules. Pour une sélection positive des populations de cellules dendritiques, ajoutez des billes magnétiques CD1a ou CD14 et incubez à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes.Lavez les cellules avec le tampon de sélection magnétique, faites-les tourner, retirez complètement le tampon et remettez les cellules en suspension dans un minimum de 500 microlitres de tampon de sélection magnétique. Fixez la colonne à l’aimant et ajoutez un filtre de 30 micromètres sur le dessus de la colonne pour retenir les débris tissulaires ou les agrégats cellulaires restants. Rincez le filtre et la colonne avec un tampon de sélection magnétique.Appliquez la suspension de cellule à la colonne. Rincez trois fois avec trois millilitres de tampon de sélection magnétique. Transférez la colonne dans un tube de 15 millilitres.Ajoutez cinq millilitres de tampon de sélection magnétique et appliquez le piston pour libérer les cellules sélectionnées de la colonne. Pour augmenter la pureté, répétez les étapes de purification avec les cellules récupérées à l’aide d’une nouvelle colonne. Par la suite, évaluer la pureté cellulaire par cytométrie en flux et microscopie, comme décrit dans le protocole textuel.Avant de commencer ce test, les lymphocytes T naïfs sont isolés des cellules mononucléées du sang périphérique à l’aide d’un kit disponible dans le commerce. Lavez les cellules T naïves deux fois avec du PBS. Remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS.Le reste du protocole est effectué dans l’obscurité. Tout en faisant doucement tourbillonner les cellules dans l’enceinte de biosécurité, ajoutez 500 microlitres d’une solution 2X de colorant de prolifération cellulaire aux cellules. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Arrêtez le marquage cellulaire en ajoutant aux cellules cinq millilitres de milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum AB humain. Incuber sur glace pendant cinq minutes, à l’abri de la lumière. Centrifugez les cellules à environ 500 fois g pendant sept minutes.Aspirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum AB humain. Avant la dernière centrifugation, prélever une aliquote de cellules pour les compter. Après le troisième lavage, remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture cellulaire avec 10 % de sérum AB humain à la concentration cellulaire souhaitée.Pour commencer la co-culture allogénique de cellules T naïves de cellules dendritiques, plaquez les cellules dendritiques isolées et les cellules T naïves dans une plaque à fond rond de 96 puits avec un rapport de 1 à 15 entre les cellules dendritiques et les cellules T. Centrifugez la plaque à environ 500 fois g pendant trois minutes pour vous assurer que les cellules sont situées au centre du puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant six jours.Surveiller les cellules par microscopie. Après six jours, évaluer la prolifération cellulaire par cytométrie en flux, comme décrit dans le protocole textuel. Ce graphique montre la plage du nombre total de cellules viables récupérées après le traitement des tissus et l’élimination des cellules mortes dans chaque compartiment de l’appareil reproducteur féminin, l’endomètre, l’endocol et l’ectocol.Le nombre de cellules dendritiques viables récupérées par gramme de tissu après isolement des billes magnétiques est indiqué ci-dessous. La morphologie dendritique des cellules isolées a été déterminée par microscopie après coloration à Giemsa. L’expression des marqueurs phénotypiques avant et après l’isolement des billes a été déterminée par cytométrie en flux.Après l’isolement des billes CD1a positives et CD14 positives, la pureté variait entre 85 et 92 %. La formation d’amas de cellules T au cours de la prolifération a été confirmée par coloration à la prolifération des colorants. La prolifération a ensuite été quantifiée par cytométrie en flux.La stratégie de déclenchement pour identifier différentes cellules dendritiques dans la suspension de cellules mixtes est illustrée. Chaque population fermée dans des graphiques multicolores est affichée dans le panneau suivant. À la suite de la stratégie de contrôle, des sous-ensembles spécifiques de cellules dendritiques sont identifiés.Un faible nombre de cellules est attendu, car les cellules dendritiques tissulaires sont des populations rares. Une fois maîtrisé, l’isolement des cellules dendritiques des tissus peut être effectué en quatre à cinq heures s’il est effectué correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de digérer et de traiter enzymatiquement les tissus pour générer une suspension de cellules mixtes unique et effectuer une sélection de billes magnétiques de cellules dendritiques pour une caractérisation plus approfondie.

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